Cesárea de un modelo animal preclínico de corioamnionitis desencadenada por estreptococo del grupo B (SGB)

Resumen

El objetivo de este protocolo es describir un modelo animal preclínico de corioamnionitis inducida por estreptococo del grupo B (SGB). El estudio está diseñado para investigar los procesos mecanicistas, los posibles vínculos causales con las deficiencias del desarrollo y, finalmente, para desarrollar tratamientos antiinflamatorios y neuroprotectores traslacionales.

Resumen

El estreptococo del grupo B (GBS) es una de las bacterias más comunes aisladas durante el embarazo humano. Es una de las principales causas de infección/inflamación de la placenta, denominada corioamnionitis. La corioamnionitis expone al feto en desarrollo a un alto riesgo de lesiones orgánicas, morbilidad y mortalidad perinatal, así como a deficiencias neuroconductuales de por vida y otros problemas de desarrollo no neurológicos. Los dos subtipos más frecuentes de aislados de SGB de tejidos maternos y fetales son los serotipos Ia (13%-23%) y III (25%-53%). Nuestro laboratorio ha desarrollado y caracterizado un modelo de corioamnionitis inducida por GBS en ratas para estudiar los impactos posteriores en el sistema nervioso central del feto en desarrollo y comprender los aspectos mecanicistas subyacentes. Este artículo presenta el diseño y los usos del modelo preclínico de rata, que reproduce fielmente el sello distintivo de la corioamnionitis inducida por GBS en humanos. Este artículo tiene como objetivo ayudar a los científicos a reproducir el diseño experimental, así como proporcionar apoyo a través de ejemplos de resolución de problemas. El presente modelo también puede contribuir a descubrimientos potenciales a través del descubrimiento de causas, mecanismos y nuevas vías terapéuticas, que permanecen inestables en muchas deficiencias del desarrollo derivadas de la corioamnionitis. Además, el uso de este modelo puede extenderse a los estudios de morbilidades perinatales no neurológicas comunes y graves que afectan, por ejemplo, a la retina, el intestino, el pulmón y el riñón. El interés principal de esta investigación se centra en el campo de las deficiencias del neurodesarrollo fetal inducidas por el SGB, como la parálisis cerebral (PC), el trastorno por déficit de atención con hiperactividad (TDAH) y el trastorno del espectro autista (TEA). En este artículo se presentan los fundamentos que sustentan este modelo, seguidos de los procedimientos y los resultados.

Introducción

La activación inmunitaria materna (MIA) ha sido descrita como uno de los factores de riesgo independientes más críticos para el nacimiento prematuro, la muerte fetal y las deficiencias cognitivas y conductuales de por vida en la progenie 1,2,3,4. Gran parte de la investigación preclínica existente sobre el papel de la inflamación gestacional en los resultados de la placenta y el desarrollo utiliza componentes patógenos, como el lipopolisacárido (LPS) de E. coli y el análogo sintético del ARN viral de doble cadena, poliinosínico: ácido policitidílico (Poly[I: C]), que imitan las infecciones virales. Sin embargo, a pesar de que el estreptococo del grupo B (SGB) es la causa más frecuente de infección perinatal, pocos modelos animales han abordado su papel en los mecanismos inflamatorios en juego y los resultados⁵.

El SGB es un coco grampositivo encapsulado que coloniza el tracto genital inferior en aproximadamente el 15%-30% de las mujeres embarazadas⁶. Conduce a infección/inflamación de la placenta, denominada corioamnionitis ^7,8. De los diez serotipos de SGB, los dos serotipos Ia y III más frecuentes son los principales determinantes infecciosos de las lesiones en los tejidos maternofetales ^9,10. Se ha demostrado que la infección por SGB conduce a una mayor respuesta inflamatoria en la sangre fetal y la deficiencia placentaria, que se sospecha que están involucradas en múltiples trastornos del neurodesarrollo como la parálisis cerebral (PC), el trastorno por déficit de atención con hiperactividad (TDAH) y el trastorno del espectro autista (TEA)^5,11.

