In vivo Control optogenético inalámbrico del comportamiento motor calificado

Resumen

El presente protocolo describe cómo utilizar la optogenética inalámbrica combinada con videografía de alta velocidad en una sola tarea de alcance a agarre de pellets para caracterizar los circuitos neuronales involucrados en el rendimiento del comportamiento motor hábil en ratones que se mueven libremente.

Resumen

Las habilidades motoras finas son esenciales en la vida cotidiana y pueden verse comprometidas en varios trastornos del sistema nervioso. La adquisición y realización de estas tareas requieren integración sensorio-motora e implican un control preciso de los circuitos cerebrales bilaterales. La implementación de paradigmas conductuales unimanuales en modelos animales mejorará la comprensión de la contribución de las estructuras cerebrales, como el cuerpo estriado, al comportamiento motor complejo, ya que permite la manipulación y el registro de la actividad neuronal de núcleos específicos en condiciones de control y enfermedades durante el desempeño de la tarea.

Desde su creación, la optogenética ha sido una herramienta dominante para interrogar al cerebro al permitir la activación o inhibición selectiva y dirigida de las poblaciones neuronales. La combinación de optogenética con ensayos conductuales arroja luz sobre los mecanismos subyacentes de funciones cerebrales específicas. Los sistemas inalámbricos montados en la cabeza con diodos emisores de luz (LED) miniaturizados permiten el control optogenético remoto en un animal que se mueve completamente libremente. Esto evita que las limitaciones de un sistema cableado sean menos restrictivas para el comportamiento de los animales sin comprometer la eficiencia de emisión de luz. El protocolo actual combina un enfoque de optogenética inalámbrica con videografía de alta velocidad en una tarea de destreza unimanual para diseccionar la contribución de poblaciones neuronales específicas al comportamiento motor fino.

Introducción

El comportamiento hábil motor está presente durante la mayoría de los movimientos realizados por nosotros, y se sabe que se ve afectado en varios trastornos cerebrales 1,2,3,4,5,6. La implementación de tareas que permitan estudiar el desarrollo, el aprendizaje y el rendimiento de movimientos hábiles es crucial para comprender los fundamentos neurobiológicos de la función motora, especialmente en modelos de lesiones cerebrales, trastornos neurodegenerativos y del neurodesarrollo ^{2,7,8,9,10,11,12,13} . Alcanzar y recuperar objetos se realiza de forma rutinaria en las acciones de la vida cotidiana, y es una de las primeras habilidades motoras adquiridas durante el desarrollo temprano y luego refinadas a través de los años ^5,6. Comprende un comportamiento complejo que requiere procesos sensorio-motores como la percepción de las características del objeto, la planificación del movimiento, la selección de la acción, la ejecución del movimiento, la coordinación corporal y la modulación de la velocidad 7,14,15,16. Por lo tanto, las tareas unimanuales de alta destreza requieren la participación de muchas estructuras cerebrales de ambos hemisferios 16,17,18,19,20,21,22. En ratones, la tarea de alcance a agarre de un solo pellet se caracteriza por varias fases que pueden controlarse y analizarse por separado ^7,13,23. Esta característica permite estudiar la contribución de subpoblaciones neuronales específicas en diferentes etapas de adquisición y rendimiento conductual y proporciona una plataforma para estudios detallados de los sistemas motores 13,23,24. El movimiento se produce en un par de segundos; por lo tanto, la videografía de alta velocidad debe utilizarse para el análisis cinemático en distintas etapas de la trayectoria motora calificada ^7,25. Se pueden extraer varios parámetros de los videos, incluida la postura corporal, la trayectoria, la velocidad y el tipo de errores²⁵. El análisis cinemático se puede utilizar para detectar cambios sutiles durante la manipulación optogenética inalámbrica ^7,23.

