Método de PCR de gotas digitales para la cuantificación de la eficiencia de la transducción AAV en la retina murina

Resumen

Este protocolo presenta cómo cuantificar la eficiencia de la transducción de AAV en la retina del ratón mediante PCR digital por gotas (dd-PCR) junto con la producción de AAV a pequeña escala, la inyección intravítrea, las imágenes de la retina y el aislamiento del ADN genómico de la retina.

Resumen

Muchos laboratorios de biología celular de la retina ahora usan rutinariamente virus adenoasociados (AAV) para la edición de genes y aplicaciones regulatorias. La eficiencia de la transducción AAV suele ser crítica, lo que afecta los resultados experimentales generales. Uno de los principales determinantes para la eficiencia de transducción es el serotipo o variante del vector AAV. Actualmente, varios serotipos y variantes artificiales de AAV están disponibles con diferentes afinidades con los receptores de la superficie de la célula huésped. Para la terapia génica retiniana, esto resulta en diversos grados de eficiencia de transducción para diferentes tipos de células retinianas. Además, la ruta de inyección y la calidad de la producción de AAV también pueden afectar la eficiencia de la transducción de AAV retiniana. Por lo tanto, es esencial comparar la eficiencia de diferentes variantes, lotes y metodologías. El método de PCR digital de gotas (dd-PCR) cuantifica los ácidos nucleicos con alta precisión y permite realizar la cuantificación absoluta de un objetivo determinado sin ningún estándar o referencia. Utilizando dd-PCR, también es factible evaluar las eficiencias de transducción de los AV mediante la cuantificación absoluta de los números de copias del genoma AAV dentro de una retina inyectada. Aquí, proporcionamos un método sencillo para cuantificar la tasa de transducción de AAV en células de la retina utilizando dd-PCR. Con modificaciones menores, esta metodología también puede ser la base para la cuantificación del número de copias del ADN mitocondrial, así como para evaluar la eficiencia de la edición de bases, crítica para varias enfermedades de la retina y aplicaciones de terapia génica.

Introducción

Los virus adeno asociados (AVA) ahora se usan comúnmente para una variedad de estudios de terapia génica retiniana. Los AAV proporcionan una forma segura y eficiente de administración de genes con menos inmunogenicidad y menos integraciones del genoma. La entrada de AAV en la célula diana se produce a través de la endocitosis, que requiere la unión de receptores y co-receptores en la superficie celular^1,2. Por lo tanto, la eficiencia de transducción de los AV para diferentes tipos de células depende principalmente de la cápside y sus interacciones con los receptores de la célula huésped. Los AAV tienen serotipos y cada serotipo puede tener tropismos celulares / tisulares distintos y eficiencias de transducción. También existen serotipos y variantes artificiales de AAV generados por modificación química de la cápside del virus, producción de cápsides híbridas, inserción de péptidos, barajado de la cápside, evolución dirigida y mutagénesis racional³. Incluso cambios menores en la secuencia de aminoácidos o la estructura de la cápside pueden influir en las interacciones con los factores de la célula huésped y dar lugar a diferentes tropismos⁴. Además de las variantes de la cápside, otros factores como la ruta de inyección y la variación de lote a lote de la producción de AAV pueden afectar la eficiencia de transducción de los AV en la retina neuronal. Por lo tanto, se necesitan métodos fiables para la comparación de las tasas de transducción para diferentes variantes.

La mayoría de los métodos para determinar la eficiencia de la transducción AAV se basan en la expresión génica del informador. Estos incluyen imágenes fluorescentes, inmunohistoquímica, western blot o análisis histoquímico del producto del gen reportero^5,6,7. Sin embargo, debido a la restricción de tamaño de los AAV, no siempre es factible incluir genes reporteros para monitorear la eficiencia de la transducción. El uso de promotores fuertes como el potenciador híbrido cmV / beta-actina de pollo o el elemento regulador post-transcripcional de la hepatitis de Woodchuck (WPRE) como una secuencia estabilizadora de ARNm complica aún más el problema de tamaño⁸. Por lo tanto, también será beneficioso definir la tasa de transducción de los AV inyectados con una metodología más directa.

