Imágenes de una sola molécula de condensados EWS-FLI1 ensamblados en ADN

Resumen

Aquí, describimos el uso del método de imagen de molécula única, cortinas de ADN, para estudiar el mecanismo biofísico de los condensados EWS-FLI1 que se ensamblan en el ADN.

Resumen

Los genes de fusión resultantes de la translocación cromosómica se han encontrado en muchos tumores sólidos o leucemia. EWS-FLI1, que pertenece a la familia de oncoproteínas de fusión FUS/EWS/TAF15 (FET), es uno de los genes de fusión más frecuentemente involucrados en el sarcoma de Ewing. Estas proteínas de fusión de la familia FET típicamente albergan un dominio de baja complejidad (LCD) de proteína FET en su extremo N y un dominio de unión al ADN (DBD) en su extremo C. Se ha confirmado que EWS-FLI1 forma condensados biomoleculares en sus loci de unión objetivo debido a las interacciones LCD-LCD y LCD-DBD, y estos condensados pueden reclutar ARN polimerasa II para mejorar la transcripción génica. Sin embargo, no está claro cómo se ensamblan estos condensados en sus sitios de unión. Recientemente, se aplicó un método biofísico de una sola molécula, DNA Curtains, para visualizar estos procesos de ensamblaje de condensados EWS-FLI1. Aquí, se discuten el protocolo experimental detallado y los enfoques de análisis de datos para la aplicación de cortinas de ADN en el estudio de los condensados biomoleculares que se ensamblan en el ADN objetivo.

Introducción

La regulación transcripcional es un paso crucial para la expresión génica precisa en las células vivas. Muchos factores, como la modificación cromosómica, los factores de transcripción (TF) y los ARN no codificantes, participan en este complicado proceso ^1,2,3. Entre estos factores, los TF contribuyen a la especificidad de la regulación transcripcional al reconocer y unirse a secuencias específicas de ADN conocidas como promotores o potenciadores y posteriormente reclutar otras proteínas funcionales para activar o reprimir la transcripción 4,5,6,7.

Protocolo

1. Preparación de la mezcla maestra de bicapa lipídica

1. Enjuague los viales de vidrio con agua de doble destilación (_ddH2O) y etanol al 99% y séquelos en un horno de secado a 60 °C.
2. Hacer la mezcla maestra de lípidos disolviendo 1 g de 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC), 100 mg de lípidos reaccionados por polietilenglicol (PEGilated) (18:1 de 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxi (polyethylene glycol)-2000] (sal de amonio) (PEG2000 DOPE) y 25 mg de lípidos biotinilados (18:1 de 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(cap biotinyl) (sal de sodio) (Biotinyl Cap DOPE)) en 10 mL de cloroformo.

Resultados

El esquema de las cortinas de ADN se muestra en la Figura 1A, Figura 1B y Figura 1D. La secuencia diana clonada que contiene 25 repeticiones ininterrumpidas de GGAA se encuentra en el promotor NORB1 en el sarcoma de Ewing. Esta secuencia objetivo es crucial para el reclutamiento de EWS-FLI1²⁸. Las moléculas EWS-FLI1 se visualizaron detectando las señales EWS-FLI1 marcadas con mCherry obtenidas con .......

Discusión

Como los enfoques de una sola molécula son extremadamente sensibles al contenido del sistema de reacción, se debe invertir un esfuerzo adicional para garantizar la buena calidad de todos los materiales y soluciones durante los experimentos de cortinas de ADN, especialmente los lípidos preparados en las secciones 1 y 2 y los tampones utilizados en la sección 5. Se deben usar reactivos de mayor pureza para preparar tampones, y los tampones deben estar recién preparados para el ensayo de molécula única.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
488 nm diodepumped solid-state laser	Coherent	OBIS488LS
561 nm diodepumped solid-state laser	Coherent	OBIS561LS
Agar	Rhawn	R003215-50g
biotinylated DOPE	Avanti	870273P
Bovine Serum Albumin	Sigma	A7030
Chloroform	Amresco	1595C027
Coating Electra 92	Allresist GmbH	AR-PC 5090.02	The conductive protective coating
Deoxyribonuclease I bovine	Sigma	D5139-2MG
DOPC	Avanti	850375P
DTT	Sigma	D9779
Glass coverslip	Fisher Scientific	12-544-7
Hellmanex III	Sigma	Z805939-1EA
KCl	Sigma	60130
Lambda DNA	NEB	N3013S
Lambda Packing Extracts	Epicentre	MP5120
MgCl2	Sigma	M2670
NaCl	Sigma	s3014
Nanoport	Idex	N-333-01
NheI-HF	NEB	R3131S
Nikon Inverted Microscope	Nikon	Eclipse Ti
NZCYM Broth	Sigma	N3643-250G
PEG-2000 DOPE	Avanti	880130P-1G
PEG-8000	Amresco	25322-68-3
PMMA 200K, ETHYL LACTATE 4%	Allresist GmbH	AR-P 649.04
PMMA 950K, ANISOLE 2%	Allresist GmbH	AR-P 672.02
Prime 95B Scientific CMOS camera	PHOTOMETRICS	Prime95B
proteinase K	NEB	P8107S
Silica glass slide	G.Finkenbeiner
Six-way injection valve	Idex	MXP9900-000
Streptavidin	Thermo	S888	Diluted with ddH2O
Syringe pump	Harvard Apparatus	Pump11 Elite
T4 DNA Ligase	NEB	M0202S
Tris base	Sigma	T6066
XhoI	NEB	R0146V
YOYO-1 Iodide (491/509)	Invitrogen	Y3601	Diluted with DMSO