El uso de diodos emisores de luz (LED) miniaturizados para entregar luz a través de un sistema inalámbrico montado en la cabeza permite tener un control optogenético remoto mientras el animal realiza la tarea. El controlador optogenético inalámbrico acepta comandos de disparo continuo o de un solo pulso de un estimulador y envía señales infrarrojas (IR) a un receptor conectado al LED miniaturizado^23,26. El protocolo actual combina este enfoque de optogenética inalámbrica con videografía de alta velocidad de una tarea de destreza para diseccionar el papel de poblaciones neuronales específicas durante el desempeño del comportamiento motor fino²³. Dado que es una tarea unimanual, permite evaluar la participación de estructuras en ambos hemisferios. Tradicionalmente, el cerebro controla el movimiento del cuerpo de una manera altamente asimétrica; sin embargo, las tareas de alta destreza requieren una coordinación y control cuidadosos de muchas estructuras cerebrales, incluidos los núcleos ipsilaterales y la contribución diferencial de las subpoblaciones neuronales dentro de los núcleos ^{10,20,21,22,23}. Este protocolo muestra que las estructuras subcorticales de ambos hemisferios controlan la trayectoria de la extremidad anterior²³. Este paradigma puede ser adecuado para estudiar otras regiones del cerebro y modelos de enfermedad cerebral.

Protocolo

Los procedimientos relacionados con el uso de animales se llevaron a cabo siguiendo las directrices locales y nacionales y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales correspondiente (Protocolo VLH151-19 del Instituto de Fisiología Celular IACUC). En el protocolo actual se utilizaron ratones machos transgénicos Drd1-Cre²⁷, 35-40 días postnatal con fondo C57BL/6. Los ratones se mantuvieron bajo las siguientes condiciones: temperatura 22±1 °C; humedad 55%; horario de luz 12/12 h con las luces apagadas a las 19 horas y fueron destetados en el postnatal día 21. Los cachorros destetados fueron alojados en grupos del mismo sexo de 2 a 5 años. Los animales fueron alojados en viviendas estáticas con tapas de microbarrera. La ropa de cama consistía en virutas de álamo temblón estéril. Se proporcionaron gránulos de roedores y agua purificada con RO ad libitum, excepto cuando se observó.