La PCR digital de gotas (dd-PCR) es una técnica poderosa para cuantificar el ADN objetivo a partir de cantidades diminutas de muestras. La tecnología dd-PCR depende de la encapsulación de la mezcla de reacción de ADN y PCR objetivo mediante gotas de aceite. Cada reacción dd-PCR contiene miles de gotas. Cada gota se procesa y analiza como una reacción PCR independiente⁹. El análisis de gotas permite calcular el número de copia absoluta de moléculas de ADN objetivo en cualquier muestra simplemente utilizando el algoritmo de Poisson. Dado que la eficiencia de transducción de los AAV se correlaciona con el número de copias de los genomas de AAV en la retina neuronal, utilizamos el método dd-PCR para cuantificar los genomas de AAV.

Aquí, describimos una metodología de dd-PCR para calcular la eficiencia de transducción de vectores AAV a partir de ADN genómico retiniano^6,10. En primer lugar, los AAV que expresan tdTomato reporter se generaron utilizando el protocolo a pequeña escala, y se titularon mediante el método dd-PCR¹¹. En segundo lugar, los AV se inyectaron intravítreamente en la retina neuronal. Para demostrar la eficiencia de la transducción, primero cuantificamos la expresión de tdTomato utilizando microscopía fluorescente y software ImageJ. Esto fue seguido por el aislamiento del ADN genómico para la cuantificación de genomas AAV en retinas inyectadas mediante dd-PCR. La comparación de los niveles de expresión de tdTomato con los genomas de AAV transducidos cuantificados por la dd-PCR mostró que el método de dd-PCR cuantificó con precisión la eficiencia de transducción de los vectores AAV. Nuestros protocolos demostraron una descripción detallada de una metodología basada en dd-PCR para cuantificar las eficiencias de transducción AAV. En este protocolo, también mostramos el número absoluto de genomas AAV que se transducen después de las inyecciones intravítreas simplemente utilizando el factor de dilución después del aislamiento genómico del ADN y los resultados de dd-PCR. En general, este protocolo proporciona un método poderoso, que sería una alternativa a la expresión reportera para cuantificar las eficiencias de transducción de los vectores AAV en la retina.

Protocolo

Todos los protocolos experimentales fueron aceptados por el comité de ética de la Universidad de Sabanci y los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con la declaración de 'La Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología' para el uso de animales en la investigación.

1. Producción de AAV a pequeña escala¹²

1. Cultivo de células HEK293T utilizando placas de 15 cm en 10 mL completos de DMEM/10% FBS hasta un 70-80% de confluencia.
2. Preparar la mezcla de transfección con 20 μg de plásmido ayudante (pHGT1-Adeno1), 7 μg de plásmido cápside y 7 μg de vector AAV2-CBA-tdTomato-WPRE y 136 μL de solución de PEI (1 mg/mL) en 5 mL de DMEM.
3. Añadir la mezcla de transfección preparada de 5 ml a una placa de cultivo celular que contenga 10 ml de medios de cultivo e incubar las células transfectadas durante 48-60 h a 37 °C.
4. Recoger el medio a las 48-60 h post-transfección y digerirlo con DNasa I a una concentración final de 250 U/mL durante 30 min a 37 °C.
5. Centrifugar el medio digerido a 4000 x g,4 °C durante 30 min y luego filtrarlo con un filtro de jeringa de 0,22 μm en la membrana de celulosa regenerada prehumedida durante 100 kDa.
6. Centrifugar la membrana de celulosa regenerada a 4000 x g,4 °C durante 30 min y desechar el medio.
7. Lavar y centrifugar la membrana de celulosa regenerada con PBS que contiene 0.001% Pluronic F-68 tres veces a 4000 x g,4 °C durante 30 min. Deseche el PBS en cada paso.
8. Recoger AAV concentrados de la parte superior de la membrana de celulosa regenerada y alícuota para usos posteriores.
9. Digiera 5 μL de AAV recién hecho con DNasa I (0.2U/μl) durante 15 min a 37 °C para la titulación. Esto es seguido por 10 min a 95 °C de incubación tanto para inactivar la DNasa I como degradar las cápsides virales.
10. Prepare una dilución en serie de 10 veces a partir de AAV digeridos usando F-68 Plurónico al 0.05%. Utilice imprimaciones AAV2-ITR y WPRE para la valoración (Tabla 1). Los títulos se calcularon multiplicando los resultados de dd-PCR con los factores de dilución. Los resultados se convirtieron en copia del genoma/ml (GC/mL).
    NOTA: Se espera que las concentraciones de AAV para la producción de AAV a pequeña escala sean de alrededor de 1 x^{10 12} GC / ml. Este protocolo no es aplicable para cepas AAV que no liberan AAV de manera eficiente en medios como AAV2^13.

