Generación de un xenoinjerto ortotópico de células de cáncer de páncreas mediante inyección guiada por ultrasonido

Resumen

Presentamos un protocolo para generar un modelo de cáncer de páncreas ortotópico mínimamente invasivo mediante inyección guiada por ultrasonido de células de cáncer de páncreas humano y el posterior monitoreo del crecimiento tumoral in vivo por imagen ecográfica.

Resumen

El cáncer de páncreas (CaP) representa uno de los tipos de cáncer más mortales en todo el mundo. Las razones de la malignidad PCa se basan principalmente en su comportamiento maligno intrínseco y alta resistencia a los tratamientos terapéuticos. De hecho, a pesar de muchos esfuerzos, tanto la quimioterapia estándar como las terapias diana innovadoras han fracasado sustancialmente cuando se pasaron de la evaluación preclínica al entorno clínico. En este escenario, se necesita urgentemente el desarrollo de modelos preclínicos de ratón que imiten mejor las características in vivo de la CaP para probar los fármacos recientemente desarrollados. El presente protocolo describe un método para generar un modelo de ratón de CaP, representado por un xenoinjerto ortotópico obtenido por inyección guiada por ultrasonido de células tumorales pancreáticas humanas. Utilizando un protocolo tan confiable y mínimamente invasivo, también proporcionamos evidencia de injerto in vivo y desarrollo de masas tumorales, que pueden ser monitoreadas por imágenes de ultrasonido (US). Un aspecto destacable del modelo de CaP descrito aquí es el lento desarrollo de las masas tumorales a lo largo del tiempo, lo que permite identificar con precisión el punto de partida de los tratamientos farmacológicos y un mejor seguimiento de los efectos de las intervenciones terapéuticas. Además, la técnica descrita aquí es un ejemplo de implementación de los principios de las 3R, ya que minimiza el dolor y el sufrimiento y mejora directamente el bienestar de los animales en la investigación.

Introducción

La CaP, y su forma más común, el adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC), es una de las causas más comunes de muerte relacionada con el cáncer con una tasa de supervivencia a 1 año inferior al 20 % y una tasa de supervivencia a 5 años del 8 %, independientemente del estadio ^1,2. La enfermedad es casi siempre mortal, y se prevé que su incidencia crezca continuamente en los próximos años, a diferencia de otros tipos de cáncer, cuya incidencia está disminuyendo³. Factores como la detección tardía del cáncer, la tendencia a la progresión rápida y la falta de terapias específicas conducen a un mal pronóstico de la CaP⁴. Se han obtenido grandes avances en la investigación del cáncer, gracias al desarrollo de modelos preclínicos de ratón más precisos. Los modelos han proporcionado información adecuada para la comprensión del mecanismo molecular subyacente al cáncer y para el desarrollo de nuevos tratamientos⁵. Estos avances se aplican mal a la CaP, que, a pesar de los grandes esfuerzos recientes, sigue siendo resistente a las terapias quimioterapéuticas actuales¹. Por estas razones, el desarrollo de nuevos enfoques para mejorar las perspectivas de los pacientes es obligatorio.

A lo largo de los años, se han desarrollado muchos modelos de ratón PCa, incluidos los xenoinjertos, que son los modelos más utilizados en la actualidad⁵. Los modelos de xenoinjerto se clasifican como heterotópicos subcutáneos y ortotópicos, dependiendo de la ubicación de las células tumorales implantadas. Los xenoinjertos heterotópicos subcutáneos son más fáciles y baratos de lograr, pero pasan por alto ciertos rasgos característicos de la CaP (es decir, el peculiar microambiente tumoral, caracterizado por la acumulación de tejido fibrótico, hipoxia, acidez y angiogénesis)^6,7. Esto explica por qué los xenoinjertos subcutáneos a menudo no proporcionan datos sólidos para los tratamientos terapéuticos, lo que lleva a fracasos cuando se traduce al entorno clínico⁸. Por otro lado, los xenoinjertos ortotópicos se parecen más al microambiente tumoral, lo que lleva a una mejor imitación del desarrollo natural de la enfermedad. Además, los xenoinjertos ortotópicos son más adecuados para estudiar el proceso metastásico y las características invasivas de la CaP, que casi no ocurren en modelos subcutáneos⁹. En general, hoy en día se prefieren los modelos de ratón xenoinjerto ortotópico para realizar pruebas preclínicas de drogas ^9,10. Los xenoinjertos ortotópicos generalmente dependen de procedimientos quirúrgicos para implantar células o piezas muy pequeñas de tejido tumoral en el páncreas. De hecho, varios artículos basados en modelos quirúrgicos de CaP han sido publicados en las últimas décadas¹¹. Sin embargo, la calidad y el resultado del procedimiento quirúrgico para el establecimiento de un modelo de tumor ortotópico dependen en gran medida de la habilidad técnica del operador. Otro punto clave para un xenoinjerto ortotópico de PCa exitoso para un enfoque clínico traslacional es la posibilidad de establecer una enfermedad localizada con una cinética de crecimiento predecible.