1. Procedimientos quirúrgicos

1. Preparar una cánula LED a la longitud deseada según las coordenadas dorsoventrales de la estructura de interés (idealmente 0,5 mm más larga para dar cuenta del grosor del cráneo, para el estriado dorsolateral 3,5 mm) (Figura 1).
   1. Corte la fibra de vidrio a una longitud más larga que el tamaño final deseado, muela la punta de la fibra a la longitud objetivo con papel de lija áspero y, finalmente, pula la punta de la fibra con papel de lija fino.
      NOTA: La cánula LED es una fibra óptica de vidrio de 250 μm de diámetro unida a un receptor de infrarrojos (ver Tabla de Materiales).
2. Tire de las pipetas de vidrio (1,14 mm de diámetro exterior, 0,53 mm de diámetro interior y 3,5 de longitud) para el nanoinyector con un extractor horizontal (consulte la Tabla de materiales) y guárdelas para más adelante. Programe el tirador en un bucle para obtener un diámetro de punta de 15-20 μm con una pendiente gradual larga y cónica (4-5 mm).
3. Prepare el área de cirugía desinfectando a fondo el aparato estereotáxico, la campana, el microinyector (consulte la Tabla de materiales) y las superficies circundantes con etanol al 70%.
   NOTA: Un aparato estereotáxico de ratón es esencial para inyectar Adeno Associated Virus (AAV) con precisión y colocar la cánula LED en la región de interés.
4. Use el equipo de protección personal apropiado para el procedimiento, incluida una bata de laboratorio limpia o una bata quirúrgica desechable, guantes estériles, máscara facial y gorra desechable para la cabeza.
5. Coloque el equipo necesario cerca del área de cirugía, como herramientas quirúrgicas estériles, puntas de algodón, soluciones, micropipeta, puntas de pipeta, capilares, microllenado con aceite mineral y marcador.
6. Llene una pipeta para microinyecciones con aceite mineral y colóquela en el microinyector. Asegúrese de que el microinyector esté funcionando correctamente expulsando un poco de aceite mineral.
   NOTA: Todos los instrumentos utilizados durante la cirugía deben ser esterilizados en autoclave y estériles. Se debe utilizar la técnica aséptica.
7. Anestesiar a los animales con isoflurano gaseoso 4-5% para inducir anestesia y 1,2% durante toda la cirugía con 0,5-1 L/min de oxígeno puro. La cirugía comienza solo después de que el animal haya alcanzado un punto de anestesia profunda, evaluado por la ausencia de retirada de la pata después de un ligero pellizco.
   1. Controle continuamente la frecuencia respiratoria y la temperatura del animal. Mantenga la temperatura corporal mediante una almohadilla térmica a 34 °C.
8. Aplicar una pomada oftálmica. Elimina el vello del cuero cabelludo con un trímero y crema depilatoria. Limpie el cuero cabelludo con hisopos de algodón que tengan 8% de povidona yodada (ver Tabla de materiales) y 70% de etanol alternados tres veces cada uno.
9. Coloque el ratón en el aparato estereotáxico y asegure la cabeza, asegurando que el cráneo esté nivelado en los ejes mediolateral y anterior-posterior.
10. Haga una incisión de 1 cm con un bisturí a través del cuero cabelludo a nivel de los ojos a lo largo del eje sagital. Retraiga la piel para exponer el cráneo y limpie el periostio con hisopos de algodón.
11. Limpie la superficie del cráneo con solución salina e hisopos de algodón estériles. Resuelva cualquier sangrado en la superficie utilizando lanzas oculares absorbentes estériles (consulte la Tabla de materiales) o material absorbente estéril similar.
12. Aplica una gota de peróxido de hidrógeno al 2,5% con un hisopo de algodón y deja que actúe durante unos segundos para que las suturas del cráneo sean visibles y tengan una mejor referencia. Después de unos segundos, limpie a fondo con un hisopo de algodón limpio.
13. Con la pipeta de vidrio (15 μm de diámetro de punta final), localice bregma y lambda para comprobar que el cráneo está nivelado en el eje anterior-posterior.
    NOTA: Se recomienda tener un microscopio estereoscópico o un microscopio USB para ver la punta de la pipeta de vidrio. En caso de que sea necesario, ajuste la altura del soporte bucal para nivelar el cráneo.