2. Inyección intravítrea de AAV

1. Preparación de equipos
   1. Antes de comenzar, prepare una microjeringa de 10 μL con una aguja roma de 36 G. Enjuague cinco veces con 70% de EtOH, cinco veces en ddH₂O, y finalmente cinco veces con PBS.
   2. Cargue la cantidad adecuada de AAV en la microjeringa para cada inyección.
   3. Prepare la aguja quirúrgica (sutura, seda, 6/0), cinta, fórceps y tijeras.
2. Inyección intravítrea
   1. Aplique 1 gota de tropicamida al 0,5% y clorhidrato de fenilefrina al 2,5% (por ejemplo, Mydfrin) que contenga gotas para los ojos antes de la anestesia para dilatar las pupilas.
   2. Anestesiar ratones con isoflurano al 5% (1 L/min) y continuar con isoflurano al 1,5% (1 L/min) durante el procedimiento. Se utiliza una pequeña cámara de isoflurano para la primera inducción.
   3. Verifique la profundidad de la anestesia por la pérdida del reflejo de enderezamiento, el reflejo de abstinencia y la respuesta de pellizco de la cola.
   4. Aplique tobramicina al 0,3% y solución oftálmica estéril de dexametasona al 0,1% en cada ojo antes del procedimiento de inyección. La aplicación de gotas para los ojos previene la sequedad y ejerce efectos antiinflamatorios y antibacterianos.
   5. Use el gancho quirúrgico para estabilizar el párpado superior. Tire ligeramente hacia atrás para exponer la parte dorsal del ojo. Pega el gancho con cinta adhesiva al banco para mantenerlo en su posición.
   6. Retire la conjuntiva (menos de 1 mm²⁾con las tijeras curvas del iris para exponer la esclerótica del ojo bajo el microscopio de disección. Use una jeringa de insulina fresca y estéril (30 G) para perforar la esclerótica.
   7. Inserte la aguja de la microjeringa a través de la misma punción utilizando un micromanipulador. Coloque la punta de la aguja detrás de la lente en el centro del ocular.
   8. Inyecte 1 μL de AAV2/BP2 y AAV2/PHP. Vectores S con concentraciones de 1,63 x^{10 12} GC/mL y 1,7 x^{10 12} GC/mL lentamente en el vítreo del ojo. El control del volumen de inyección se realiza manualmente. Deje la aguja en su lugar durante 1 minuto y retire lentamente la aguja.
   9. Suelte el párpado y aplique un tratamiento de gel tópico antiinflamatorio y antibacteriano que contenga tobramicina al 0,3% y dexametasona al 0,1% al ocular. Monitoree y evalúe a los ratones en los días siguientes de acuerdo con la hoja de puntuación en términos de apariencia (ojos brillantes, pelaje arreglado, encorvamiento), comportamiento (actividad, inmovilización, automutilación) y peso corporal en una escala de 0 a 3. Cada condición tiene una puntuación de 0-3 y una puntuación total de 3 o superior es un criterio de terminación.
   10. Coloque a los animales en la jaula después de la recuperación.