Para abordar estos problemas, aquí describimos un procedimiento innovador para producir un xenoinjerto ortotópico de PCa, explotando la inyección guiada por ultrasonido (US) de células PCa humanas en la cola del páncreas en ratones inmunodeficientes. Este procedimiento genera un modelo de ratón PCa fiable. El crecimiento del tumor es seguido in vivo por imágenes de EE.UU.

Protocolo

El presente protocolo recibió la aprobación del Ministerio de Salud italiano con el número de autorización 843/2020-PR. Con el fin de garantizar condiciones asépticas, los animales se mantuvieron dentro de la sala de barrera del vivero de animales de investigación (Ce.S.A.L.) de la Universidad de Florencia. Todos los procedimientos se realizaron en el mismo espacio donde se alojaron los ratones en las instalaciones LIGeMA de la Universidad de Florencia (Italia).

1. Preparación celular

1. Cultive células PCa de la línea celular PCa en una placa de Petri de 100 mm que contenga el medio de águila modificado (DMEM) de Dulbecco suplementado con 2% de L-glutamina y 10% de suero fetal bovino (FBS).
2. Incubar las células en normoxia a 37 °C con 5% de_CO2.
3. Separar las células con tripsina. Contar y resuspender 1 x 10⁶ células en 20 μL de PBS, 1 h antes de la inoculación.

2. Preparación del ratón para inyección guiada por ultrasonido (US-GI)

NOTA: Los siguientes pasos se realizaron en condiciones estériles. Todo el procedimiento de inyección guiada por US, desde el comienzo de la anestesia hasta que el ratón se retira de la plataforma animal, toma alrededor de 10-12 min más 5 min para la recuperación completa del ratón.

1. Justo antes de la intervención, administrar carprofeno (AINE) por vía subcutánea (s.c.) a una dosis final de 5 mg/kg o tramadol a una dosis final de 5 mg/kg utilizando una jeringa de tuberculina con una aguja de 27 G.
   NOTA: Para el presente protocolo, se utilizaron 20 ratones hembra Athymic Nude-Foxn^1nu . Los ratones tenían 8 semanas de edad y pesaban 20-22 g.
2. Encienda el generador de imágenes y seleccione Ratón (pequeño) abdominal en el menú de aplicaciones del panel del transductor. Asegúrese de que aparezca la ventana de imágenes B-Mode (Brightness Mode) y que el sistema esté listo para adquirir datos B-Mode.
   NOTA: El modo B es el modo de imagen predeterminado del sistema. El sistema muestra los ecos en una vista bidimensional (2D) asignando un nivel de brillo basado en la amplitud de la señal de eco. El modo B es el modo más efectivo para localizar estructuras anatómicas.
   1. Vaya al Explorador de estudios.
   2. Seleccione Nuevo estudio y escriba el nombre y la información del estudio, es decir, la fecha del estudio, etc.
   3. Complete toda la información necesaria en el nombre de la serie, es decir, la cepa del animal, la identificación, la fecha de nacimiento, etc.
   4. Toca Listo; el programa está listo para imágenes en modo B.
3. Anestesiar al ratón en la cámara de inducción de la anestesia utilizando isoflurano al 4% con un flujo de gas de 2 L/min de_O2.
   NOTA: Aproximadamente 4 minutos son suficientes para la anestesia adecuada (respirar alrededor de 50-60 respiraciones por minuto).
4. Una vez que el ratón esté anestesiado, cambie la conexión de la máquina anestésica para dirigir el isoflurano hacia la mesa de manipulación del ratón.
5. Colocar el ratón anestesiado en su flanco derecho sobre la mesa de manipulación (calentado a 37 °C) con el hocico en un cono nasal para asegurarse de que el ratón está anestesiado con isoflurano al 2% con un flujo de gas de 0,8 L/min de_O2 (Figura 1A).
6. Aplique una gota de lágrimas artificiales en los ojos del ratón para evitar la sequedad mientras está bajo anestesia.
7. Pegue firmemente la mano derecha, el pie derecho y la cola en las almohadillas de electrodos de la plataforma del animal con una gasa adhesiva.
   NOTA: La frecuencia respiratoria del ratón y el electrocardiograma (ECG) se registran a través de las almohadillas de los electrodos.

