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  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Este protocolo tiene como objetivo aislar los ARNm ribosómicos de traducción específicos del tipo celular utilizando el modelo de ratón NuTRAP.

Resumen

La heterogeneidad celular plantea desafíos para comprender la función de los tejidos complejos a nivel del transcriptoma. El uso de ARN específicos del tipo de célula evita posibles dificultades causadas por la heterogeneidad de los tejidos y desencadena el poderoso análisis del transcriptoma. El protocolo descrito aquí demuestra cómo utilizar el método de purificación de afinidad ribosómica (TRAP) para aislar ARN unidos a ribosomas de una pequeña cantidad de células que expresan EGFP en un tejido complejo sin clasificación celular. Este protocolo es adecuado para aislar ARN específicos de tipo celular utilizando el modelo de ratón NuTRAP recientemente disponible y también podría usarse para aislar ARN de cualquier célula que exprese EGFP.

Introducción

Los enfoques de alto rendimiento, incluida la secuenciación de ARN (RNA-seq) y el microarray, han permitido interrogar los perfiles de expresión génica a nivel de todo el genoma. Para tejidos complejos como el corazón, el cerebro y los testículos, los datos específicos del tipo de célula proporcionarán más detalles comparando el uso de ARN de todo el tejido 1,2,3. Para superar el impacto de la heterogeneidad celular, el método de purificación de afinidad ribosómica traducida (TRAP) se ha desarrollado desde principios de la década de 20104. TRAP es capaz de aislar ARN unidos a ribosomas de tipos celulares específicos sin disociación tisular. Este método se ha utilizado para el análisis de translatoma (ARNm que están siendo reclutados para el ribosoma para la traducción) en diferentes organismos, incluyendo la orientación a una población extremadamente rara de células musculares en embriones de Drosophila5, el estudio de diferentes células radiculares en la planta modelo Arabidopsis thaliana6, y la realización de análisis del transcriptoma de células endoteliales en mamíferos7.

TRAP requiere una modificación genética para marcar el ribosoma de un organismo modelo. Evan Rosen y sus colegas desarrollaron recientemente un modelo de ratón llamado Nuclear tagging and Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP) mouse 8, que ha estado disponible a través del Laboratorio Jackson desde 2017. Al cruzarse con una línea de ratón Cre, los investigadores pueden usar este modelo de ratón NuTRAP para aislar ARN unidos a ribosomas y núcleos celulares de células que expresan Cre sin clasificación celular. En las células que expresan Cre que también portan el alelo NuTRAP , el ribosoma marcado con EGFP / L10a permite el aislamiento de la traducción de ARNm utilizando ensayos de afinidad pulldown. En la misma célula, la membrana nuclear marcada con el péptido de reconocimiento de biotina ligasa (BLRP), que también es mCherry positivo, permite el aislamiento nuclear mediante el uso de purificación basada en afinidad o fluorescencia. El mismo equipo de investigación también generó una línea de ratón similar en la que la membrana nuclear se etiqueta solo con mCherry sin biotina8. Estas dos líneas de ratones modificados genéticamente dan acceso a caracterizar perfiles epigenómicos y transcriptómicos pareados de tipos específicos de células de interés.

La vía de señalización del erizo (Hh) juega un papel crítico en el desarrollo del tejido9. GLI1, un miembro de la familia GLI, actúa como un activador transcripcional y media la señalización de Hh. Las células Gli1+ se pueden encontrar en muchos órganos secretores de hormonas, incluyendo la glándula suprarrenal y los testículos. Para aislar ADN y ARN específicos del tipo de célula de las células Gli1+ utilizando el modelo de ratón NuTRAP, se cruzaron ratones Gli1-CreERT2 con ratones NuTRAP. Los ratones Shh-CreERT2 también se cruzaron con los ratones NuTRAP con el objetivo de aislar las células que expresan erizo sónico (Shh). El siguiente protocolo muestra cómo utilizar Gli1-CreERT2; Ratones NuTRAP para aislar ARN unidos a ribosomas de células Gli1+ en testículos de ratones adultos.

