Registro de la presión intracavernosa en un modelo de rata con lesión nerviosa cavernosa

Resumen

Este protocolo describe el desarrollo de un modelo de prostatectomía radical en ratas con lesión del nervio cavernoso bilateral estable asociado con disfunción eréctil y medición de la presión intracavernosa.

Resumen

El modelo de lesión bilateral del nervio cavernoso (CN) en ratas se ha utilizado ampliamente para simular la lesión clínica del nervio cavernoso asociada con la disfunción eréctil (DE) para evaluar el efecto de los métodos terapéuticos clínicos. Sin embargo, los métodos de construcción del modelo de lesión CN son defectuosos y variados en el campo de investigación de la disfunción eréctil. El método más utilizado en los últimos años es el de la lesión por aplastamiento CN. Este estudio tiene como objetivo proporcionar una descripción detallada del procedimiento de construcción del modelo de rata con lesión CN bilateral y la medición del registro de la presión intracavernosa (ICP), proporcionando un modelo de rata con lesión CN confiable y reproducible. En este trabajo se desarrolló con éxito el método de lesión por aplastamiento del hemostático, utilizando una aguja de jeringa como soporte duro y un hemostático con un manguito de goma. Además, este método concluye que un voltaje de 1,0 V, una frecuencia de 20 Hz y un ancho de pulso de 5 ms son los parámetros de estimulación optimizados para el registro de ICP en un modelo de rata con lesión CN bilateral.

Introducción

La disfunción eréctil es una de las enfermedades comunes en los hombres adultos. Se estima que el número de pacientes con TCA en el mundo alcanzará los 322 millones en 2025¹. Una amplia encuesta multicéntrica realizada en China muestra que la proporción de disfunción eréctil causada por cirugía pélvica o traumatismo es de aproximadamente el 8%². A pesar de la mejora continua de las técnicas quirúrgicas y del instrumental quirúrgico, la incidencia de disfunción eréctil sigue siendo alta. Se ha considerado que el desarrollo y la progresión de la disfunción eréctil después de la prostatectomía radical (PR) con preservación del nervio contribuye a la lesión del nervio cavernoso, lo que resulta en atrofia del músculo liso del cuerpo cavernoso, apoptosis de las células endoteliales y remodelación patológica ^3,4.

Para estudiar el mecanismo de los cambios hemodinámicos e histopatológicos de la lesión por CN asociada con la disfunción eréctil, se han desarrollado y evaluado varios tipos diferentes de modelos animales de lesión por CN, incluidos roedores, perros, gatos y monos ^5,6,7. Basándose en las ventajas en el gasto y la reproducibilidad, el modelo de rata con lesión bilateral del CN se ha convertido en el modelo más común para evaluar la disfunción eréctil después de una cirugía pélvica radical⁸. Sin embargo, en numerosas literaturas se han descrito diversas formas de lesión nerviosa cuyas principales diferencias son los abordajes de las lesiones nerviosas (aplastamiento, congelación, transección y escisión)^9,10,11. Además, la diversidad de enfoques de lesión nerviosa podría conducir a inconsistencias en los parámetros de registro de la presión intracavernosa (PIC) en el modelo de rata, lo que determina la precisión y la evaluación de la ICP⁸. Sin embargo, aún no existe un método estandarizado para inducir la lesión nerviosa y registrar la PIC del modelo.

Por lo tanto, este estudio tiene como objetivo construir un modelo de rata con lesión CN bilateral más confiable y reproducible. Este método proporciona una descripción detallada del procedimiento de construcción del modelo y la medición de la PIC, que podría ser beneficiosa para estudiar los mecanismos de la disfunción eréctil y desarrollar tratamientos eficaces en el futuro.