En los últimos diez años, hemos desarrollado un modelo de corioamnionitis inducida por GBS en ratas que conduce a diversas alteraciones del desarrollo en la descendencia¹². Este modelo preclínico demuestra la relación causal entre la inflamación placentaria inducida por GBS y una serie de alteraciones del neurodesarrollo específicas del sexo en la descendencia 13,14,15. El objetivo de este artículo es proporcionar a los lectores información sobre el diseño de un modelo preclínico de infección final de gestación en ratas y las deficiencias neuroconductuales resultantes en la descendencia. El presente protocolo tiene como objetivo imitar la realidad clínica de la corioamnionitis inducida por SGB.

Los resultados de este modelo preclínico muestran que la inoculación intraperitoneal (IP) al final de la gestación (Figura 1) de SGB conduce a (i) infección e inflamación placentaria, cumpliendo los criterios diagnósticos de corioamnionitis¹⁶; (ii) una regulación masiva al alza de la IL-1β y de las moléculas inflamatorias posteriores de la vía de la IL-1, dentro de la placenta¹²; (iii) alteraciones del neurodesarrollo en la descendencia¹²; (iv) diferencias de sexo en las respuestas inmunitarias y las deficiencias neuroconductuales subsiguientes, como la descendencia femenina que presenta rasgos similares al TDAH en la edad adulta, mientras que la descendencia masculina presenta rasgos similares al TEA de inicio temprano y larga duración; (v) distintos resultados neuroconductuales en la progenie dependiendo del serotipo de SGB utilizado para inducir corioamnionitis^14,15. De acuerdo con estos hallazgos, los próximos pasos principales utilizando este modelo serán probar, en primer lugar, el papel de los andrógenos en la corioamnionitis inducida por GBS y, en segundo lugar, el papel placentario y neuroprotector de las moléculas que se dirigen a vías inflamatorias específicas, con la esperanza de llevar algunas de estas moléculas al umbral de los ensayos clínicos terapéuticos.

Protocolo

Todos los experimentos fueron aprobados por el Instituto de Investigación del Centro de Salud de la Universidad McGill (RI-MUHC). Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con el Consejo Canadiense de Cuidado Animal.

1. Ratas Lewis preñadas

1. Obtenga ratas Lewis de fuentes comerciales en el día de gestación (G)14. Alojarlos en un animalario adecuado (animalario RI-MUHC) en un entorno controlado a 20-23 °C con un ciclo de luz/oscuridad de 12 h, y acceso a agua y alimentos ad libitum¹⁷.
2. Pesar las madres diariamente para detectar cualquier comportamiento de la enfermedad desde el G14 (es decir, el día de la llegada) hasta el G22 (es decir, el día de la cesárea)