14. Mueva el capilar hacia las coordenadas anterior-posterior (AP) y medial-lateral (ML) seleccionadas (EStriado dorsolateral AP 1,2 mm, ML 2,28 mm). Pinte un punto de referencia en el cuero cabelludo por encima de las coordenadas seleccionadas con un marcador estéril.
15. En el punto de referencia, realice una craneotomía de ~ 1 mm de diámetro aplicando una presión suave al cráneo con una herramienta rotativa estéril o un taladro dental a una velocidad baja a media con una broca dental redonda pequeña (consulte la Tabla de materiales).
16. Cargue el capilar con 300-400 nL de virus adenoasociados dependientes de Cre (AAV) como AAV1-dflox-hChR-2-mCherry para expresar channelrodopsina o un AAV para expresar solo la proteína reportera (por ejemplo, mCherry) como control en la región de interés (ver Tabla de materiales). Verifique que la punta no esté obstruida, luego introduzca la pipeta de vidrio en el cerebro en las coordenadas dorso-ventrales (DV) deseadas (estriado dorsolateral DV -3.35 mm).
    1. Inyecte 200 nL utilizando un inyector automático a una velocidad de 23 nL/s. Espere 10 minutos después de terminar la inyección, retire la pipeta de vidrio lentamente para evitar derrames.
       NOTA: Es posible utilizar una aguja de 30 G para inyectar con el microinyector adecuado.
17. Limpie y seque cualquier residuo con hisopos de algodón.
18. Conecte la cánula LED de vidrio estéril al brazo estereotáxico y calibre las coordenadas utilizando bregma como referencia. Inserte la cánula muy lentamente (300 μm/min) para evitar daños en los tejidos y colóquela a 100 μm por encima del lugar de la inyección.
19. Una vez que la cánula LED esté en su lugar, agregue una gota (100 μL) de adhesivo tisular en el borde de la craneotomía.
20. Prepare la mezcla de cemento dental (consulte la Tabla de materiales) siguiendo las instrucciones del fabricante para fijar la fibra al cráneo.
    NOTA: Brevemente, use un plato de porcelana refrigerada para tener más tiempo de trabajo antes de que el cemento se cuaje. Agregue 2 cucharadas de polvo transparente de resina al plato de porcelana, agregue 4 gotas de base rápida y 1 gota de catalizador, luego mezcle bien. La relación polvo/líquido se puede ajustar si se necesita una viscosidad más delgada o más gruesa.
21. Usando un cepillo estéril, aplique la mezcla de cemento dental alrededor del conector de la cánula poco a poco, construyendo capas hasta que el cráneo esté cubierto y el conector esté firmemente unido al cráneo, dejando los pines completamente libres. Evite que el cemento dental entre en contacto con la piel del ratón.
22. Dejar secar completamente.
23. Cierre la piel alrededor del implante con adhesivo tisular (consulte la Tabla de materiales).
24. Coloque el ratón en una jaula de recuperación sobre una almohadilla térmica a 33 ° C. Controle la presencia de uno o más de los siguientes signos de dolor / incomodidad: 1) Encorvado, falta o reducción de la actividad motora, 2) Falta de aseo reflejado en un pelaje sucio descuidado, 3) Lamido o rascado excesivo, enrojecimiento en el sitio de la incisión, 4) comportamiento agresivo, 5) anorexia o deshidratación, y 6) Falta de formación de nidos.
    NOTA: Mantenga el ratón enjaulado individualmente durante todos los procedimientos para evitar la separación del implante. En caso de desprendimiento de la cánula, realizar la eutanasia inyectando 150 mg/kg de pentobarbital sódico seguido de decapitación después de alcanzar la anestesia profunda.
25. Inyecte meloxicam por vía subcutánea (SC) 1 mg/kg una vez al día durante tres días después de la cirugía para proporcionar analgesia.
26. Espere al menos 7 días para la recuperación completa y 14 días para la expresión de opsina antes de otros procedimientos.
    NOTA: Realice un seguimiento postoperatorio cada 12 horas durante tres días, luego revise a los animales todos los días hasta el día de la eutanasia al final del experimento.

