Interfaces de hidrogel fotodegradables para detección, selección y aislamiento de bacterias

Resumen

Se informa del uso de hidrogeles fotodegradables para aislar células bacterianas mediante el uso de una herramienta de pattering de luz de alta resolución. Se revisan los procedimientos experimentales esenciales, los resultados y las ventajas del proceso. El método permite el aislamiento rápido y económico de bacterias objetivo que muestran funciones raras o únicas de comunidades o poblaciones heterogéneas.

Resumen

Los biólogos han intentado durante mucho tiempo comprender la relación entre el fenotipo y el genotipo. Para comprender mejor esta conexión, es crucial desarrollar tecnologías prácticas que combinen la detección celular microscópica con el aislamiento celular de alta pureza para el análisis genético posterior. Aquí, se describe el uso de hidrogeles de poli(etilenglicol) fotodegradables para la detección y el aislamiento de bacterias con fenotipos de crecimiento únicos de poblaciones celulares heterogéneas. El método se basa en encapsular o atrapar células con el hidrogel, seguido de cultivo, detección microscópica, luego uso de una herramienta de patrón de luz de alta resolución para el control espaciotemporal de la degradación del hidrogel y la liberación de células seleccionadas en una solución para su recuperación. La aplicación de diferentes patrones de luz permite el control sobre la morfología de la célula extraída, y se pueden usar patrones como anillos o cruces para recuperar células con una exposición mínima directa a la luz UV para mitigar el daño del ADN a los aislados. Además, la herramienta de modelado de luz ofrece una dosis de luz ajustable para lograr varias tasas de degradación y liberación celular. Permite la degradación a alta resolución, lo que permite la recuperación celular con precisión espacial a escala de micras. Aquí, se demuestra el uso de este material para detectar y recuperar bacterias tanto de hidrogeles a granel como de dispositivos microfabricados de laboratorio en un chip. El método es barato, simple y se puede utilizar para aplicaciones comunes y emergentes en microbiología, incluido el aislamiento de cepas bacterianas con perfiles de crecimiento raros de bibliotecas mutantes y el aislamiento de consorcios bacterianos con fenotipos emergentes para caracterizaciones genómicas.

Introducción

El aislamiento de células con comportamientos únicos de un entorno complejo y heterogéneo es fundamental para obtener información genética en biología¹. En microbiología, la selección y el aislamiento de microbios raros o únicos después de la observación se vuelve importante en muchas aplicaciones que requieren una conexión entre la información genómica y la información fenotípica observable. Estas aplicaciones incluyen la selección de cepas fenotípicamente raras de bibliotecas mutantes^2,la selección de microorganismos clave de comunidades microbianas complejas^3,4y la selección de bacterias fenotípicamente raras pero importantes de poblaciones isogénicas. El aislamiento de células viables pero no cultivables (VBNC) de una población de bacterias es un ejemplo importante de esto último, donde las células con el fenotipo VBNC a menudo se ocultan en poblaciones de bacterias a 1:10² a 1:10⁵ proporciones^5,6. Debido a las dificultades generalizadas en el aislamiento de bacterias, queda mucho desconocido sobre muchos microorganismos fenotípicamente raros. Estas limitaciones enfatizan la necesidad de técnicas de aislamiento celular para identificar primero la célula o células objetivo de una mezcla y luego recuperarlas y aislarlas para el análisis molecular posterior⁷.

Algunos de los métodos más comúnmente establecidos de aislamiento celular incluyen citometría de flujo y clasificación celular activada fluorescente (FACS)^8,separación inmunomagnética^9,10y microfluídica^11. Si bien estos métodos de aislamiento tienen un alto valor, también tienen inconvenientes que limitan su uso. Por ejemplo, EL FACS puede proporcionar aislamiento microbiano de rutina a nivel de una sola célula para el análisis genómico de seguimiento^3, pero a menudo está limitado por su disponibilidad y gasto, así como por los problemas de contaminación aguas^{abajo 11}. Los enfoques basados en microfluídica, como la citometría de flujo microfluídico, han recibido mucha atención, lo que, en comparación con la citometría de flujo convencional, permite una reducción significativa en el volumen de muestra requerido¹². Sin embargo, la separación y recuperación de una colección individual o pequeña de células de dispositivos microfluídicos es a menudo un problema desafiante que generalmente requiere una configuración y un diseño de dispositivos más complejos¹³. Muchos enfoques basados en microfluidos caracterizan genéticamente las células antes de que se introduzcan y observen en un dispositivo^14,lo que limita el número de especies únicas observadas al realizar una pantalla funcional. Dadas estas limitaciones, se requiere una mayor innovación tanto de métodos como de materiales que sean prácticos para la detección y el aislamiento celular para su uso generalizado en muchos laboratorios.

Este documento presenta un nuevo enfoque basado en materiales para la detección y el aislamiento de bacterias. El método utiliza hidrogeles fotodegradables para la encapsulación celular, el cultivo, la observación microscópica y la liberación y recuperación bajo demanda de bacterias objetivo con fenotipos únicos. Los hidrogeles están diseñados para contener un tamaño de malla de 10 nm, donde cada reticulación contiene grupos o-nitrobencil^15. El material encapsula o atrapa las células para su observación al tiempo que permite la difusión de nutrientes y productos de desecho hacia y desde las células para su cultivo. La exposición del material a una fuente de luz UV estampada de 365 nm a través de un microscopio vertical permite la degradación local del hidrogel a través del fotocierre de los grupos o-nitrobencil^{16, 17}. La degradación desencadena la liberación selectiva de células para su recuperación para el análisis posterior, incluido el análisis genómico y, potencialmente, proteómico y transcriptómico. La configuración experimental y el protocolo son relativamente simples, económicos y traslacionales a los laboratorios de microbiología. Solo requiere encapsulación celular a través de la formación de hidrogel, observación de células capturadas con un microscopio vertical de campo brillante y fluorescencia, y la iluminación de células de interés con una fuente de luz UV patrón para su recuperación.

Una ventaja clave de este enfoque basado en materiales para la detección es su adaptabilidad a diferentes formatos de detección. En su formato más básico, el material se puede utilizar para el cribado encapsulando una colección de células heterogéneas en hidrogeles a granel. Luego se observan células para el fenotipo deseado, y se eliminan células individuales de interés para la caracterización genómica. En formatos más elaborados, el material también se puede integrar en dispositivos de laboratorio en un chip para proporcionar una liberación y recuperación celular precisa de las áreas deseadas del dispositivo. Ambos formatos se describen aquí, y ambos han permitido nuevas aplicaciones recientes de detección y selección microbiana^17,18,19. El método se demuestra aquí con organismos Gram-negativos modelo(Escherichia coli, Agrobacterium tumefaciens)y un modelo de organismo Gram-positivo(Bacillus subtilis)y se ha extendido fácilmente a una variedad de otras bacterias.