3. Inyección de células PANC1 en el páncreas por el método US-GI

1. Desinfecte la piel del ratón con etanol al 70% y mantenga la piel del flanco izquierdo estirada con una gasa adhesiva.
   NOTA: Mantener la piel estirada es importante para reducir la resistencia a la inserción de la aguja y para prevenir deformaciones de la aguja.
2. Aplique gel de ultrasonido en el abdomen y el flanco izquierdo del ratón con una jeringa de 20 ml (sin la aguja).
3. Usando la perilla de control de altura del transductor estadounidense, baje el transductor para tocar el flanco izquierdo del ratón y colóquelo transversalmente al cuerpo del animal.
4. Mueva el transductor para visualizar el páncreas en la pantalla del transductor utilizando imágenes en modo B (Figura 1B).
5. Prepare una jeringa Hamilton de 50 μL, que contenga 1 x 10⁶ células PANC1 suspendidas en 20 μL de PBS, con una aguja de 30 mm 28 G y coloque la jeringa en el soporte apropiado (Figura 1C).
   NOTA: Antes de usar, desinfecte la aguja de la jeringa con etanol al 70% durante un período de 5-10 minutos.
6. Utilizando el micromanipulador titular, bajar la jeringa a la piel del ratón, con el bisel de la aguja hacia arriba y en el mismo plano que el transductor de ultrasonido, formando un ángulo de 45° con el transductor (Figura 1D).
   NOTA: A partir de este paso, proceda monitoreando la imagen de EE. UU. en la pantalla.
7. Usando el micromanipulador, perfore la piel e inserte la aguja de la jeringa en el páncreas y observe la imagen de EE.UU. en la pantalla, para seguir su trayectoria (Figura 1E).
   NOTA: Antes de la inyección, tome la cola del páncreas como referencia que se encuentra detrás del bazo y cerca del riñón izquierdo.
8. Una vez insertada la aguja en el páncreas, inyecte un bolo de 20 μL que contenga las células directamente en el páncreas aplicando una presión constante sobre el émbolo de la jeringa (Figura 1F).
   NOTA: El procedimiento de inyección correcto se verifica por la presencia de una pequeña burbuja en el páncreas y el flujo de líquido hipoecogénico, que es apenas visible desde la punta de la aguja.
9. Deje la aguja en su lugar durante 5-10 s después de inyectar todo el bolo y luego retírela lentamente.
10. Retire el transductor US, limpie el gel del flanco y coloque el ratón solo en una jaula nueva. Observe al animal hasta que haya recuperado la conciencia suficiente para mantener la decúbito esternal.

4.3D Imágenes de EE.UU. para la monitorización de tumores pancreáticos en ratones

NOTA: La evaluación del desarrollo del tumor se realizó a partir de 8 días después de la inyección celular, utilizando el mismo instrumento utilizado para la inyección guiada por los Estados Unidos (enumerada en la Tabla de materiales). Por lo tanto, algunos procedimientos, como el encendido del sistema (paso 2.2.), la anestesia (pasos 2.3. - 2.6.) y la colocación del ratón en la plataforma animal (paso 2.7.), coinciden completamente con lo descrito anteriormente en el protocolo.

1. Antes de iniciar la creación de imágenes de EE. UU., configure la estación de trabajo como se muestra en la figura 2A.
2. Fije el transductor en el sistema de motor 3D (Figura 2A).
3. Encienda el generador de imágenes y seleccione Nuevo estudio en el Explorador de estudios.
4. Coloque el ratón en la cámara de inducción de anestesia (isoflurano al 4%).
5. Colocar el ratón anestesiado en su flanco derecho sobre la mesa de manipulación calentada a 37 °C con el hocico en el tubo anestésico y reducir el isoflurano al 2% (Figura 2B).
   NOTA: Es importante que el ratón se coloque en la misma posición que la inyección guiada por los Estados Unidos, para mantener las mismas referencias anatómicas.
6. Aplique una gota de ungüento veterinario en los ojos del ratón.
7. Aplique una capa de gel de ultrasonido en el abdomen y el flanco izquierdo del ratón.
8. Coloque el transductor de 55 MHz en la orientación transversal para tocar la piel del flanco izquierdo de tal manera que el páncreas esté aproximadamente centrado (Figura 2C).
9. Utilice el motor 3D para adquirir imágenes de todo el páncreas en la orientación transversal, idealmente reuniendo 90-100 fotogramas por adquisición (el número de fotogramas puede variar según la elección personal).
   1. Seleccione la posición del motor 3D en el panel táctil del generador de imágenes.
   2. Indique la distancia de exploración moviendo el cursor para adquirir imágenes de todo el páncreas de ambas extremidades.
   3. Seleccione Escanear fotogramas y comience la adquisición 3D.
10. Una vez que se hayan realizado las imágenes 3D, retire el transductor, limpie el gel de la piel y coloque el mouse solo en una jaula nueva para su recuperación. Observe al animal hasta que haya recuperado la conciencia suficiente para mantener la decúbito esternal.