2. Entrenamiento de alcance a agarre

1. El día 7 después de la cirugía, comience el protocolo de privación de alimentos²⁸. Pesa a los ratones durante tres días consecutivos para determinar su peso corporal promedio ad libitum. Luego, programe restricciones de alimentos para que los animales reciban suficientes nutrientes para mantener aproximadamente el 90% y no menos del 85% del peso corporal.
   NOTA: Esto se logra proporcionando 2.5-3 g de alimentos al día. Controle el peso de los animales diariamente y califique el bienestar general observando el comportamiento y la apariencia de los animales, por ejemplo, la apariencia del pelaje y los ojos. Utilice el sistema de puntuación de la condición corporal de la Referencia²⁹.
2. Durante los períodos previos al entrenamiento, el entrenamiento y las pruebas, proporcione a cada ratón 20 gránulos (20 mg de gránulos con sabor a chocolate sin polvo) al día (consulte la Tabla de materiales) (consumidos durante la tarea o después) además de los gránulos de alimentos estándar.
3. Tres días antes de la habituación, disperse 0,4 g / animal / día 20 mg de gránulos sin polvo con sabor a chocolate en sus jaulas caseras, para que los ratones se familiaricen con los gránulos que sirven como recompensa durante la tarea de alcanzar para agarrar.
4. Habitúe a los ratones colocándolos 10 minutos en la cámara de prueba un día antes del entrenamiento previo con gránulos esparcidos en el piso de la cámara (Figura 1A).
5. Permita la comida diariamente después del entrenamiento y las pruebas. Mantenga un horario similar todos los días.
6. En el primer día de preentrenamiento, coloque a los ratones en la cámara de alcance para agarrar y observe desde el frente. Coloque los pellets frente a la cámara cerca de la abertura para que comiencen a consumir los pellets. En esta etapa, a los ratones se les permite agarrar los gránulos en cualquier forma.
7. En el segundo día de preentrenamiento, coloque los gránulos cada vez más lejos de la abertura hasta llevarlos a la hendidura (1 cm de la abertura) para que los ratones puedan dar forma a su movimiento de alcance a agarre (Figura 1C).
8. Entrene a los ratones para que corran a la parte trasera de la jaula y regresen a la abertura de la jaula para recibir el próximo pellet de alimento como estrategia para individualizar los ensayos.
   NOTA: Esto se puede lograr esperando hasta que el ratón esté en la parte trasera de la jaula antes de colocar un gránulo en la hendidura para cada ensayo.
9. Coloque los gránulos para que los agarre su pata derecha o izquierda.
   NOTA: Los ratones comienzan a usar preferentemente una pata para agarrar, que se utilizará los siguientes días de entrenamiento y pruebas.
10. Entrene a los animales durante 6 días en sesiones diarias que duran 20 ensayos o hasta que transcurra un máximo de 10 minutos. A partir del día 2 de entrenamiento, coloque el receptor simulado (dimensiones 12 x 18 x 7 mm, 1 g, ver Tabla de Materiales), para que los ratones se habitúen al peso mientras realizan la tarea (Figura 1B). Cada día anota el número de pruebas de aciertos y errores.
11. Grabe el comportamiento con una cámara normal y capture 30-60 fotogramas/s desde la parte frontal de la cámara. Además, se puede colocar un espejo debajo de la cámara de entrenamiento en un ángulo de 45 ° para monitorear la postura de los animales (Figura 1D, E).
12. Para el análisis cinemático post-hoc (Figura 2), monte una cámara de alta velocidad (ver Tabla de Materiales) en un ángulo de 45° para grabar desde el lado de la jaula. Si se requiere un análisis 3D, coloque una segunda cámara de alta velocidad para grabar en un ángulo de 35 ° desde la parte frontal de la cámara; ambas cámaras deben colocarse en el lado derecho o izquierdo de la jaula dependiendo de la inclinación lateral de los animales y deben capturar a la misma velocidad de fotogramas y sincronizarse⁷ (Figura 3D, E).
13. Ajuste las cámaras de alta velocidad a 100 fotogramas/s con una resolución de 376 x 252 píxeles o más si es posible. Coloque las paredes de espuma de poliestireno blanca detrás de los lados y la parte posterior de la cámara para reducir el fondo y aumentar el contraste (Figura 1E).
14. El día de la prueba, reemplace la unidad simulada con un receptor de infrarrojos para la estimulación optogenética inalámbrica (Figura 1B, C).
15. Cuando los ratones comiencen a alcanzar, gire la cánula LED manualmente con el control remoto para tener una estimulación continua durante el tiempo que se realiza el comportamiento y por no más de 2 s. Programar un paradigma de estimulación automática es preferible. El dispositivo de estimulación activa un LED de 470 nm (luz azul) con intensidad en la punta de 1,0 mW/mm².
16. Recopile los videos para un examen más detallado, incluida la puntuación y el análisis cinemático.

3. Confirmación histológica post-hoc

1. Al finalizar un experimento, confirme la expresión viral y la colocación de la cánula LED. Anestesiar al animal con un cóctel de ketamina 100 mg/kg y xilazina 10 mg/kg. Una vez que el ratón presenta signos de anestesia profunda (paso 1.7), perfunda con solución salina tamponada con fosfato helado (PBS) seguida de PFA al 4%.
2. Retire la cánula implantada con cuidado agarrando firmemente el conector con fórceps y tirando suavemente hacia arriba.
3. Extraer y post-fijar el cerebro durante 24 h en 4% PFA²³.
4. Realice lavados de 3 a 10 minutos con PBS.
5. Cortar el cerebro en secciones de 50 μm usando un microtomo (ver Tabla de Materiales).
6. Monte las secciones en diapositivas con medios de montaje rígidos con DAPI para teñir núcleos y cubrir diapositivas.
7. Después del secado, observe las secciones bajo el microscopio confocal y verifique la ubicación de la cánula implantada y la expresión de Ch2R fusionada con cualquier proteína fluorescente.