Protocolo

1. Cepas bacterianas y protocolos de cultivo

1. Colonias de bacterias en vetas en placas de agar complementadas con medios de crecimiento apropiados. En este informe, B. subtilis (cepa 1A1135, Bacillus Genetic Stock Center) se cultiva en ATGN (0.079 M KH₂PO₄, 0.015 M (NH₄)₂SO₄, 0.6 mM MgSO₄·7H₂O, 0.06 mM CaCl₂·2H₂O, 0.0071 mM MnSO₄· H₂O, 0.125 M FeSO_4· 7H₂O, 28 mM de glucosa, pH: 7 placas de agar de 7 ± 0,2, 15 g/L de agar) suplementadas con 100 μg/ml de espectinomicina y E. coli (cepa 25922, ATCC) en placas de agar ATGN suplementadas con 100 μg/ml de ampicilina.
   NOTA: Los informes previos de encapsulación y liberación de hidrogel con estos materiales de Fattahi et al.¹⁹ en su lugar utilizaron células de A. tumefaciens C58
2. Elija las colonias deseadas de las placas de agar ATGN y comience los cultivos durante la noche. Para las cepas de E. coli y B. subtilis utilizadas aquí, cultive a 37 °C mientras agita a 215 rpm en medio líquido ATGN durante 24 h. Almacene los cultivos celulares en glicerol al 50% a -80 °C hasta su uso futuro.
3. Recoger colonias de ambas cepas de cepas de glicerol utilizando bucles de inoculación estériles e incubar en medios líquidos ATGN durante 24 h a 37 °C y 215 rpm.

2. Preparación del material necesario para la formación de hidrogel

1. Síntesis fotodegradable de PEG-o-NB-diacrilato
   NOTA: La síntesis interna del diacrilatoPEG-o-NBha sido bien descrita y reportada previamente^16,17. Alternativamente, debido a que la síntesis es rutinaria, se puede subcontratar de una instalación de síntesis química.
2. Búfer de reticulación
   1. Tome la receta del medio seleccionado para la cepa bacteriana y prepare los medios con 2x nutrientes. Añadir fosfato, por ejemplo, NaH₂PO_4, al medio hasta una concentración final de 100 mM. Luego, ajuste el valor de pH a 8 usando 5 M NaOH (aq).
   2. Esterilizar la solución tampón y almacenarla a -20 °C hasta su uso posterior.
      NOTA: Omita cualquier metal de transición presente en el medio, ya que estos metales catalizan la oxidación de los tioles a disulfuros.
3. SOLUCIÓN DEPEG-o-NB-diacrilato
   1. Por cada mg del polvo alícuota PEG-o-NB-diacrilato (3.400 Da de peso molecular), añadir 3,08 μL de agua ultrapura para alcanzar una concentración de 49 mM de PEG- o-NB-diacrilato (concentración de acrilato de 98 mM).
   2. Vórtice la solución hasta que esté bien mezclada y guarde esta solución a -20 °C hasta su uso posterior.
4. Solución de PEG-tiol de 4 brazos
   1. Para la preparación de PEG-tiol de 4 brazos (peso molecular de 10,000 Da), agregue 4 μL de agua ultrapura por mg de polvo para alcanzar una concentración de 20 mM (80 mM de concentración de tiol).
   2. Vórtice esta solución hasta que esté bien mezclada y guarde esta solución a -20 °C hasta su uso posterior.

3. Preparación de fundas perfluoroalquiladas (no reactivas)

1. Coloque hasta 5 portaobjetos de vidrio (25 mm x 75 mm x 1 mm) dentro de un portaobjetos de polipropileno. Sonicar los portaobjetos con una solución detergente al 2% (p/v)(Tabla de Materiales)durante 20 min.
2. Enjuague los toboganes tres veces con agua ultrapura, luego sonice los toboganes en agua durante 20 minutos. Secar los toboganes usando una corriente de N₂.
3. Limpieza con plasma (ver Tabla de Materiales)en ambos lados de los portaobjetos de vidrio según el protocolo de la sección 4.1 durante 2 min.
4. Coloque los portaobjetos limpiados con plasma de nuevo en el correo de diapositivas y llene el recipiente con una solución al 0,5% (v/v) de tricloro(1H, 1H, 2H, 2H,-perfluorooctil)silano en tolueno. Permita que estos portaobjetos de vidrio se funcionalicen durante 3 h a temperatura ambiente (RT).
5. Después de funcionalizar las diapositivas, enjuague las diapositivas dentro del correo de diapositivas, primero con tolueno y luego con etanol (tres veces con cada solvente). A continuación, seque cada diapositiva funcionalizada con una corriente de N_2.

4. Preparación de tiol funcionalizado (base) coverslips

1. Limpieza de las cubiertas de vidrio con un limpiador de plasma
   1. Coloque los cobertores de 18 mm x 18 mm en una placa de Petri. Luego, coloque la placa de Petri en una cámara de filtro de plasma y encienda la potencia del limpiador de plasma.
   2. Encienda la bomba de vacío para limpiar el aire dentro de la cámara hasta que el manómetro lea 400 mTorr.
   3. Abra la válvula dosificadora para dejar entrar el aire en la cámara hasta que el manómetro alcance una presión constante (800-1000 mTorr). Luego, seleccione RF con el modo "Hi" y exponga los coverslips durante 3 minutos.
   4. Después de 3 minutos, apague el modo RF y la bomba de vacío.
   5. Saque la placa de Petri de la cámara, voltee las fundas y colóquelas de nuevo en la cámara para exponer con plasma el otro lado de la cubierta de vidrio.
   6. Repita los pasos 4.1.2-4.1.4 para limpiar con plasma el lado no tratado de la cubierta de vidrio.
   7. Después de completar el proceso, retire la placa de Petri de la cámara y apague el limpiador de plasma y la bomba de vacío.
2. Limpieza e hidroxilación de las fundas con solución de piraña
   NOTA: Los protocolos estándar de limpieza de pirañas se pueden utilizar para limpiar e hidroxilar los resbalones de vidrio. La solución de piraña es una mezcla 30:70 (v/v) de H₂O₂ y H₂SO₄. También se pueden utilizar métodos alternativos de limpieza de tapas de vidrio.
   PRECAUCIÓN: La solución de piraña es fuertemente corrosiva y explosiva con disolventes orgánicos y debe manipularse con extrema precaución. Se deben implementar medidas apropiadas de seguridad y contención, como el uso de equipo de protección personal adecuado (bata de laboratorio, delantal resistente a productos químicos, gafas de seguridad, protector facial, guantes de butilo resistentes a los ácidos). Toda la cristalería y las superficies de trabajo en contacto con la solución de piraña deben estar limpias, secas y libres de residuos orgánicos antes de su uso. La solución de piraña nunca debe almacenarse en un recipiente parcialmente cerrado o cerrado.
   1. Coloque un plato de vidrio limpio de 100 mm x 50 mm en un agitador magnético de placa caliente con velocidad de agitación ajustable debajo de una campana de humos y agregue 14 ml de H₂SO₄ al plato.
   2. Coloque suavemente una pequeña barra de agitación magnética recubierta de teflón con pinzas recubiertas de teflón dentro del plato. Luego, gire el agitador lentamente para evitar salpicaduras del ácido.
   3. A continuación, agregue suavemente 6 ml de H₂O₂ al plato y permita que la solución se mezcle bien.
   4. Apague el agitador y, a continuación, retire la barra de agitación del plato con las pinzas. A continuación, coloque suavemente las fundas dentro del plato con las pinzas y ajuste la temperatura a 60-80 ° C.
   5. Después de 30 minutos, retire suavemente las fundas con las pinzas y sumérjalas en agua desionizada (DI) dos veces para lavar la solución de piraña residual.
   6. Después de enjuagar con agua, guarde las fundas en agua DI en RT hasta su uso posterior.
   7. Apague la placa caliente y deje que la solución de piraña se enfríe.
   8. Para desechar la solución de piraña, coloque suavemente el plato de vidrio de 100 mm x 50 mm que contiene la solución de piraña enfriada en un vaso de precipitados de vidrio vacío más grande que tenga al menos 1,5 L de volumen. Luego agregue 1 L de agua para diluir y agregue polvo de bicarbonato de sodio para neutralizar. Tenga en cuenta que el bicarbonato de sodio causará burbujeo y generación de calor y debe agregarse muy lentamente, de lo contrario, el burbujeo puede provocar salpicaduras del ácido. Cuando la adición adicional de bicarbonato de sodio no cause burbujeo, verifique el pH con papel de pH para verificar que haya sido neutralizado. Una vez que la solución se neutraliza y se enfría, se puede verter por el fregadero.
3. Funcionalización tiol de los coverslips
   1. Preparar una solución al 5% (v/v) de 269 mM de solución de trimetoxisilano (MPTS) (3-mercaptopropil) en tolueno seco.
   2. Agregue 10 ml de la solución a tubos de centrífuga cónica individuales de 50 ml y coloque una cubierta limpia en cada tubo y sumérjalo dentro de la solución.
      NOTA: Se utiliza una cubierta por cada tubo de 50 ml para asegurar la tiolación de ambos lados del sustrato sin ser molestado por otros sustratos.
   3. Después de 4 h, lave cada funda (cuatro lavados por funda) con tolueno, un etanol 1:1 (v/v): mezcla de tolueno y etanol.
      NOTA: Esto se hace sumergiendo cada cubierta secuencialmente en tubos de centrífuga cónicos que contienen las soluciones mencionadas.
   4. Después de enjuagar el sustrato, sumergirlos en etanol y almacenarlos a 4 °C hasta su uso posterior.
      NOTA: Dependiendo del número de fundas, este método puede llegar a ser laborioso debido al tratamiento de las hojas de cubierta de una en una. Para múltiples fundas, se pueden usar frascos Columbia que se ajustan a varias fundas al mismo tiempo.