2. Crecimiento bacteriano

1. En G18, prepare dos tubos de ensayo estériles con 5 mL de caldo estéril de Infusión Cerebro-Corazón (BHI). Tome una pequeña porción de stock de bacterias congeladas (β serotipo capsular hemolítico Ia en BHI y glicerol¹⁴ al 15%) a -80 °C y agréguela en tubos de 5 mL de BHI (Figura 2).
2. Coloque los tubos en el agitador (240 rpm) durante 18 h a 37 °C.
3. En G19, prepare una solución al 3% de GBS en caldo BHI estéril recogiendo 1,5 mL de la solución incubada en 48,5 mL de caldo BHI estéril.
4. Recoja 1,5 ml de la solución de GBS al 3% más BHI en una cubeta. Con un espectrofotómetro, registre la absorción inicial como T₀ (densidad óptica (OD) _{600 nm}).
   NOTA: Cada vez se utilizó un blanco hecho con caldo BHI estéril para equilibrar el espectrofotómetro.
5. Colocar la solución al 3% en la incubadora a 37 °C con agitación a 240 rpm durante aproximadamente 2 h. Comprobar la absorción cada 20 min después de 2 h hasta alcanzar una medida de absorbancia entre 0,6 y 0,8 (OD_{600 nm}).
6. Después de alcanzar la absorbancia deseada, recoja 20 mL de solución de GBS más BHI al 3% y agréguela a un tubo de 50 mL.
7. Centrifugar (1792 x g) las muestras a 4 °C durante 13 min y lavar el GBS precipitado dos veces con 20 mL de solución salina estéril al 0,9%.
8. Suspender el GBS precipitado en 2 mL de solución salina estéril al 0,9%. Mantenga esta alícuota en hielo hasta el momento de la inyección.
9. Inyectar (por vía intraperitoneal) al grupo control 100 μL de solución salina estéril al 0,9% y al grupo GBS con 100 μL de serotipo β hemolítico Ia GBS suspendido en solución salina estéril al 0,9%.
   NOTA: La dosis inyectada fue de 10^{a 8} unidades formadoras de colonias (UFC) de SGB o solución salina (para el control). La inoculación de 10⁸ UFC ha sido bien establecida como un modelo de corioamnionitis humana. La inoculación con una dosis más alta de GBS probablemente causará la mortalidad de la madre. Inyectar menos de la dosis mencionada no imitará la infección y la inflamación.
10. Hacer diluciones entre ^10-5 y ^10-10 y colocar las diluciones por triplicado en placas de agar BHI. Para descartar la contaminación, realice dos controles negativos (sin adición de sustancia), uno en una placa de agar BHI y el otro en una placa de agar CHROMID Strepto B. Realice dos controles positivos colocando las bacterias preparadas en la placa de agar BHI y en la placa de agar CHROMID Strepto B. Coloque todas las placas en la incubadora durante la noche a 37 °C (Figura 3).
    NOTA: Las placas de agar CHROMID Strepto B son un medio selectivo para el cribado de SGB en el que las colonias de SGB aparecen de color rojo.

3. Técnica de inyección

1. En G19, retira la rata suavemente de la jaula y colócala sobre una superficie plana. Inmoviliza a la rata usando una toalla para cubrir la cabeza y la parte superior del cuerpo. Levante la pata trasera para permitir un fácil acceso al lugar de la inyección.
   NOTA: Asegúrese de que el área anatómica apropiada para la inyección esté en el cuadrante inferior derecho del abdomen para evitar la punción de órganos como la vejiga urinaria y el ciego (Figura 1).
2. Use una jeringa de insulina U-100 con una aguja de 29 G y 1/2 pulgada. Inserte el bisel de la aguja hacia arriba hacia la cabeza en un ángulo de 40-45° con respecto a la horizontal, como se muestra en la Figura 1. Realice inyecciones de GBS una vez por cada madre. Asegúrese de realizar inyecciones cada 1 h para evitar un efecto de tiempo entre las madres inoculadas.
   NOTA: Las inyecciones deben variarse entre el lado izquierdo y el derecho en los días en que se realiza más de una inyección por día.

4. Determinación de la dosis

1. En G20, verifique cuatro controles (paso 10.2) y cuente las colonias bacterianas en cada placa de agar BHI.
2. Calcular la media de colonias de SGB para cada factor de dilución (^10-5 a ^10-10) para determinar la dosis exacta inyectada de SGB