Resultados

Siguiendo el protocolo descrito anteriormente, los ratones fueron anestesiados primero en una cámara de isoflurano y colocados en la plataforma animal (Figura 1A). El páncreas se visualizó con imágenes de ultrasonido (Figura 1B). Se cargó una jeringa Hamilton de 50 μL con 1 x 10⁶ células PANC1 suspendidas en 20 μL de PBS y colocadas en el soporte de la aguja (Figura 1C). El ángulo óptimo entre la jeringa y el tr...

Discusión

Aunque el uso de imágenes de US está muy extendido en la clínica, el desarrollo tumoral en muchos modelos preclínicos de ratón generalmente se describe utilizando imágenes bioluminiscentes¹¹. Esta última es una forma indirecta de evaluar el injerto y la expansión tumoral y tampoco proporciona una cinética confiable de crecimiento tumoral. En el presente estudio, hemos aplicado imágenes de US para realizar la inyección de células, así como para monitorear el desarrollo de tumores. El p...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm Petri dish	Sarstedt, Germany	P5856
3D-Mode package	Visualsonics Fujifilm, Italy		Includes the 3D Motor; necessary for volumetric imaging
Aquasonic 100, Sonypack 5 lt Ultrasound Transmission Gel	PARKER LABORATORIES, INC.	150	Gel for ultrasound
Athymic Mice (Nude-Foxn1nu)	ENVIGO, Italy	69	20 females, 8 weeks old, Athymic Nude-Foxn1nu, 20-22 g body weight
CO2 Incubator Function Line	Heraeus Instruments, Germany	BB16-ICN2
Display of ECG, Respiration Waveform and body temperature	Visualsonics Fujifilm, Italy	11426
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium)	Euroclone Spa, Italy	ECM0101L
DPBS (Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline)	Euroclone Spa, Italy	ECB4004L
Eppendorf (1.5mL)	Sarstedt, Germany	72.690.001
FBS (Fetal Bovine Serum)	Euroclone Spa, Italy	ECS0170L
Hamilton Needle Pointstyle 4, lenght 30 mm, 28 Gauge	Permax S.r.l., Italy	7803-02
Hamilton Syringe 705RM 50 µL	Permax S.r.l., Italy	7637-01
Isoflo (250 mL)	Ecuphar	7081219
L-glutamine 100X	Euroclone Spa, Italy	ECB3000D
Mouse Handling table II	Visualsonics Fujifilm, Italy	50249
MX550D: 55 MHz MX Series Transducer	Visualsonics Fujifilm, Italy	51069	Ultrasound Transducers
Oxygen/isofluorane mixer	Angelo Franceschini S.r.l.	LFY-I-5A
PANC1 cell line	American Type Culture Collection (ATCC), USA	CRL-1469
Rimadyl (carprofen)	Pfizer	11319	20 mL, injection solution
Trypsin-EDTA 1X in PBS	Euroclone Spa, Italy	ECB3052D
Vet ointment for eyes, Systane nighttime	Alcon	509/28555-1
Vevo Compact Dual Anesthesia System (Tabletop Version)	Visualsonics Fujifilm, Italy	VS-12055	complete with gas chamber
Vevo Imaging Station 2	Visualsonics Fujifilm, Italy	VS-11983	Imaging WorkStation 1 plus Imaging Station Extension with injection mount
Vevo Lab	Visualsonics Fujifilm, Italy	VS-20034	Data Analysis Software
Vevo LAZR-X Photoacoustic Imaging System	Visualsonics Fujifilm, Italy	VS-20054	Includes analytic software package for B-mode
Vevo Photoacoustic Enclosure	Visualsonics Fujifilm, Italy	53157