Resultados

La tarea de alcanzar a la comprensión es un paradigma ampliamente utilizado para estudiar la formación, el aprendizaje, el rendimiento y la cinemática del movimiento de habilidades finas bajo diferentes manipulaciones experimentales. Los ratones aprenden a ejecutar la tarea en un par de días y logran más del 55% de precisión alcanzando una meseta después de 5 días de entrenamiento (Figura 2A, B). De manera similar a lo que se ha informado anteriormente, un porcentaje...

Discusión

El uso de la manipulación optogenética de poblaciones neuronales en paradigmas conductuales bien definidos está avanzando en nuestro conocimiento sobre los mecanismos subyacentes al control motor ^7,23. Los métodos inalámbricos son especialmente adecuados para tareas que requieren pruebas en múltiples animales o libre movimiento^34,35. Sin embargo, a medida que se refinan las técnicas y los dispositi...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anaesthesia machine	RWD	R583S	Isoflurane vaporizer
Anesket	PiSA		Ketamine
Breadboard	Thorlabs	MB3090/M	Solid aluminum optical breadboard
Camera lense	Canon		50mmf/ 1.4 manual focus lenses (c-mount)
Camera system	BrainVision	MiCAM02	Camera controller and synchronizer
Cotton swabs
CS solution	PiSA		Sodium chloride solution 9%
Customized training chamber	In house
Drill bit #105	Dremel	2 615 010 5AE	Engraving cutter
Dustless precission chocolate pellets	Bio-Serv	F05301
Ethyl Alcohol	J.T.  Baker	9000-02	Ethanol
Eyespears	Ultracell	40400-8	Eyespears of absorbent PVA material
Fluriso	VetOne	V1 502017-250	Isoflurane
Glass capillaries	Drumond Scientific	3-000-203-G/X	Pipettes for NanoJect II
Hidrogen peroxide	Farmacom		Antiseptic
High-speed camera	BrainVision	MiCAM02-CMOS	Monochrome high-speed cameras
Infrared emmiter	Teleopto
Insulin syringe
LED cannula	Teleopto	TelC-c-l-d	LED cannula 250um 487nm light
Micropipette 10 uL	Eppendorf	Z740436
Micro-pipette puller	Sutter	P-87	Horizontal puller
Microscope LSM780	Zeiss		Confocal microscope
Microtome
Mock receiver	Teleopto
NanoJect II	Drumond Scientific	3-000-204	Micro injector
Oxygen tank	Infra	na
pAAV-EF1a-double.floxed-hChR2(H134R)-mCherry-WPRE- HGHpA	Addgene	20297	Viral vector for ChR-2 expression
Parafilm
Paraformaldehyde	Sigma	P-6148
Phosphate saline buffer	Sigma	P-4417	Phosphate saline buffer tablets
Pipette tips 10 uL	ThermoFisher	AM12635	0.5-10 uL  volume
Pisabental	PiSA		Sodium pentobarbital
Plexiglass	commercial		Acrylic sheet
Povidone iodine	Farmacom		Antiseptic
Procin	PiSA		Xylacine
Puralube	Perrigo pharma	1228112	Eye lubricant 15% mineral oil/85% petrolatum
Rotary tool	Kmoon	Mini grinder	Standard
Scalpel
Scalpel blade
Stereotaxic apparatus	Stoelting	51730D	Digital apparatus
Super-Bond C&B	Sun Medical		Dental cement
Surgical dispossable cap
Teleopto remote controller	Teleopto
Tg Drd1-Cre mouse line	Gensat	036916-UCD	Transgene insertion FK150Gsat
Tissue adhesive	3M Vetbond	1469SB
TPI Vibratome 1000 plus	Peico		Microtome
Vectashield mounting media with DAPI	Vector laboratories	H-1200	Mounting media
Wireless receiver	Teleopto	TELER-1-P