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Protocolo

Todos los experimentos con animales realizados siguieron los protocolos aprobados por los Comités Institucionales de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Auburn.

NOTA: El siguiente protocolo utiliza un testículo (aproximadamente 100 mg) en P28 de Gli1-CreERT2; Ratones NuTRAP (Mus musculus). Es posible que sea necesario ajustar los volúmenes de reactivos en función de los tipos de muestras y el número de tejidos.

1. Recolección de tejidos

  1. Eutanasia a los ratones usando una cámara deCO2 , desinfecte la superficie del abdomen con etanol al 70%.
  2. Abra la parte inferior del abdomen con tijeras y retire los testículos. Use nitrógeno líquido (LN2) para congelar los testículos inmediatamente.
  3. Almacene las muestras en la fase de vapor de LN2 hasta su uso.

2. Preparación de reactivos y perlas

  1. Preparar la solución madre de homogeneización: Añadir 50 mM Tris (pH 7.4), 12 mM MgCl2, 100 mM KCl, 1% NP-40 y 1 mg/ml de heparina. Conservar la solución a 4 °C hasta su uso (hasta 1 mes).
  2. Preparar el tampón de trabajo de homogeneización a partir de la solución madre (paso 2.1) antes de su uso: Añadir DTT (concentración final: 1 mM), cicloheximida (concentración final: 100 μg/ml), ribonucleasa recombinante (concentración final: 200 unidades/ml) y cóctel inhibidor de proteasa (concentración final: 1x) a la solución madre de homogeneización para producir la cantidad necesaria del tampón de trabajo de homogeneización. Guarde el tampón de trabajo recién preparado en hielo hasta que lo use.
  3. Prepare los tampones de lavado bajos en sal y altos en sal:
    1. Para preparar tampón de lavado bajo en sal, mezcle 50 mM Tris (pH 7.4), 12 mM MgCl2, 100 mM KCl y 1% NP-40. Añadir TDT (concentración final: 1 mM) y cicloheximida (concentración final: 100 μg/ml) antes de usar.
    2. Para preparar tampón de lavado con alto contenido de sal mezcle 50 mM Tris (pH 7.4), 12 mM MgCl2, 300 mM KCl, 1% NP-40. Añadir TDT (concentración final: 2 mM) y cicloheximida (concentración final: 100 μg/mL) antes de usar.
  4. Prepare cuentas de proteína G (Tabla de materiales):
    1. Cada muestra necesitará 50 μL de perlas de proteína G. Coloque la cantidad requerida de perlas en un tubo de centrífuga de 1,5 ml y separe las perlas de la solución utilizando una rejilla magnética dejando el tubo en la rejilla durante 30-60 s.
    2. Retire el sobrenadante mediante pipeteo. Lave las perlas tres veces con 1 ml de tampón de lavado helado y bajo en sal cada vez.

3. Lisis tisular y homogeneización

  1. Añadir 2 ml de tampón de trabajo de homogeneización helada (recién preparado a partir del paso 2.2) a un juego de amoladora de papel tisú de vidrio. Coloque rápidamente la muestra congelada en el molinillo y homogeneice el tejido con 30 golpes en hielo con un mortero suelto.
  2. Transfiera el homogeneizado a un tubo de fondo redondo de 2 ml y centrifugar a 12.000 x g durante 10 min a 4 °C.
  3. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de 2 ml. Guarde 100 μL en un tubo de 1,5 ml como "entrada".
  4. Incubar el sobrenadante en el tubo de 2 ml con el anticuerpo anti-GFP (5 μg/ml; 1:400) a 4 °C en un rotador de extremo a extremo (24 rpm) durante la noche.

