Aislamiento y caracterización de células endoteliales sinusoidales sinusoidales hepáticas primarias de ratón

Resumen

Aquí describimos y demostramos un protocolo para el aislamiento primario de células endoteliales sinusoidales sinusoidales hepáticas (LSEC) del ratón. El protocolo se basa en la perfusión de colagenasa hepática, la purificación de células no parentales por centrifugación de baja velocidad y la selección de perlas magnéticas CD146. También fenotipo y caracterizamos estos LSEC aislados mediante citometría de flujo y microscopía electrónica de barrido.

Resumen

Las células endoteliales sinusoidales hepáticas (LSEC) son células endoteliales especializadas ubicadas en la interfaz entre la circulación y el parénquima hepático. Los LSEC tienen una morfología distinta caracterizada por la presencia de fenestras y la ausencia de membrana basal. Los LSEC desempeñan un papel esencial en muchos trastornos patológicos en el hígado, incluida la desregulación metabólica, la inflamación, la fibrosis, la angiogénesis y la carcinogénesis. Sin embargo, poco se ha publicado sobre el aislamiento y la caracterización de los LSEC. Aquí, este protocolo discute el aislamiento de LSEC de ratones sanos y sin enfermedad del hígado graso (NAFLD). El protocolo se basa en la perfusión de colagenasa del hígado de ratón y perlas magnéticas de selección positiva de células no pares para purificar LSEC. Este estudio caracteriza los LSEC utilizando marcadores específicos por citometría de flujo e identifica las características fenotípicas características mediante microscopía electrónica de barrido. Los LSEC aislados siguiendo este protocolo se pueden utilizar para estudios funcionales, incluidos ensayos de adhesión y permeabilidad, así como estudios posteriores para una vía particular de interés. Además, estos LSEC se pueden agrupar o utilizar individualmente, lo que permite la generación de datos multiómicos, incluida la generación de datos RNA-seq a granel o unicelular, proteómica o fosfoprotómica, y el ensayo de cromatina accesible a la transposasa mediante secuenciación (ATAC-seq), entre otros. Este protocolo será útil para los investigadores que estudian la comunicación de los LSEC con otras células hepáticas en la salud y la enfermedad y permitirá una comprensión profunda del papel de los LSEC en los mecanismos patógenos de la lesión hepática aguda y crónica.

Introducción

Las células endoteliales sinusoidales hepáticas (LSAC) recubren las paredes sinusoides hepáticas y son las células no parenquimatosas más abundantes en el hígado¹. Los LSEC se distinguen de otras células endoteliales capilares en otras partes del cuerpo por la presencia de fenestras y la falta de una membrana basal clásica o un diafragma ^2,3. Por lo tanto, los LSEC poseen características fenotípicas y estructurales distintivas que mejoran su permeabilidad y capacidad endocítica para eliminar una variedad de macromoléculas circulantes, incluidos los lípidos y las lipoproteínas. Los LSEC ....

Protocolo

Los protocolos con animales se llevaron a cabo según lo aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de Mayo Clinic. Los ratones machos C57BL / 6J de ocho semanas de edad fueron comprados en el Laboratorio Jackson. Los ratones fueron alojados en una instalación de ciclo de luz-oscuridad de 12:12 h con temperatura controlada con acceso gratuito a la dieta.

1. Preparación de un plato o plato de cultivo recubierto de colágeno

1. Para producir 50 ml de ácido acético de 0,02 mol/L, añadir 0,6 ml de ácido acético glacial a 49,4 ml de H₂O.
2. Hacer 50 μg/ml de colágeno tipo I e....

Resultados

Esquemas experimentales y configuración de equipos:
En este protocolo, el hígado de ratón se digirió utilizando un circuito de perfusión cerrado, luego las células no parentales y los hepatocitos se separaron mediante centrifugación de baja velocidad a 50 x g durante 2 min. Los LSEC primarios se aislaron utilizando la selección de perlas magnéticas CD146 de la fracción no parnquimatosa. Los esquemas experimentales se muestran en la Figura 1A. La cánula.......

Discusión

En el manuscrito actual, describimos un protocolo para el aislamiento de LSEC del hígado de ratón que consiste en la perfusión de colagenasa de dos pasos y la posterior clasificación celular activada magnéticamente (MACS). Este protocolo consta de los siguientes tres pasos: (1) Perfusión a través del PV con un tampón libre de calcio seguido de un tampón que contiene colagenasa para lograr la dispersión de las células hepáticas; (2) Exclusión de hepatocitos con centrifugación de baja velocidad; y (3) selecci.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
2.0-inch 20 G Intra Venous (IV) catheter	Terumo, SOmerset, NJ, USA	SR-OX2051CA
2–3-inch perfuion tray with a hole in the center			customized; made in house
405/520 viability dye	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-110-205
4-inch regular curved dressing forceps	Fisher Brand	FS16-100-110
5-0 Perma-Hand silk suture	Ethicon, Raritan, NJ, USA	A182H
Anti-stabilin-2 (Mouse) mAb-Alexa Fluorà 488	MBL International, Woburn, MA, USA	D317-A48
BSA stock	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-091-376
Anti-CD146 (LSEC)-PE, anti-mouse	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-118-407
CD146 (LSEC) MicroBeads, mouse	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-092-007
Anti-CD45-Viogreen, anti-mouse	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-110-803
Collagen type I	Corning, Corning, NY, USA	354236
Collagenase II	Gibco, Waltham, MA, USA	17101-015
Endothelial cells growth medium	ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, USA	211-500
FcR blocking reagent, mouse	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-092-575
FlowJo software, version 10.6	Becton, Dickinson and Company
Hardened Fine scissors	F.S.T, Foster city, CA, USA	14091-11
Heated (37 °C) and humidified recirculating perfusion apparatus equipped with Oxygen injection at a rate of 10psi.			customized; made in house
Hitachi S 4700 scanning electron microscope	Hitachi Inc, Pleasanton, CA, USA	SEM096
LS columns	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-042-401
MACS pre-separation filters (70 μm)	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-095-823
MACS rinsing buffer	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-091-222
MACS Smart Strainer (70 μm)	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-098-462
MACSQunt flow cytometer	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany
Millicell Cell Culture Insert	Millipore Sigma, Burlington, MA, USA	PITP01250
Nexcelom cell counter	Nexcelom bioscience, Lawrence, MA, USA	Cellometer Auto T4 Plus
Percoll	GE Healthcare, Chicago, IL, USA	17-0891-01
Surgical scissors	F.S.T, Foster city, CA, USA	14001-12
Very small curved dressing forceps	F.S.T, Foster city, CA, USA	11063-07