5. Fabricación de matrices de micropocillos de silicio

1. Recubrimiento de parileno: Utilice el protocolo estándar descrito en artículos de investigación anteriores^20,21 para recubrir las obleas de silicio con parileno.
2. Microfabricación: Seguir el protocolo descrito por Barua et al.¹⁸ para diseñar y fabricar el arreglo de micropocillos(Figura suplementaria 1).
   NOTA: Las técnicas fotolitográficas estándar descritas por Timm et al.¹⁷ se aplicaron para fabricar matrices de micropocillos en obleas de silicio recubiertas de parileno.

6. Formación de hidrogel

1. Formación de hidrogel a granel en hojas de vidrio
   1. Solución precursora de hidrogel: Añadir 12,5 μL del tampón de reticulación a un tubo de microcentrífugade 0,5 ml, seguido de 5,6 μL de solución de diacrilato PEG-o-NB. Por último, agregue 6,9 μL de solución de PEG-tiol de 4 brazos a la mezcla.
      NOTA: La adición del tiol PEG de 4 brazos a la mezcla inicia la reacción de reticulación. Por lo tanto, la solución precursora de hidrogel debe usarse inmediatamente después de la mezcla.
   2. Para la encapsulación celular en la solución precursora de hidrogel, siga los pasos 6.1.3-6.1.9.
   3. Para la encapsulación celular, antes del paso 6.1.1, inocule el búfer de reticulación con la densidad celular deseada. Como se informó anteriormente^19,se observó que la densidad celular de 7.26 × 10⁷ UFC / ml en el tampón de reticulación se correlaciona con una densidad de ~ 90 células / mm² encapsulado a través del hidrogel.
   4. Coloque la funda de la base tiolada sobre una placa de Petri limpia. Coloque dos espaciadores (ver Tabla de Materiales)en los dos lados opuestos de la cubierta.
      NOTA: La funcionalización tiol de las cubiertas es necesaria para la fijación covalente del hidrogel a la superficie de la cubierta. Esto se hace a través de la reacción de los grupos tiol en la superficie y los grupos acrilato presentes en la solución precursora de hidrogel.
   5. Fije los espaciadores en la cubierta de la base pegando los espaciadores a la placa de Petri.
   6. Pipetear el volumen deseado de la solución precursora en un portaobjetos de vidrio perfluoroalquilado no reactivo.
   7. Coloque el portaobjetos de vidrio perfluoroalquilado en la cubierta de la base(Figura 1C). Espere 25 minutos en RT para que se complete la formación de hidrogel.
   8. Después de la gelificación, retire suavemente el portaobjetos de vidrio perfluoroalquilado. El hidrogel permanecerá unido a la cubierta de la base.
      NOTA: Para fundas de 18 mm x 8 mm para obtener una membrana de 12,7 μm de espesor, utilice ~7 μL de la solución precursora (Figura 1A,B). El uso de mayores volúmenes de solución precursora puede resultar en hidrogel debajo de la cubierta de la base. Esto puede hacer que la cubierta de la base se pegue a la placa de Petri y se rompa en un intento de extracción. Además, el residuo de hidrogel debajo de la cubierta es problemático para la microscopía. Se requiere una eliminación suave del portaobjetos de vidrio perfluoroalquilado no reactivo, ya que la extracción rápida puede dañar el hidrogel.
   9. Coloque el sustrato en una placa de Petri de 60 mm x 15 mm en medios de cultivo especificados. Aquí, se utilizaron medios ATGN suplementados con 100 μg/ml de espectinomicina para B. subtilis o 100 μg/ml de ampicilina para E. coli a 37 °C durante 24 h de cultivo.

Figura 1: Formación de hidrogel en fundas de vidrio tiolado. (A) Los espaciadores con un espesor de 12,7 μm se colocan en dos lados opuestos de un capa de cubierta base que contiene grupos tiol reactivos. (B) La solución precursora de hidrogel se canaliza sobre un portaobjetos de vidrio fluorado no reactivo. (C) El portaobjetos de vidrio no reactivo se coloca en los espaciadores para la formación de hidrogel de 12,7 μm de espesor. (D) El portaobjetos de vidrio no reactivo se retira suavemente, dejando el hidrogel unido a la cubierta de la base. (E) El hidrogel preparado puede incubarse en medios para su cultivo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

7. Formación de hidrogel sobre matrices de micropocillos

1. Siembra de bacterias en matrices de micropocillos
   NOTA: Se sembraron 700 μL de 0,1 OD₆₀₀ suspensiones celulares sobre los sustratos de la matriz de micropocillos, y se aplicó el método de despegue de parileno para eliminar las células del fondo utilizando el protocolo descrito por Timm etal. ²².
2. Preparar la solución precursora de hidrogel añadiendo 5,6 μL del diacrilato PEG-o-NB con 12,5 μL de ATGN salino tamponado con fosfato de pH 8 y mezclando con 6,9 μL de la solución de tiol peg de cuatro brazos.
3. Pipetear 12,5 μL de la solución precursora en un portaobjetos de vidrio perfluoroalquilado no reactivo y colocar dos espaciadores de acero de 38 μm (ver Tabla de Materiales)en dos lados opuestos del sustrato de matriz de micropocillos inoculado con células.
4. Invierta el portaobjetos de vidrio perfluoroalquilado con la gota de solución precursora y coloque la gota en el medio del sustrato del micropocillo. Luego, incubar durante 25 min en RT para la formación de hidrogel.
5. Retire suavemente el portaobjetos de vidrio del sustrato del micropocillo. La membrana de hidrogel debe permanecer unida al sustrato del micropocillo. Continúe con el paso 6.1.9.