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Protocolo

En este estudio se utilizaron quince ratas Sprague-Dawley macho adultas (de 3 meses de edad) con un peso de entre 300 y 350 g. Todos los procedimientos con animales se realizaron siguiendo las Directrices de los NIH para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y con la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del quinto hospital afiliado de la Universidad Sun Yat-Sen. Los animales fueron alojados en una instalación cómoda con temperatura y luz controladas.

1. Preparación de materiales para procedimientos quirúrgicos

1. Prepare los siguientes instrumentos: bisturí, tijeras de tejido, tijeras de hilo, pinzas de flexión, pinzas de tejido, pinzas de microcirugía, pinzas hemostáticas para mosquitos Hartman, láminas quirúrgicas estériles, un soporte de microagujas, retractores abdominales de rata y sistema de adquisición y procesamiento de señales biológicas (ver Tabla de Materiales).
   1. Esterilice todos los instrumentos quirúrgicos antes de la operación. Use toallitas con alcohol (70% etanol) para limpiar el área quirúrgica.
      NOTA: Los instrumentos quirúrgicos deben esterilizarse por inmersión en alcohol durante la noche.
2. Preparar el sistema de registro de presión
   1. Conecte una jeringa de 10 mL que contenga solución salina heparina y una aguja hipodérmica de 25 G a una llave de paso de 3 vías con un tubo (20 cm de longitud). Enjuague el tubo esterilizado con solución salina de heparina estéril (200 U/mL).
      NOTA: Llenar el tubo con solución salina de heparina evita la introducción de burbujas de aire en el sistema.
3. Levante la aguja de 25 g 20 cm (solo la longitud del tubo) por encima de la almohadilla de operación del animal. A continuación, examine la precisión de la medición del sistema de registro de presión mediante lavado o golpecito.

2. Preparación del animal

1. Anestesiar ratas mediante una inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico (60 mg/kg) (ver Tabla de Materiales).
   NOTA: Para confirmar la profundidad suficiente de la anestesia, se realizó una evaluación del ritmo respiratorio espontáneo y de los reflejos de una rata al pellizcar la pata trasera.
2. Aplique ungüento en los ojos bilaterales para evitar la sequedad de la córnea.
3. Después de confirmar una anestesia adecuada, afeite la mitad inferior del abdomen, el cuello y el perineo con una afeitadora eléctrica. Coloque la rata en posición supina sobre una almohadilla térmica (37 °C). Use guantes médicos para mantener las condiciones estériles durante los procedimientos quirúrgicos.

3. Procedimiento de aislamiento y lesión de la NC

1. Use un bisturí para hacer una incisión de 4 cm a través de la piel en la parte inferior y media del abdomen. Para exponer completamente la vejiga y la próstata, use tijeras de tejido y pinzas de tejido para hacer una incisión de longitud adecuada a través de la fascia subcutánea, el tejido muscular y el peritoneo.
2. Utilice un retractor abdominal de rata para ampliar el mapa de campo operativo. Use hisopos de algodón absorbentes para separar la próstata de los tejidos adyacentes, como los ligamentos.
   NOTA: El ganglio pélvico mayor (MPG) y la CN se pueden encontrar en una de las dos áreas dorsolaterales de la próstata.
3. Utilice microtijeras en ángulo para incidir la fascia suprayacente CN 1-6 mm distal a MPG. A continuación, deslice una sutura 9-0 por debajo del CN con el uso de pinzas de microcirugía.
4. Coloque una aguja de jeringa (25 G) debajo del CN, 5 mm distal al MPG. A continuación, coloque el hemostático a la luz de la estructura de sándwich "punta de hemostático-jeringa-aguja-nervio-punta de hemostático" (Figura 1 y Figura 2).
   NOTA: La aguja de la jeringa debe estar rectificada.
5. Aplique el hemostático con cierre completo de la punta a 5 mm distal del ganglio durante 1 min, luego retire el hemostático y la aguja de la jeringa (Figura 2).
6. Eleve ligeramente el nervio a través de una sutura 9-0 y coloque los ganchos del electrodo bipolar (ver Tabla de Materiales) alrededor del CN 2-4 mm distal a MPG (Figura 3).
   NOTA: Dos pares de MPG y CN funcionaron de la misma manera.