3. Imágenes de fluorescencia y fondo de ojo

1. Colar el ratón y dilatar la pupila colocando gotas de 0,5% de tropicamida y 2,5% de clorhidrato de fenilefrina en cada ojo.
2. Anestesiar al animal con el procedimiento anterior con isoflurano. Evalúe la profundidad de la anestesia cuidadosamente pellizcando las patas.
3. Coloque el ratón en el escenario de imagen y verifique la dilatación adecuada comprobando a través de la cámara del fondo de ojo. Aplique gel tópico (carbómero 980 al 0,2%) sobre la superficie de los ojos para proteger los ojos de la deshidratación bajo anestesia y para usarlo como un gel de acoplamiento para imágenes.
4. Manipule la etapa de imagen para alinearse con la pieza nasal del objetivo. Ajuste el escenario según sea necesario para centrar el ojo del ratón. Una vez que el ojo esté centrado, mueva lentamente el objetivo hasta que haga contacto con el ojo.
5. Realizar imágenes de fondo de ojo y fluorescencia en ambos ojos para hacer un seguimiento de la expresión de tdTomato a la semana 1 semana y 2 semanas después de la inyección intravítrea (Figura 3B)¹⁴. Tome imágenes de fondo de ojo y fluorescencia en configuraciones idénticas para comparar la expresión del reportero.

4. Aislamiento de retina

1. Eutanasia a los animales después de imágenes de fondo de ojo y fluorescencia por inhalación de CO₂ para la recolección de retina en el punto de tiempo de 2 semanas.
2. Desplace el globo ocular hacia adelante con la ayuda de una pinza divisora de 13,5 cm.
3. Retire la lente junto con el vítreo sobrante aplicando una presión suave con las pinzas.
4. Corte la conexión del globo ocular al nervio óptico con pinzas curvas de precisión y apriete suavemente la retina con las mismas pinzas curvas.
5. Transfiera las retinas disecadas a un tubo de microcentrífuga.
6. Congela la retina colocando los tubos en el nitrógeno líquido.

5. Aislamiento de ADN genómico tisular

1. Aísle el ADN genómico con un kit de ADN genómico tisómico basado en la digestión proteinasa K comercializado.
2. Digiera la retina a 55 °C, 200 x g durante 30 min con Proteinasa K, que ya se suministra en el kit.
3. Realice el paso de incubación de RNasa, los pasos de lavado con tampón de lavado I y II, y finalmente el paso de elución de acuerdo con el protocolo del fabricante.
4. Agregue un paso de centrifugado adicional después del último lavado para eliminar el etanol residual.
5. Mida la concentración de ADN genómico y almacene las muestras a -20 °C.

6. Análisis de PCR digital de gotas de muestras de retina de ratón para cuantificación de genomas virales

1. Diluir los ADN genómicos de las retinas inyectadas en solución Plurónica F-68 al 0,05% para alcanzar una concentración final de 1 ng/μL para cada muestra.
2. Realice reacciones separadas para WPRE y 18S utilizando cebadores específicos del objetivo con una concentración final de 125 nM para cada imprimación.
3. Realice la generación de gotas en una mezcla de reacción de PCR de 20 μL que incluye 1 ng de ADN genómico, 125 cebadores nM y 2x supermezcla evagreen.
4. Cargue la mezcla de muestra en la parte central del cartucho para la generación de gotas.
5. Después de realizar la carga de la muestra al cartucho, agregue 70 μL de aceite de generación de gotas en la fila inferior del cartucho.
6. Coloque la junta en la parte superior del cartucho y colóquela en el generador de gotas. Asegúrese de que no haya espacio entre la junta y el cartucho.
7. Tome suavemente aproximadamente 40 μL de gotas que se generan en el pozo superior. Agregue la solución de gotas a la placa de reacción de PCR semifalda de 96 pocillos.
8. Selle la placa de PCR con sellador de placas de PCR utilizando papel de sellado de aluminio.
9. Coloque la placa de PCR en un termociclador termosellado de 96 pocillos. Utilizar el protocolo PCR; 95 °C durante 5 min, 40 ciclos de 95 °C durante 30 s, 60 °C durante 1 min, 4 °C durante 5 min, 90 °C durante 5 min y 4 °C de retención infinita. Aplique una velocidad de rampa de 2 °C/s en cada ciclo para asegurarse de que las gotas alcancen la temperatura correcta para cada paso durante el ciclo
10. Coloque la placa de PCR en el lector de gotas para cuantificar las gotas utilizando el software dd-PCR. Se configura una plantilla utilizando configuraciones específicas para evagreen.
11. Analice los datos utilizando un gráfico de gráfico 1-D con cada muestra para la intensidad de fluorescencia frente al número de gotas. El valor umbral se organiza de modo que las gotas por encima del umbral se asignan como positivas y las inferiores como negativas. Esto es seguido por la aplicación del algoritmo de Poisson para determinar la concentración inicial de ADN objetivo en unidades de copias/μL. La relación de WPRE versus 18S se calcula para medir la eficiencia de transducción AAV.