8. Preparación del material para la extracción celular

1. Preparación del soporte pdMS
   1. Pega una pila de diez fundas de 18 x 18 mm y pega esta pila de fundas en el fondo de una placa de Petri.
   2. Para fabricar soportes PDMS, mezcle el precursor PDMS y el agente de curado en una proporción de volumen de 10: 1 en un vaso de plástico, desgasifique la mezcla en un desecador al vacío y luego vierta la mezcla en la placa de Petri.
   3. Cure PDMS durante 90 min a 80 °C. Luego, corte alrededor del bloque con cinta adhesiva para quitar el soporte pdmS y coloque el soporte PDMS en una diapositiva de vidrio para facilitar el manejo de la microscopía.
2. Preparación de microjeringa y tubos
   1. Corte 20 cm de tubo de PTFE (0,05 en I.D.) y conecte un extremo del tubo a una jeringa de microlitro de 100 μL.
      NOTA: Para la extracción, evite el uso de pipetas, ya que dibujar las células liberadas a través de una punta de pipeta puede dañar la superficie del hidrogel y provocar contaminación.

9. Degradación del hidrogel con la herramienta de iluminación con patrón

NOTA: Los siguientes pasos descritos en esta sección son idénticos tanto para hidrogeles a granel como para matrices de micropocillos, excepto para los patrones de exposición a la luz descritos en los pasos 9.6.4-9.6.6 y 9.6.7-9.6.10.

1. Encienda el microscopio (consulte la Tabla de materiales). A continuación, active la herramienta de iluminación con patrones (consulte Tabla de materiales).
2. Encienda el módulo de control analógico y digital de la fuente de luz LED de 365 nm. A continuación, encienda el módulo de control de la fuente de luz LED.
3. Abra el software del microscopio y el software de la herramienta de iluminación con patrones. Cuando se abra la ventana de configuración de hardware, seleccione el botón Cargar.
   NOTA: Aquí se cargarán tres dispositivos. (Cámara de terceros, un módulo de control y la herramienta de iluminación con patrones)
4. Pulse el botón Inicio. Ahora se abrirá la ventana del software de patrones de luz. Seleccione la primera opción, el botón Control de dispositivos, en la barra lateral izquierda de la ventana.
5. Calibrar la herramienta de iluminación con patrones.
   NOTA: La calibración debe realizarse con el mismo objetivo de microscopio y filtro que se utilizará para la exposición a la luz.
   1. Ajuste el objetivo del microscopio a un aumento de 10x.
      NOTA: Este aumento permite una distancia de trabajo suficiente entre la lente del microscopio y la superficie de la muestra. También permite monitorear y registrar el proceso de recuperación en tiempo real a través de la ventana de la imagen.
   2. Ajuste la lente y el filtro del microscopio a la configuración utilizada para la exposición a la luz y coloque el espejo de calibración debajo del microscopio.
   3. En la ventana Control de dispositivos, presione la pestaña Control LED. Encienda el LED # 1 y ajuste la intensidad de la luz al número deseado. En los experimentos de extracción estándar, esto se establece en 60%.
   4. Presione la pestaña titulada con el nombre del producto de la herramienta de iluminación con patrones en la ventana Control de dispositivos. Luego, presione el botón Mostrar cuadrícula.
      NOTA: Se proyectará un patrón de cuadrícula en el espejo de calibración.
   5. Ajuste el enfoque del microscopio y la exposición de la cámara para obtener una alta calidad de imagen de la cuadrícula y gire la cámara para alinear las líneas de la cuadrícula paralelas al marco de la ventana de la cámara, si es necesario.
   6. Seleccione el botón Asistente de calibración en la pestaña titulada con el nombre del producto de la herramienta de iluminación con patrones y siga las instrucciones proporcionadas por el software en esta ventana.
      NOTA: Se abrirá una ventana de configuración de cámara de terceros.
   7. Se abrirá una ventana de selección de tipo de calibración. Seleccione Calibración automática y pulse Siguiente.
   8. Cuando se abra la ventana Ajuste de precalibración, siga las instrucciones del software y pulse el botón Siguiente.
   9. Cuando se abra la ventana Información de asignación, guarde esta calibración en consecuencia en la carpeta deseada. Esto se hace poniendo la fecha, el nombre del microscopio, la lente del objetivo y el filtro.
   10. Después de la calibración, presione el botón Definición de área de trabajo que se encuentra debajo de la pestaña titulada con el nombre del producto de la herramienta de iluminación con patrones para definir el área de trabajo de la herramienta de iluminación con patrones si es necesario.
6. Sección de diseño de secuencia para la preparación de patrones.
   1. Presione el botón Diseño de secuencia en la barra lateral izquierda de la ventana del software. Luego, presione el botón Editor de secuencia de perfiles.
   2. Cuando se abra la ventana Editor de secuencias de perfiles, seleccione la opción Nuevo perfil en la Lista de perfiles.
      NOTA: Ahora, se abrirá una ventana del Editor de patrones.
   3. Prepare el patrón deseado para la exposición a la luz eligiendo diferentes formas y tamaños de patrón, o dibuje manualmente el patrón, si lo desea.
   4. Para los patrones de círculo y cruz rota para el hidrogel a granel, siga los pasos 9.6.5- 9.6.6
   5. Para los patrones de círculo, defina un círculo con un diámetro de 30 μm sobre una colonia de bacterias objetivo para cubrir toda la colonia. Elija el color de relleno de la forma blanco.
   6. Para patrones cruzados rotos, elija la forma del rectángulo en la ventana de dibujo de patrones con dimensiones de 3 μm x 8 μm. Coloque cuatro rectángulos con esta dimensión en los bordes de la colonia objetivo, mientras que la mitad de los patrones tienen una superposición con la colonia.
   7. Para los patrones de círculos y anillos para las matrices de micropocillos, siga los pasos 9.6.8-9.6.10.
   8. Para los patrones de círculo, dibuje un círculo de 10 μm de diámetro alrededor del perímetro del pozo. Elija el color de relleno de la forma blanco.
   9. Para el patrón de anillo, dibuje un círculo de diámetro 20 μm, colóquelo sobre el pozo y elija el color de relleno de forma blanco.
   10. Dibuje otro patrón de círculo de diámetro 10 μm con forma de relleno de color negro y colóquelo alrededor del perímetro del pozo.
7. Edite el patrón y modifique las formas según el método de extracción deseado. Asegúrese de que el patrón deseado existe dentro del área de trabajo de la herramienta de iluminación con patrón.
8. Coloque la muestra en un soporte PDMS y pipetee el medio definido en la parte superior de la muestra para evitar la deshidratación de la muestra y proporcionar una solución portadora para las células liberadas.
9. Luego, reemplace esto con el espejo de calibración.
10. Ajuste el foco del microscopio para obtener una imagen nítida de las colonias dentro del hidrogel. Inspeccione las colonias para identificar una colonia de interés.
11. Aquí, diseñe los patrones de luz mientras la vista de la cámara muestra las colonias dentro de la muestra para probar diferentes patrones para la extracción de células.
12. Guarde el patrón definido. Después de guardar el patrón definido, seleccione la sección Control de sesión.
13. En esta sección, en la pestaña titulada con el nombre del producto de la herramienta de iluminación con patrones, agregue la secuencia guardada.
14. Después de agregar la secuencia, elija la opción para simular el patrón para ver y ajustar la ubicación deseada de la exposición.
    NOTA: La ubicación de la muestra se puede ajustar aquí para garantizar que el patrón se proyecte con precisión en el área objetivo.
15. A continuación, ajuste la intensidad de la luz al 60% y el tiempo de exposición a 40 s bajo la pestaña de control LED e inicie el proceso de exposición.
16. Monitoree la degradación del hidrogel en tiempo real y en modo de campo brillante para garantizar la liberación de la célula.
    NOTA: Evite cualquier movimiento a la muestra durante la exposición a la luz, ya que puede causar la degradación de áreas no deseadas del hidrogel, lo que resulta en contaminación cruzada.