4. Cateterismo del cuerpo cavernoso y estimulación del CN para la medición de la PIC

1. Enjuague el tubo con solución salina de heparina estéril (200 U/mL) antes de introducirlo en el cuerpo cavernoso.
2. Sujete la aguja de 25 G y mantenga la dirección del inserto paralela al curso del cuerpo cavernoso (Figura 3).
   NOTA: La túnica albugínea debe estirarse para facilitar la inserción.
3. Introduzca la aguja de 25 G 6 mm en el cuerpo cavernoso (Figura 3). Enjuague el tubo y presione ligeramente el cuerpo cavernoso para evaluar la sensibilidad del transductor (Figura 4). Para evitar caídas accidentales, fije el tubo a la mesa de trabajo con cinta adhesiva.
4. Utilice los siguientes parámetros para la estimulación CN: voltaje a 1,0 V, frecuencia a 20 Hz, ancho de pulso a 5 ms. Aplicar 1 min de estimulación con 5 min de descanso entre la siguiente estimulación.
   NOTA: Gire la llave de paso de 3 vías al canal del transductor de presión al iniciar la medición.

5. Cuidados postoperatorios

1. Coloque las ratas en una almohadilla caliente (37 °C) y contrólelas cuidadosamente para la recuperación de la anestesia.
2. Para el control del dolor postoperatorio, proporcionar fármacos antiinflamatorios no esteroideos (por ejemplo, carprofeno, 0,5 mg/kg, inyección subcutánea) (ver Tabla de materiales) cuando las ratas se recuperen por completo.
3. Traslade las ratas a la jaula aséptica y vigílelas durante 2 días para evaluar el estado de nutrición, el estado mental y la infección de la herida incisional.

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Resultados

El procedimiento quirúrgico produjo una curva de respuesta típica de la PIC utilizando este protocolo con los ajustes de estimulación recomendados. La curva de respuesta de la PIC se eleva instantáneamente cuando se estimula el nervio y disminuye cuando se retira la estimulación (Figura 5). Es esencial examinar la línea de presión intracavernosa antes de medir la PIC, lo que afecta la evaluación de los valores aumentados de la PIC (

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Discusión

La disfunción eréctil es una complicación grave de una cirugía pélvica o un traumatismo. A pesar de someterse a una operación conservadora del nervio, la tasa de incidencia de disfunción eréctil es de aproximadamente el 14-90% en la prostatectomía radical (PR)¹². Debido a la problemática regeneración de la lesión CN, el efecto curativo clínico es menos que satisfactorio. Por lo tanto, es esencial un modelo animal estable de lesión CN para explorar lo...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
25 G needle	BD Bioscience	367391
Abdominal retractor	RWD Life Science	R22009-01
Animal operating pad	Provided by Guangdong Provincial Key Laboratory of Biomedical Imaging	NA
Bending forceps	RWD Life Science	F12011-10
Biological signal acquisition and processing system	Techman Software	BL-420S
Bipolar electrode	Techman Software	AC0047
Carprofen	Sigma-Aldrich	MFCD00079028
HARTMAN mosquito hemostatic forceps	RWD Life Science	F22002-10
Heparin	Shanghai Aladdin Biochemical Technology	2608411
Micro needle holder	RWD Life Science	F31047-12
Microsurgery forceps	RWD Life Science	F11001-11
Scalpel	RWD Life Science	S32003-12
Sodium pentobarbital	Guangdong Provincial Key Laboratory of Biomedical Imaging	NA
Sprague–Dawley rat	Guangdong Medical Laboratory Animal Center	GDMLAC-035
Thread scissors	RWD Life Science	S15001-11
Tissue forceps	RWD Life Science	F13019-12
Tissue scissors	RWD Life Science	S13029-14