Resultados

La producción de AAV a pequeña escala es un método rápido y eficiente que proporciona vectores para inyecciones intravítreas(Figura 1). La producción de AAV a pequeña escala generalmente da títulos dentro del rango de 1 x 10¹² GC / ml, que es suficiente para detectar la expresión del reportero en la retina (Figura 2). La titulación de AAV mediante dd-PCR da resultados consistentes. Los cebadores específicos ITR2 y WPRE se utilizan rutinaria...

Discusión

En este protocolo, generamos dos vectores AAV que tienen diferentes proteínas de cápside y luego los titulamos en consecuencia. Uno de los pasos más cruciales de este protocolo es producir cantidades suficientes de AAV que produzcan una expresión detectable del reportero después de la transducción^12,13.

La titulación de los AAV también es un factor importante para ajustar las dosis de AAV para las inyecciones intravítreas. ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-Well Semi-Skirted ddPCR plates	BioRad	12001925	ddPCR
Amicon Filter	Millipore	UFC910096	AAV
C1000 TOUCH 96 DEEP WELLS	BioRad	1851197	ddPCR
C57BL/6JRj mice strain	Janvier	C57BL/6JRj	Mice
DG8 gaskets	BioRad	1863009	ddPCR
DG8 Cartridges	BioRad	1864008	ddPCR
DMEM	Lonza	BE12-604Q	AAV
DPBS	PAN BIOTECH	L 1825	AAV
Droplet generation oil eva green	BioRad	1864006	ddPCR
Droplet reader oil	BioRad	1863004	ddPCR
FBS	PAN BIOTECH	p30-3306	AAV
Foil seals for PX1 PCR Plate sealer	BioRad	1814040	ddPCR
Insulin Syringes	BD Medical	320933	Intravitreal injection
Isoflurane	ADEKA ILAC SANAYI VE TICARET	N01AB06	anesthetic
Microinjector MM33	World Precision Instruments	82-42-101-0000	Intravitreal injection
Micron IV	Phoenix Research Labs	Micron IV	Microscopy system based on 3-CCD color camera, frame grabber, and off-the-shelf software enables researchers to image mouse retinas.
Mydfrin (%2.5 phenylephrine hydrochloride)	Alcon	S01FB01	pupil dilation
Nanofil Syringe 10 μl	World Precision Instruments	NANOFIL	Intravitreal injection
Needle RN G36, 25 mm, PST 2	World Precision Instruments	NF36BL-2	Intravitreal injection
PEI-MAX	Polyscience	24765-1	AAV
Penicillin-Streptomycin	PAN BIOTECH	P06-07100	AAV
Plasmid pHGT1-Adeno1	PlasmidFactory	PF1236	AAV
Pluronic F-68	Gibco	24040032	AAV
PX1 PCR Plate Sealer system	BioRad	1814000	ddPCR
QX200 ddPCR EvaGreen Supermix	BioRad	1864034	ddPCR
QX200 Droplet Reader/QX200 Droplet Generator	BioRad	1864001	ddPCR
SPLITTER FORCEP WATCHER MAKER - LENGTH = 13.5 CM	endostall medical	EJN-160-0155	Retina isolation
Steril Syringe Filter	AISIMO	ASF33PS22S	AAV
Tissue Genomic DNA Kit	EcoSpin	E1070	gDNA isolation
Tobradex (0.3% tobramycin / 0.1% dexamethasone)	Alcon	S01CA01	anti-inflammatory / antibiotic
Tropamid (% 0.5 tropicamide)	Bilim Ilac Sanayi ve Ticaret AS.	S01FA06	pupil dilation
Turbonuclease	Accelagen	N0103L	AAV
Viscotears (carbomer 2 mg/g)	Bausch+Lomb	S01XA20	lubricant eye drop