10. Recuperación de celdas

NOTA: El procedimiento de recuperación celular es idéntico tanto para hidrogeles a granel como para matrices de micropocillos.

1. Después de una exposición a la luz de 365 nm y la liberación celular, recoja las células utilizando una jeringa de microlitro y un tubo microfluídico(Figura 2).
   NOTA: La recuperación de células debe realizarse inmediatamente después de la exposición al patrón. Esto permite la recuperación celular localizada antes de que las células liberadas se alejen del área irradiada.
2. Cambie el microscopio de campo brillante a filtro FITC o TRITC para permitir visualizar el área expuesta de la muestra a simple vista.
3. Una vez que se encuentre el área expuesta, coloque el extremo del tubo sobre el lugar irradiado. Luego cambie el filtro del microscopio de nuevo a campo brillante para monitorear la recuperación de células en tiempo real.
4. Use la jeringa conectada al otro extremo del tubo para retirar cuidadosamente las células liberadas. Retire 200 μL de la solución e inserte la solución en un tubo centrífugo de 1,5 ml para el análisis o el recubrimiento del ADN.

Figura 2: Representación esquemática del método de extracción para la recolección de células liberadas del hidrogel. Aquí, inmediatamente después de la exposición UV de 365 nm, la degradación del hidrogel y la liberación celular, el microscopio se utiliza para iluminar la muestra de hidrogel con la luz de un filtro TRITC, lo que resulta en un punto verde brillante que cubre el área donde se produjo la liberación celular. Esto ayuda al usuario a identificar la ubicación espacial para la recolección de muestras. Después de visualizar esta área, se coloca un tubo de recolección conectado a una jeringa de microlitro en este lugar y se recoge la muestra. La microscopía de campo brillante con un aumento de 10x se utiliza para monitorear el extremo de la superficie del tubo y el hidrogel en tiempo real para una recolección precisa de células. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

11. Purificación genómica del ADN y medición de la calidad del ADN

1. Utilice el kit de purificación de ADN (consulte la Tabla de materiales)para extraer ADN de aislados de bacterias.
   1. Siga las especificaciones del fabricante descritas en el manual del kit de purificación de ADN²³ hasta el último paso (paso 7), que requiere elución con Buffer AE.
   2. Para el paso de elución, siga las especificaciones del fabricante, con la diferencia de usar 100 μL de Buffer AE en lugar de 200 μL.
   3. Repita la elución una vez como se describe en el paso 11.1.2. Este paso conduce a un aumento del rendimiento general de ADN.
2. Mida la calidad del ADN mediante el uso de un espectrofotómetro UV-Vis (consulte la Tabla de materiales).
   1. Encienda el espectrofotómetro. Después de la inicialización del dispositivo, en la página de inicio, seleccione la opción dsDNA en la pantalla.
   2. A continuación, levante el brazo del pedestal y limpie la posición del pedestal con agua DI y toallitas sin pelusa.
   3. Pipete 2 μL de una solución en blanco, aquí tampón AE, en la posición del pedestal y baje suavemente el brazo del pedestal y seleccione En blanco en la pantalla.
   4. A continuación, levante el pedestal y limpie la posición del pedestal con agua DI para eliminar cualquier material residual de la medición anterior.
   5. Cargue la muestra (2 μL) en la posición del pedestal, baje el brazo del pedestal y seleccione el botón Medir en la pantalla.
   6. Rehaga los pasos 11.2.4 y 11.2.5 para todas las muestras.
   7. Una vez realizada la medición, seleccione "Finalizar experimentos" en la pantalla. Inserte la unidad flash en el dispositivo y presione "Exportar datos" en la pantalla.

12. Determinación de la viabilidad celular a partir de extractos de hidrogel y micropocillos

1. Diluir las suspensiones bacterianas por un factor de dilución de 10⁵ usando una placa de 96 pocillos.
2. Pipete 10 μL de la suspensión bacteriana diluida y punto tres veces en las placas ATGN para cada suspensión de bacterias.
3. Incline las placas para extender las celdas sobre las superficies de agar. Seque al aire las placas ATGN que contienen las suspensiones bacterianas.
4. Incubar las placas a 37 °C durante 48 h. Cuente y registre los números de las Unidades de Formación de Colonias (UFC). Cuente las tres extensiones de suspensiones bacterianas en cada placa.
   NOTA: Realice los pasos 12.1-12.4 en un gabinete de seguridad biológica para evitar la contaminación de la placa.

Resultados

Para investigar la capacidad de la luz UV para desencadenar la degradación controlada del hidrogel para la liberación celular, los hidrogeles se encapsularon primero sobre latas tioladas sin bacterias presentes. Cada hidrogel fue expuesto a tres patrones de círculos de luz replicados a diferentes intensidades y tiempos de exposición. El porcentaje de degradación del gel se calculó después de la exposición a la luz UV en cada intensidad de luz, y el tiempo de exposición se cuantificó mediante el acoplamiento de grupos tiol colgantes con un colorante de fluoresceína-5-maelimida para imágenes de fluorescencia^19,24. Un ejemplo representativo de cómo estos dos parámetros afectan la degradación del hidrogel se muestra en la Figura 3. Como es evidente, la luz modelada proporcionada por la herramienta de iluminación con patrones proporciona un control espacio-temporal de la degradación del hidrogel a una resolución que puede permitir la liberación de solo un pequeño número de células.

Figura 3: Control sobre la degradación del hidrogel. La dosis de luz UV y la tasa de degradación del hidrogel resultante se pueden ajustar a través de la herramienta de iluminación con patrones. (Recuadro) Se eligieron dos intensidades de luz diferentes para la degradación del hidrogel con patrones. Después de una exposición a la luz UV de 365 nm, los hidrogeles se etiquetaron con fluoresceína-5-maleimida para imágenes de fluorescencia. Reimpreso (adaptado) con permiso de Fattahi et al.¹⁹ Copyright 2020 American Chemical Society. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Para la extracción celular, se utilizaron diferentes patrones de luz para investigar la liberación celular(Figura 4). Aquí, las células de la bacteria Agrobacterium se encapsularon en hidrogeles a granel sobre cubiertas de vidrio tiolado, luego se cultivaron en colonias a microescala. Los hidrogeles se inspeccionaron en microscopía de campo brillante, y las microcolonias específicas se expusieron a diversos patrones de luz UV. Se observó que los diferentes patrones de exposición influyeron en la morfología de las células liberadas. Esto es potencialmente beneficioso para diversas aplicaciones. Por ejemplo, exponer un patrón de anillo alrededor de la colonia objetivo da como resultado la liberación de toda la colonia aún encapsulada en un hidrogel PEG protector y sin exposición directa a la luz UV(Figura 4A),lo que puede preservar las células y proporcionar una fácil purificación aguas abajo. Por el contrario, al exponer parte o la totalidad de la colonia a la luz UV, las células se pueden extraer como grupos celulares agregados(Figura 4B)o como células individuales libres(Figura 4C).