5. Cesárea y recolección de tejido

1. Realizar cesáreas en G22 (72 h post-inyección) y realizar cirugías posteriores con 1 h entre madres según el tiempo de inoculación de cada madre.
2. Anestesiar el fénix en una cámara de eutanasia con isoflurano al 2% y_O2 al 1,5_{%, para} anestesia general.
3. Coloque el dique sobre una almohadilla térmica cubierta con un apósito quirúrgico adecuado y aplique el ungüento oftálmico en el ojo para evitar que se reseque.
4. Prepare el área quirúrgica eliminando el vello de la zona abdominal inferior con una cuchilla o un bisturí.
5. Limpie el área quirúrgica con gasa estéril empapada con desinfectante.
6. Con un bisturí estéril y unas tijeras de punta fina, haz una incisión horizontal en la parte inferior del abdomen de la rata. Haz una incisión vertical a cada lado del abdomen para revelar los órganos subyacentes.
7. Separe las muestras de placenta de los fetos. Registre el peso de los fetos, las placentas y la relación feto/placenta.
8. Con un bisturí estéril, corte la placenta en dos mitades.
   1. Utilice 2-metilbutano para congelar rápidamente la mitad de la placenta y mantenerla a -80 °C hasta que sea necesario para la determinación de los niveles de proteínas mediante ELISA.
   2. Fijar la otra mitad de la placenta en formaldehído tamponado al 4% para su análisis in situ mediante inmunohistoquímica (IHC) para estudiar la expresión de GBS y células polimorfonucleares (PMN) en placentas recolectadas.
9. Decapitar para recolectar sangre de fetos vivos y transferir la sangre a los tubos separadores de gel de heparina de litio.
10. Centrifugar (18.928 x g) muestras de sangre a 4 °C para separar el plasma y almacenar las muestras de plasma a -80 °C hasta su posterior análisis.
    NOTA: Las muestras de plasma sanguíneo fetal recolectadas se utilizarán para ELISA para verificar los niveles de proteínas de diferentes citocinas en la sangre del feto.
11. Recoja las colas fetales para determinar el sexo de los fetos mediante la amplificación de una secuencia dentro del gen SRY, utilizando los siguientes cebadores (cebador directo: 5' - TAC AGC CTG AGG ACA TAT TA3'; cebador inverso: 5' - GCA CTT TAA CCC TTC GAT GA -3') como se describió anteriormente¹⁸.
12. Con una aguja de 5 ml y 23 g, extraiga sangre de la madre mediante una punción cardíaca para comprobar y comparar los niveles de proteínas de las diferentes citocinas en la sangre de la madre con los de la sangre fetal. Eutanasia de las madres mediante punción de diafragma y método de decapitación.
    NOTA: Entre animales, limpie todos los instrumentos usados con pañuelos estériles y solución salina estéril. Para realizar estudios neuropatológicos y conductuales en la progenie, las madres dieron a luz de forma natural en G23. Después de la eutanasia de las crías en el día postnatal (NP) 80, se recolectaron cerebros para estudios moleculares e histológicos.

Resultados

La inoculación IP del SGB dio lugar a una infección placentaria
La tinción inmunohistoquímica (IHQ) (mediante anticuerpos policlonales dirigidos al serotipo Ia del SGB) mostró que la infección por EGB alcanzó el compartimento decidual de la placenta. La infección también se diseminó de la decidua al laberinto, a la placa coriónica y, en algunos casos, a los fetos, lo que llevó a la muerte fetal (5,8 ± 0,8 en las crías expuestas al SGB frente a 9,3 ± 0,6...

Discusión

Pasos críticos en el protocolo
Varios pasos del protocolo son críticos y requieren algunos controles de calidad. Por ejemplo, existe el riesgo de contaminación de la población de GBS por otros patógenos. Esto se puede identificar rápidamente utilizando la técnica apropiada de identificación microbiana de GBS, como el aspecto de la colonia en el agar BHI (por ejemplo, tamaño, forma, color), colocando en duplicado la dosis de GBS β-hemolítica en agar sangre C...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 mL sterile tube	BD Biosciences
50 ml falcon tubes	Thermo Fisher	339652
Blade or scalpel	BD Medical	371716
Brain Heart Infusion Broth	Criterion (Hardy diagnostics)	C5141
CHROMID Strepto B agar plate	BioMerieux, Saint-Laurent	43461
Columbia blood agar 5 % with sheep blood medium	Thermo Scientific	R01215
Forward primer	5' - TAC AGC CTG AGG ACA TAT TA3'	Sigma
Insulin syringe	Becton, Dickinson and Co(BD)	324702
Lewis rats	Charles River Laboratories
Methylbutan	Sigma Aldrich	M32631
Microtainer blood collection tubes	Becton, Dickinson and Co(BD)	365965
Reverse primer	5' - GCA CTT TAA CCC TTC GAT GA -3'	Sigma
Serological Pipettes 1 ML	Thermo Fisher	170353N
Serological Pipettes 10 ML	Thermo Fisher	170356N
Serological Pipettes 25 ML	Thermo Fisher	170357N
Serological Pipettes 5 ML	Thermo Fisher	170355N
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