Investigación del metabolismo cardíaco en el corazón de ratón perfundido aislado con piruvato hiperpolarizado [1-13C] y espectroscopia de RMN 13C / 31P

Resumen

Describimos una configuración experimental para administrar metabolitos hiperpolarizados marcados con ¹³C en modo de perfusión continua a un corazón de ratón perfundido aislado. Un enfoque dedicado de adquisición de ¹³C-RMN permitió la cuantificación de la actividad enzimática metabólica en tiempo real, y un análisis multiparamétrico de ³¹R-P permitió la determinación del contenido de ATP tisular y el pH.

Resumen

El metabolismo es la base de procesos importantes en la vida celular. La caracterización de cómo funcionan las redes metabólicas en los tejidos vivos proporciona información crucial para comprender el mecanismo de las enfermedades y diseñar tratamientos. En este trabajo, describimos procedimientos y metodologías para estudiar la actividad metabólica en la célula en un corazón de ratón retrógradamente perfundido en tiempo real. El corazón se aisló in situ, junto con un paro cardíaco para minimizar la isquemia miocárdica y se perfundió dentro de un espectrómetro de resonancia magnética nuclear (RMN). Mientras estaba en el espectrómetro y bajo perfusión continua, se administró piruvato hiperpolarizado [1-13 C] al corazón, y las posteriores tasas de producción hiperpolarizadas de [1-13 C] lactato y [¹³C] bicarbonato sirvieron para determinar, en tiempo real, las tasas de producción de lactato deshidrogenasa y piruvato deshidrogenasa. Esta actividad metabólica del piruvato hiperpolarizado [^1-13C] se cuantificó con espectroscopia de RMN en un modelo de manera libre utilizando el enfoque de adquisición de excitaciones de saturación selectivas del producto. ³¹ La espectroscopia P se aplicó entre las adquisiciones hiperpolarizadas para monitorear la energética cardíaca y el pH. Este sistema es excepcionalmente útil para estudiar la actividad metabólica en el corazón sano y enfermo del ratón.

Introducción

Las alteraciones en el metabolismo cardíaco están asociadas con una variedad de miocardiopatías y a menudo forman la base de los mecanismos fisiopatológicos subyacentes¹. Sin embargo, existen numerosos obstáculos para estudiar el metabolismo en tejidos vivos, ya que la mayoría de los ensayos bioquímicos requieren la homogeneización de la lisis tisular y celular y / o el trazado radiactivo. Por lo tanto, existe una necesidad apremiante de nuevas herramientas para investigar el metabolismo miocárdico en tejidos vivos. La resonancia magnética (RM) de sustratos hiperpolarizados marcados con ¹³C permite mediciones en tiempo real del metab....

Protocolo

El comité conjunto de ética (IACUC) de la Universidad Hebrea y el Centro Médico Hadassah aprobaron el protocolo de estudio para el bienestar animal (MD-19-15827-1).

1. Preparación del tampón Krebs-Henseleit

1. Un día antes del experimento, prepare una versión modificada del tampón de Krebs-Henseleit (KHB)²⁶. Inicialmente, disolver 118 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 0,5 mM piruvato, 1,2 mM_MgSO4, 25 mM NaHCO₃ y 1,2 mM KH 2 PO₄ en H₂O de doble destilación.
2. Burbujear esta mezcla con 95%/5%_O2/CO 2 durante 20 min, y luego a....

Resultados

Los espectros ³¹P registrados desde un corazón de ratón perfundido con KHB y solo desde el tampón se muestran en la Figura 1A. Las señales de α, β y γ-ATP, PCr y Pi se observaron en el corazón. La señal Pi estaba compuesta de dos componentes principales: en el campo más alto (lado izquierdo de la señal), la señal Pi se debía principalmente al KHB a un pH de 7,4; en el campo inferior (lado derecho de la señal), la señal Pi era más amplia y menos homogénea debido al.......

Discusión

Demostramos una configuración experimental que está diseñada para investigar el metabolismo hiperpolarizado del piruvato [^1-13C], la energética de los tejidos y el pH en un modelo de corazón de ratón aislado.

Los pasos críticos dentro del protocolo son los siguientes: 1) asegurar que el pH del tampón sea 7.4; 2) garantizar que se incluyan todos los componentes del búfer; 3) evitar la coagulación de la sangre en los vasos cardíacos mediante inyecciones de heparina; 4) evit.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
HyperSense DNP Polariser	Oxford Instruments	52-ZNP91000	HyperSense, 3.35 T, preclinical dissolution-DNP hyperpolarizer
NMR spectrometer	RS2D		NMR Cube, 5.8 T, equiped with a 10 mm broad-band probe
Peristaltic pump	Cole-Parmer	07554-95
Temperature probe	Osensa	FTX-100-LUX+	NMR compatible temprature probe
Somnosuite low-flow anesthesia system	Kent Scientific
Lines, tubings, suture
Platinum cured silicone tubes	Cole-Parmer	HV-96119-16	L/S 16 I.D. 3.1 mm
Thin polyether ether ketone (PEEK) lines	Upchurch Scientific		id. 0.040”
Intravenous catheter	BD Medical	381323	22 G
Silk suture	Ethicon	W577H	Wire diameter of 3-0
Chemicals and pharmaceuticals
[1-13C]pyruvic acid	Cambridge Isotope Laboratories	CLM-8077-1
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	21074	CAS: 10043-52-4
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G7528	CAS: 50-99-77
Heparin sodium	Rotexmedica	HEP5A0130C0160
Hydrochloric acid 37%	Sigma-Aldrich	258148	CAS: 7647-01-0
Insulin aspart (NovoLog)	Novo Nordisk
Isoflurane	Terrel
Magnesium Sulfate	Sigma-Aldrich	793612	CAS: 7487-88-9
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P4504	CAS: 7447-40-7
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P9791	CAS: 7778-77-0
Sodium bicarbonate	Gadot Group		CAS: 144-55-8
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S9625	CAS: 7647-14-5
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	655104	CAS: 1310-73-2
Sodium phosphate dibasic	Sigma Aldrich	S7907	CAS: 7558-79-4
Sodium phosphate monbasic dihydrate	Merck	6345	CAS: 13472-35-0
TRIS (biotechnology grade)	Amresco	0826	CAS: 77-86-1
Trityl radical OX063	GE Healthcare AS	NC100136	OX063
NMR standards
13C standard sample	Cambridge Isotope Laboratories	DLM-72A	40% p-dioxane in benzene-D6
31P standard sample	Made in house		105 mM ATP and 120 mM phenylphosphonic acid in D2O
Software
Excel 2016	Microsoft
MNova	Mestrelab Research