Figura 4: Control sobre la morfología de las células extraídas. (A) Uso de un patrón de anillo para liberar toda la colonia celular, protegida en una matriz PEG. (B) Uso de un patrón cruzado roto para la liberación celular en agregados. (C) Uso de un patrón cruzado para liberar células individuales. Reimpreso (adaptado) con permiso de Fattahi et al.¹⁹ Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Crítico en el protocolo de encapsulación es tanto la densidad de siembra celular como el grosor del hidrogel, ya que ambos parámetros pueden influir en el número de células incorporadas en el hidrogel para la observación. Para demostrarlo, las muestras de células de A. tumefaciens se encapsularon en hidrogeles de dos espesores diferentes utilizando espaciadores delgados (12,7 μm) o espaciadores gruesos (40 μm) cultivados, y se tomaron imágenes siguiendo los protocolos establecidos. Los hidrogeles más delgados dieron como resultado una densidad de microcolonia de 90 colonias/mm² en todo el hidrogel, donde se observó una superposición mínima de colonias(Figura 5A). Por el contrario, los espesores de hidrogel superiores a 12,7 μm dieron lugar a la formación de colonias superpuestas en la dirección vertical(Figura 5B),lo que puede dar lugar a la extracción de múltiples colonias. Las colonias superpuestas pueden causar contaminación cruzada durante la extracción debido a la naturaleza bidimensional del patrón de luz. Por ejemplo, una colonia superior puede ser atacada, mientras que una colonia subyacente también se extrae con ella (Figura 5C). Por lo tanto, se recomienda el uso de espaciadores de 12,7 μm para la preparación de hidrogel.

Figura 5: El espesor del hidrogel afecta la pureza de la extracción. (A)Mediante la utilización de espaciadores con un espesor de 12,7 μm para la formación de hidrogel, las colonias se forman dentro de un plano focal 10x. (B) La superposición de colonias se puede observar a un aumento de 10x si se utilizan espaciadores con espesores superiores a 12,7 μm. (C)La contaminación cruzada puede ocurrir con una superposición de colonias durante la liberación celular: (i) se utiliza un patrón de anillo para liberar una colonia celular objetivo, (ii) la colonia celular objetivo se separa del hidrogel, y (iii) se observa una segunda colonia subyacente durante la exposición a la luz debajo de la colonia objetivo. Esta colonia también se elimina, lo que resulta en contaminación cruzada. Reimpreso (adaptado) con permiso de Fattahi et al.¹⁹ Copyright 2020 American Chemical Society. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Dado el daño potencial a las bacterias con luz UV, el efecto de los micropatrones de luz UV variados sobre la viabilidad celular se estudió más a fondo utilizando el modelo, bacterias Gram-positivas (B. subtilis) y modelo, bacterias Gram-negativas (E. coli). Cada uno fue encapsulado dentro de hidrogeles a granel y cultivado en colonias a microescala de acuerdo con protocolos estándar, verificando su compatibilidad con el hidrogel. Las microcolonias específicas de tamaños equivalentes (26 ± 1 μm de diámetro) se expusieron a una dosis de luz constante (168 mJ / mm^2),ya sea en forma de patrones de círculo que exponen microcolonias enteras a la luz UV o patrones cruzados que degradan solo los bordes del hidrogel para minimizar la exposición a la luz a las células. Las células se recuperaron y se enchaparon para cuantificar la UFC/ ml recuperada de cada colonia. No se encontraron diferencias significativas en el nivel de recuperación celular(Figura 6A). Para investigar más a fondo la pureza de las células extraídas, se extrajo ADN de muestras de E. coli y se analizó utilizando un espectrofotómetro UV-Vis. Para ambos patrones, los niveles de calidad del ADN se encuentran dentro de un rango A₂₆₀/ A₂₈₀ entre 1.8 y 2.0(Figura 6B),que está en el rango ideal para la secuenciación genómica²⁵. Esto demuestra que los patrones UV utilizados para la liberación en las condiciones descritas tienen un efecto mínimo en la cantidad de células viables recuperadas de los hidrogeles a granel o en la calidad del ADN genómico después de la extracción.

Figura 6: Impacto de diferentes patrones de exposición a la luz en la viabilidad celular y la calidad del ADN de las bacterias liberadas de hidrogeles a granel. (A) Niveles de recuperación celular tanto para E. coli como para B. subtilis después de la extracción utilizando patrones cruzados y patrones circulares. Para este experimento, se realizó la extracción de colonias esféricas con el mismo diámetro (26 μm ± 1 μm) para garantizar que el número de células liberadas de cada colonia fuera equivalente. Las soluciones extraídas se enchaparon para calcular la UFC/ml adquirida a partir de cada patrón. El análisis estadístico no mostró diferencias significativas en la UFC/ML obtenida de los patrones de cruce y círculo tanto para E. coli como para B. subtilis (valor P > 0,05, n = 6 para ambas cepas). (B) Cuantificación espectrofotométrica de la calidad del ADN para células aisladas de E. coli utilizando patrones cruzados y circulares. Aquí, el análisis estadístico no mostró una diferencia significativa en la calidad del ADN para los patrones utilizados (valor P > 0,05, n = 6) (C) Imágenes de campo brillante de colonias con diámetros iguales expuestos a patrones de cruz y círculo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Las matrices de micropocillos proporcionan una interfaz alternativa de detección de laboratorio en un chip que ofrece características de detección más controladas en comparación con los hidrogeles a granel. Por ejemplo, las matrices de micropocillos permiten la siembra de bacterias en sitios de cultivo discretos donde se puede controlar el número de células en el inóculo. Las características geométricas de los micropocillos, como la profundidad y el diámetro de los pozos, también se controlan a través de métodos de microfabricación estándar. Con estos beneficios, los micropocillos han sido útiles para estudiar el crecimiento de bacterias bajo confinamiento espacial^26,y más recientemente para el descubrimiento de interacciones simbióticas y antagónicas entre diferentes especies bacterianas cuando se confinan juntas a la microescala^18. La extracción celular de pozos para el análisis genómico, como la secuenciación de amplicones 16S, es fundamental para estas aplicaciones. Usando el mismo material de hidrogel, la luz UV puede exponerse sobre un pozo que contiene células de interés, ya sea como patrones de círculo oanillo. Este último asegura la degradación del hidrogel solo en el perímetro del micropocillo para evitar la irradiación directa de las células. Para demostrar esto, las células de A. tumefaciens que expresan mCherry se sembraron en pozos, el hidrogel se unió a la matriz de micropocillos. Las células se cultivaron y luego se irradiaron con patrones de círculo o anillo. La membrana se tiñó con colorante de fluoresceína-5-maleimida. Las imágenes de fluorescencia de dos colores revelaron que tanto la membrana como las células dentro de los pozos se eliminan para ambos patrones de irradiación¹⁷. A diferencia del formato de hidrogel a granel, la extracción celular aquí solo se ha observado en forma de grupos celulares¹⁸.

Figura 7: Imágenes representativas de microscopía confocal que muestran el impacto del patrón de luz en el aislamiento celular de matrices de micropocillos. (A) Micropocillos con diámetros de 40 μm que contienen bacterias (rojo) después de la siembra y el cultivo. (B) Exposición a la luz utilizando patrones de círculos y anillos (azul). (C) La disminución de la fluorescencia roja demuestra que las células se extraen de los pozos irradiados. (D) Imagen de fluorescencia bicolor de membranas y bacterias después de la irradiación, lo que indica la eliminación tanto del hidrogel (verde) como de las bacterias (rojo) de los pozos objetivo. (E) Imagen de fluorescencia bicolor de dos colores de pila Z de pozos objetivo. La línea roja en (D) denota el plano xz fotografiado en (E), y la línea verde en (E) denota el plano xy fotografiado en (D). Las muestras en imágenes(C-E)se lavaron para la eliminación de las células liberadas, luego se fijaron y se tomaron imágenes. Barra de escala = 40 μm. Reimpreso (adaptado) con permiso de van der Vlies et al.¹⁷. Copyright 2019 American Chemical Soceity. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Para cuantificar la viabilidad celular de las bacterias y la calidad del ADN después de la extracción en este formato, las células de B. subtilis y E. coli se sembraron, cultivaron y luego se liberaron de matrices de micropocillos utilizando patrones de círculos y anillos(Figura 8A,B). Las células liberadas se enchaparon en placas de agar ATGN, y se cuantificó la calidad del ADN de las células extraídas. Para garantizar que un número constante de células estuviera presente durante cada extracción, los micropocillos con intensidades fluorescentes similares (~ 6000 U.A.) y, por lo tanto, un número similar de células fueron dirigidos para su liberación. El número de células viables extraídas utilizando un patrón de círculo no fue significativamente diferente del número de células viables extraídas utilizando el patrón de anillo para cualquiera de las bacterias(Figura 8C). Además, los niveles de calidad del ADN no fueron significativamente diferentes entre los patrones de círculo y anillo para ninguna de las bacterias(Figura 8D). Por lo tanto, al igual que los hallazgos en hidrogeles a granel, la aplicación de luz UV a la intensidad y duración especificadas aquí tuvo un impacto insignificante en la viabilidad y la calidad del ADN de las células extraídas de las matrices de micropocillos. Estos hallazgos demuestran que las células bacterianas viables se pueden recuperar selectivamente de los micropocillos con un daño mínimo para el análisis aguas abajo.