4. Inmunoprecipitación

  1. Transfiera la mezcla de homogeneizado/anticuerpo a un nuevo tubo de fondo redondo de 2 ml que contenga las perlas de proteína G lavadas del paso 2.4. Incubar a 4 °C en un rotador de extremo a extremo (24 rpm) durante 2 h.
  2. Separe las perlas magnéticas del sobrenadante con una rejilla magnética. Guarde el sobrenadante como la "fracción negativa". La fracción negativa contiene (1) ARN en células negativas para EGFP y (2) ARN en células positivas para EGFP que no están unidas a ribosomas.
  3. Agregue 1 ml de tampón de lavado con alto contenido de sal a las perlas y voltee brevemente el tubo para lavar las perlas. Coloque el tubo en una rejilla magnética.
  4. Retire el tampón de lavado. Repita el paso de lavado dos veces más. Las perlas ahora contienen el complejo perlas-ribosoma-ARN de células positivas para EGFP.

5. Extracción de ARN

NOTA: Los siguientes pasos están adaptados del kit de aislamiento de ARN (Tabla de materiales). Trate cada fracción (es decir, entrada, positiva y negativa) como una muestra independiente y aísle los ARN de forma independiente.

  1. Incubar las perlas del paso 4.4 con 50 μL de tampón de extracción (del kit de aislamiento de ARN) en un termomezclador (42 °C, 500 rpm) durante 30 min para liberar ARN de las perlas.
  2. Separe las perlas con un estante magnético, transfiera el sobrenadante que contiene el complejo perlas-ribosoma-ARN a un tubo de 1,5 ml.
  3. Centrifugar el tubo a 3000 x g durante 2 min, luego pipetear el sobrenadante a un nuevo tubo de 1,5 ml. Este tubo contiene la "fracción positiva" del paso TRAP.
    NOTA: Para las fracciones de entrada y negativas, extraer ARN de 25 μL de muestras utilizando 1 ml de tampón de extracción. Incubar en un termomezclador (42 °C, 500 rpm) durante 30 min.
  4. Preacondicionar la columna de purificación de ARN: pipetear 250 μL de tampón de acondicionamiento en la columna de purificación. Incubar durante 5 min a temperatura ambiente (RT). Centrifugar la columna a 16.000 x g durante 1 min.
  5. Pipet igual volumen de 70% de EtOH en el sobrenadante desde el paso 5.3 (alrededor de 50 μL de 70% de EtOH para la fracción positiva y 1 mL de 70% de EtOH para la entrada y las fracciones negativas). Mezclar bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo.
  6. Pipetear la mezcla en la columna a partir del paso 5.4.
  7. Centrifugar la columna a 100 x g durante 2 minutos para permitir que el ARN se una a la membrana en la columna, luego continúe la centrifugación a 16,000 x g durante 30 s inmediatamente. Deseche el flujo continuo.
    NOTA: Para las fracciones de entrada y negativas, agregue 250 μL de la mezcla a la columna cada vez. Repita los pasos 5.6 y 5.7 hasta que se utilicen todas las mezclas.
  8. Pipetear 100 μL de tampón de lavado 1 (W1) en la columna y centrifugar a 8.000 x g durante 1 min. Deseche el flujo continuo.
  9. Pipetear 75 μL de solución de DNasa mezclar directamente en la membrana de la columna de purificación. Incubar en RT durante 15 min.
  10. Pipetear 40 μL de W1 en la columna y centrifugar a 8.000 x g durante 30 s. Deseche el flujo continuo.
  11. Pipetear 100 μL de tampón de lavado 2 (W2) en la columna y centrifugar a 8.000 x g durante 1 min. Deseche el flujo continuo.
  12. Pipetear 100 μL de W2 en la columna y centrifugar a 16.000 x g durante 2 min. Deseche el flujo continuo. Vuelva a centrifugar la misma columna a 16.000 x g durante 1 minuto para eliminar todos los restos de tampón de lavado antes de la etapa de elución.
  13. Transfiera la columna a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
  14. Pipetear 12 μL de agua libre de RNasa directamente sobre la membrana de la columna de purificación. La punta de la pipeta no debe tocar la membrana. Incubar a RT durante 1 min y centrifugar a 1000 x g durante 1 min. Luego continúe la centrifugación a 16,000 x g durante 1 minuto para eluyir el ARN.