Figura 8:Impacto de diferentes patrones de exposición a la luz en la viabilidad celular y la calidad del ADN de las bacterias liberadas de las matrices de micropocillos. (A,B) Tanto para E. coli como para B. subtilis,se utilizaron patrones de círculos y patrones de anillos para la extracción celular de micropocillos de 10 μm. El patrón de círculo con un diámetro de 10 μm y el patrón de anillo con un diámetro interno de 10 μm y el diámetro exterior de 20 μm se utilizaron en este experimento para la extracción celular. Se utilizaron micropocillos con los mismos diámetros para garantizar que el número de células liberadas de cada micropocillo fuera el mismo. (C) Las soluciones extraídas se enchaparon para calcular la UFC/ml adquirida a partir de cada patrón de exposición. El análisis estadístico no mostró diferencias significativas en la UFC/ML obtenida del patrón de círculo y anillo tanto para E. coli como para B. subtilis (valor P > 0,05, n = 6 para ambas cepas). (D) La espectrofotometría se utilizó para medir la calidad del ADN de las células de E. coli y B. subtilis utilizando patrones de círculos y anillos. Aquí, el análisis estadístico no mostró ninguna diferencia significativa en la calidad del ADN para los patrones utilizados (valor P > 0,05, n = 6 para ambas cepas). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura complementaria 1: Diseño y fabricación de matrices de micropocillos. (A) Se aplicaron técnicas estándar de microfabricación para fabricar matrices de micropocillos en obleas de silicio. (B) Cada sustrato consistía en 7 matrices de pozos de 10 μm de diámetro con una profundidad de 20 μm y un paso de 30 μm. (C) Cada matriz consistía en 225 micropocillos. Esta cifra ha sido modificada a partir de Barua et al.¹⁸. Derechos de autor 2021 Frontiers Media. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

Este manuscrito demuestra el uso de hidrogeles fotodegradables para la detección y aislamiento de bacterias. El material y el enfoque permiten un cultivo de alto rendimiento, control sobre los medios de crecimiento y las condiciones de crecimiento, y extracción celular limpia y precisa de una manera directa y rentable. La extracción solo requiere un microscopio fluorescente junto con la herramienta de iluminación con patrones y se puede hacer de manera secuencial para aislar múltiples objetivos celulares. Cada extracción tarda de 5 a 10 minutos en realizarse, y se han eliminado hasta 30 colonias específicas de un solo hidrogel. Una ventaja clave del enfoque es su adaptabilidad a una variedad de formatos de ensayo diferentes, como se demuestra aquí con la detección de hidrogeles a granel y matrices de micropocillos. El proceso de separación en ambos formatos se ha utilizado con éxito para aislar bacterias que muestran un comportamiento de crecimiento único para el genotipo posterior después del cultivo y la observación microscópica, una capacidad crítica para conectar el genotipo celular con el fenotipo. Hasta la fecha, las caracterizaciones genómicas de bacterias extraídas de estas interfaces han incluido la secuenciación de amplicon 16S para identificar colecciones multiespecie de bacterias de microbiomas ambientales que generan un comportamiento de crecimiento emergente^18,y para la secuenciación del genoma completo para identificar con éxito mutaciones genéticas que causan perfiles de crecimiento raros en células presentes dentro de bibliotecas mutantes¹⁹.

El uso de hidrogeles a granel para la detección y el aislamiento celular es el formato más directo y simple. Los hidrogeles fotodegradables a granel se forman rápidamente (25 min) después de mezclar los precursores sobre cubiertas de vidrio transparente para encapsular las células en una matriz de cultivo celular 3D que se visualiza con un microscopio de fluorescencia vertical o invertido estándar. Por lo tanto, el método tiene el potencial de ser traslacional a laboratorios de microbiología comunes que no tienen recursos o experiencia en microfabricación. Un inconveniente de este formato es que las células están orientadas aleatoriamente a lo largo del hidrogel tridimensional. Por lo tanto, las células pueden aparecer fuera del plano focal cuando las imágenes con objetivos de aumento más altos y la extracción pueden ser difíciles si las colonias celulares están orientadas demasiado cerca unas de otras o si hay una superposición vertical de colonias. Depositar un hidrogel delgado (<13 μm) como se describe es fundamental para mitigar este inconveniente. La exposición en patrones de luz cruzada rotos(Figura 4B)es preferible aquí, ya que este patrón da como resultado células libres del hidrogel que tienen una exposición mínima a la luz UV y se pueden recuperar fácilmente a través del revestimiento.

En contraste, el formato de matriz de micropocillos proporciona una interfaz más bien controlada, ya que las células bacterianas se dividen en micropocillos discretos que sirven como pequeños sitios de cultivo o cocultivos^17,18,26. La dimensión, el paso y la densidad de los micropocillos se fabrican con precisión utilizando técnicas fotolitográficas estándar. En comparación con los hidrogeles a granel, las bacterias se pueden extraer de matrices de micropocillos con un mayor grado de especificidad y menor probabilidad de contaminación cruzada, ya que las células solo están presentes en lugares predefinidos, no dispersos aleatoriamente por todo el hidrogel. La concentración y las proporciones de células bacterianas en la solución de siembra también se pueden variar para controlar la cantidad y composición del inóculo micropocillo a través de un proceso de siembra que se ha caracterizado en informes anteriores^26,dando al usuario flexibilidad en el diseño experimental de la pantalla. El principal inconveniente de la detección con el formato de matriz de micropocillos es el tiempo y la experiencia adicionales necesarios para la microfabricación. Se estimó que la fabricación de micropocillos costaba ~ $ 10 por matriz, lo que incluye los costos de materiales y los gastos de salas limpias. Además, las matrices de micropocillos están hechas tradicionalmente de silicio, lo que puede causar dificultades de imagen ya que los sustratos no son transparentes. Además, una gran cantidad de dispersión de luz de la superficie de silicio puede limitar las imágenes dentro de los micropocillos y puede disminuir la resolución del patrón durante la exposición al hidrogel con luz UV de la herramienta de iluminación con patrones (visto en la Figura 8A,B). Se han fabricado micropocillos similares sobre sustratos de cuarzo transparente para abordar este tipo de limitaciones²⁷; sin embargo, esta fabricación es considerablemente más difícil. La exposición a patrones de anillo que iluminan el perímetro del pozo es preferible aquí para liberar células libres de los pozos mientras se minimiza la exposición a los rayos UV.

El problema más común que ocurre en cualquiera de los formatos es el desprendimiento del hidrogel del sustrato subyacente durante el cultivo debido a la hinchazón del hidrogel. Si esto es un problema para los hidrogeles a granel, la presencia, densidad y uniformidad de los grupos tiol en la capa de unión química (MTPS) a través de la superficie de la cubierta de vidrio base debe verificarse utilizando una técnica de caracterización de superficie adecuada (XPS, ATR-FTIR, AFM, etc.). Las bajas densidades de los grupos tiol de la superficie debido a la funcionalización ineficiente de la superficie pueden conducir a una interacción débil entre el sustrato y el hidrogel. Si se produce un bajo nivel de tiolación superficial, se debe verificar la estabilidad de la solución MTPS. Se debe tener cuidado en la limpieza inicial del portaobjetos de vidrio para asegurar una superficie limpia antes del tratamiento con MTPS, y se debe tener cuidado para garantizar el uso de tolueno anhidro durante la reacción superficial de MTPS (Protocolo Sección 4). En el caso de las matrices de micropocillos, las superficies no se tiolan, y los hidrogeles se unen a través del llenado parcial de los pozos con el hidrogel, que ancla el hidrogel al sustrato de silicio¹⁷. Si el desprendimiento de hidrogel es un problema en este sistema, se pueden grabar más micropocillos u otras características de microescala en la matriz para anclar aún más el hidrogel al sustrato para promover una unión más fuerte.

Una limitación de la técnica en cualquiera de los formatos es la estabilidad limitada de los hidrogeles en presencia de bacterias. Se ha observado que algunas bacterias, como A. tumefaciens,pueden degradar el hidrogel en el transcurso de 5-7 días^17,19,lo que limita el tiempo del experimento. La investigación actual de los mecanismos de degradación bacteriana está en marcha; se plantea la hipótesis de que los grupos éster presentes a partir de los monómeros de diacrilato están sujetos a hidrólisis mediada por bacterias y/o degradación enzimática, como se observa en otros sistemas¹⁷. El desarrollo de sustancias químicas de hidrogel más estables extenderá el tiempo que las bacterias pueden permanecer en el hidrogel y extenderá la pantalla a microorganismos con tasas de crecimiento más lentas. Una segunda limitación es que en ambos formatos, la recuperación y extracción celular ocurren en un ambiente abierto, lo que resulta en volúmenes de extracción relativamente altos (30-100 μL), que pueden ser susceptibles a la contaminación externa. Por lo tanto, se debe tener cuidado para garantizar que haya suficientes células presentes en las colonias objetivo al tiempo que se minimiza el volumen de la solución de extracción. Para obtener suficientes células para el recubrimiento y la recuperación o para la extracción de material de ADN, se observó que en hidrogeles a granel, las células deben cultivarse el tiempo suficiente para alcanzar diámetros de colonia de al menos 10 μm. Para reducir el volumen requerido para la extracción celular, se observó que el uso de una jeringa de microlitro y un tubo (Figura 2) era más eficiente que el pipeteo. El tubo permitió que los aislamientos se extrajeran del punto de liberación con mayor precisión, requiriendo menos volumen de solución y reduciendo la posibilidad de contaminación.

El trabajo futuro implica comprender el efecto de las propiedades mecánicas del hidrogel en el crecimiento celular, ya que las características mecánicas de estos hidrogeles están bien controladas por la selección de precursores de monómeros apropiados basados en PEG de varios pesos moleculares²⁸, y las interacciones mecánicas probablemente juegan un papel importante en el comportamiento de las bacterias²⁹. Como los materiales de hidrogel se pueden incorporar fácilmente en una variedad de sistemas y dispositivos diferentes, el desarrollo posterior también se centra en la integración de este material en sistemas microfluídicos. Esto reduciría la solución de extracción a volúmenes de femtolitro a picolitros, en comparación con los volúmenes tradicionales de 30-100 μL actualmente requeridos en el formato de recolección abierta. Los volúmenes de solución más pequeños reducirían en gran medida la contaminación potencial y moverían el enfoque hacia el aislamiento y la caracterización de una sola célula.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
(3-Mercaptopropyl)triethoxysilane	Sigma-Aldrich	175617-25G	> 95%
Alconox detergent powder	Alconox	1104
Ammonium sulfate	Fisher Chemical	A702-500	Certified ACS Granular
Autoclave SK300C	Yamato Scientific	18016
Bacillus subtilis 1A1135	Bacillus Genetic Stock Center	1A1135
Brightfield upright microscope	Olympus Corporation	BX51
Calcium chloride, anhydrous	Fisher Chemical	C614-500	For Desiccators Pellets, 4-20 Mesh
Centrifuge 5702	Eppendorf	5702
Citric acid monohydrate	Sigma-Aldrich	C1909-500G	ACS reagent, > 99.0%
D-Glucose (Dextrose)	VWR Amresco Life Science	0188-1KG
Dneasy Blood & Tissue Kit	Qiagen	69504	DNA purification kit
DOWSIL 184 silicone elastomer base	Dow Silicones Corporation		Storage temperature: -30-60 °C
DOWSIL 184 silicone elastomer curing agent	Dow Silicones Corporation		Storage temperature: < 32 C
EPOCH2 microplate spectrophotometer	BioTek Instruments	EPOCH2
Escherichia coli ATCC 25922	Thermo Fisher Scientific	R19020
Ethanol, anhydrous	Fisher Chemical	459844
Fisherbrand microscope cover glass	Fisher Scientific	12540A
Fisherfinest premium microscope slides plain	Fisher Scientific	12-544-4
Hydrogen peroxide solution	Sigma-Aldrich	216763-500ML	Contains inhibitor, 30 wt% in H2O
Incu-Shaker Mini	Benchmark	E5-0014-01
Isopropanol	Sigma-Aldrich	190764
Magnesium sulfate, 7-hydrate	Macron Fine Chemicals	6066-04	Avantor Performance Materials, Inc.
Methanol	Sigma-Aldrich	179337-4L	ACS reagent, > 99.8%
NanoDrop One spectrophotometer	Thermo Scientific	ND-ONEC-W
Nitrogen, compressed	Matheson	UN1066
Oxygen plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC-001-HP
Pentaerythritol tetra(mercaptoethyl) polyoxyethylene (4 arm-PEG)	NOF America Corporation	PTE-100SH	Sunbright-PTE-100SH
Phosphate buffered saline (PBS), 10X	VWR Amresco Life Science	K813-500ML	Store between 15 °C–30 °C
Polydimethyl siloxane (PDMS) Slygard 184	Dow Corning	4019862
Polygon400	Mightex	DSI-D-000
Premium microscope slides	Fisher Scientific	12-544-4	25 x 75 x 1 mm
Sodium chloride	Sigma Life Science	S5886-500G	Bioreagent, suitable for cell culture
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S8045-500G	BioXtra, > 98%, pellets (anhydrous)
Sodium phosphate monobasic dihydrate	Sigma-Aldrich	71505-250G	BioUltra, for molecular biology, > 99.0% (T)
Stainless steel thickness gage	Precision Brand Products	77739
Sulfuric acid	Sigma-Aldrich	320501-2.5L
Toluene, anhydrous, 99.8%	Sigma-Aldrich	244511-1L	Anhydrous, > 99.8%
Trichloro (1H,1H,2H,2H perfluorooctyl) silane (TPS), 97%	Sigma-Aldrich	448931-10G
Tryptic soy broth	Sigma-Aldrich	22092-500G	For microbiology
Ultrasonic sonicator	Fischer Scientific	FS-110H