6. Concentración y calidad del ARN

  1. Utilice un bioanalizador para evaluar la calidad y cantidad del ARN extraído10.

7. Almacenamiento y análisis posterior

  1. Almacene el ARN a -80 °C (hasta 1 año) hasta un análisis adicional (p. ej., microarray, PCR cuantitativa (qPCR) y RNA-seq, etc.).
    NOTA: Para obtener detalles sobre el análisis de qPCR, incluida la síntesis de ADNc, consulte Lyu et al.11. Los cebadores para qPCR se enumeran en la Tabla de materiales.

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Resultados

El ratón Gli1-CreERT2 (Jackson Lab Stock Number: 007913) se cruzó por primera vez con el ratón reportero NuTRAP (Jackson Lab Stock Number: 029899) para generar ratones de doble mutación. Los ratones portadores de ambos alelos genéticos genéticamente modificados (es decir, Gli1-CreERT2 y NuTRAP) fueron inyectados con tamoxifeno una vez al día, cada dos días, para tres inyecciones. Las muestras de tejido se recogieron el 7º día después del1º día de la...

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Discusión

La utilidad del análisis del transcriptoma de tejido completo podría amortiguarse, especialmente cuando se estudian tejidos heterogéneos complejos. Cómo obtener ARN específicos de tipo celular se convierte en una necesidad urgente para desatar la poderosa técnica RNA-seq. El aislamiento de ARN específicos del tipo celular generalmente se basa en la recolección de un tipo específico de células mediante micromanipulación, clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) o microdisección por captura lás...

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Divulgaciones

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

Agradecimientos

Este trabajo fue parcialmente apoyado por NIH R00HD082686. Agradecemos la beca de investigación de verano de la Endocrine Society a H.S.Z. También agradecemos al Dr. Yuan Kang por criar y mantener la colonia de ratones.

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
ActbeurofinsqPCR primersATGGAGGGGAATACAGCCC / TTCTTTGCAGCTCCTTCGTT (forward primer/reverse primer)
BioanalyzerAgilent2100 Bioanalyzer Instrument
cOmplete Mini EDTA-free Protease Inhibitor CocktailMillipore11836170001
cycloheximideMillipore239764-100MG
Cyp11a1eurofinsqPCR primersCTGCCTCCAGACTTCTTTCG / TTCTTGAAGGGCAGCTTGTT (forward primer/reverse primer)
dNTPThermo Fisher ScientificR0191
DTT, DithiothreitolThermo Fisher ScientificP2325
DynaMag-2 magnetThermo Fisher Scientific12321D
Falcon tubes 15 mLVWR89039-666
GFP antibodyAbcamab290
Glass grinder setDWK Life Sciences357542
heparinBEANTOWN CHEMICAL139975-250MG
Hsd3beurofinsqPCR primersGACAGGAGCAGGAGGGTTTGTG / CACTGGGCATCCAGAATGTCTC (forward primer/reverse primer)
KClBiosciencesR005
MgCl2BiosciencesR004
Microcentrifuge tubes 2 mLThermo Fisher Scientific02-707-354
Mouse Clariom S Assay microarraysThermo Fisher ScientificMicroarray service
NP-40Millipore492018-50 Ml
oligo (dT)20Invitrogen18418020
PicoPure RNA Isolation KitThermo Fisher ScientificKIT0204
Protein G DynabeadThermo Fisher Scientific10003D
RNase-free watergrowcellsNUPW-0500
RNaseOUT Recombinant Ribonuclease InhibitorThermo Fisher Scientific10777019
Sox9eurofinsqPCR primersTGAAGAACGGACAAGCGGAG / CTGAGATTGCCCAGAGTGCT (forward primer/reverse primer
Superscript IV reverse transcriptaseInvitrogen18090050
SYBR Green PCR Master MixThermo Fisher Scientific4309155
Sycp3eurofinsqPCR primersGAATGTGTTGCAGCAGTGGGA /GAACTGCTCGTGTATCTGTTTGA (forward primer/reverse primer)
TrisAlfa AesarJ62848

Referencias

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  5. Bertin, B., Renaud, Y., Aradhya, R., Jagla, K., Junion, G. J. J. TRAP-rc, translating ribosome affinity purification from rare cell populations of Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (103), e52985(2015).
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