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Resumen

Aquí, describimos la construcción de mutantes nulos de Aeromonas en glicosiltransferasas específicas o regiones que contienen glicosiltransferasas, los ensayos de motilidad y la purificación de flagelos realizados para establecer la participación y función de sus enzimas codificadas en la biosíntesis de un glicano, así como el papel de este glicano en la patogénesis bacteriana.

Resumen

El estudio de la glicosilación en procariotas es un área de rápido crecimiento. Las bacterias albergan diferentes estructuras glicosiladas en su superficie cuyos glicanos constituyen un código de barras específico de la cepa. Los glicanos asociados muestran una mayor diversidad en la composición y estructura del azúcar que los de los eucariotas y son importantes en los procesos de reconocimiento bacteriano-huésped y la interacción con el medio ambiente. En las bacterias patógenas, las glicoproteínas han estado involucradas en diferentes etapas del proceso infeccioso, y las modificaciones de los glicanos pueden interferir con las funciones específicas de las glicoproteínas. Sin embargo, a pesar de los avances realizados en la comprensión de la composición, la estructura y las vías de biosíntesis de los glicanos, la comprensión del papel de las glicoproteínas en la patogenicidad o la interacción con el medio ambiente sigue siendo muy limitada. Además, en algunas bacterias, las enzimas requeridas para la glicosilación de proteínas se comparten con otras vías biosintéticas de polisacáridos, como las vías biosintéticas de lipopolisacáridos y cápsulas. La importancia funcional de la glicosilación se ha dilucidado en varias bacterias a través de la mutación de genes específicos que se cree que están involucrados en el proceso de glicosilación y el estudio de su impacto en la expresión de la glicoproteína objetivo y el glicano modificador. Las Aeromonas mesófilas tienen un flagelo polar único y O-glicosilado. Los glicanos flagelares muestran diversidad en la composición de carbohidratos y la longitud de la cadena entre las cepas de Aeromonas . Sin embargo, todas las cepas analizadas hasta la fecha muestran un derivado del ácido pseudamínico como el azúcar de enlace que modifica los residuos de serina o treonina. El derivado del ácido pseudamínico es necesario para el ensamblaje de flagelos polares, y su pérdida tiene un impacto en la adhesión, la formación de biopelículas y la colonización. El protocolo detallado en este artículo describe cómo se puede utilizar la construcción de mutantes nulos para comprender la participación de genes o regiones del genoma que contienen glicosiltransferasas putativas en la biosíntesis de un glicano flagelar. Esto incluye el potencial para comprender la función de las glicosiltransferasas involucradas y el papel del glicano. Esto se logrará comparando el mutante deficiente en glicanos con la cepa de tipo salvaje.

Introducción

La glicosilación proteica se ha descrito tanto en bacterias Gram-positivas como Gram-negativas y consiste en la unión covalente de un glicano a una cadena lateralde aminoácidos 1,2. En los procariotas, este proceso generalmente ocurre a través de dos mecanismos enzimáticos principales: O- y N-glicosilación 3. En la O-glicosilación, el glicano se une al grupo hidroxilo de un residuo de serina (Ser) o treonina (Thr). En la N-glicosilación, el glicano se une a la cadena lateral de nitrógeno amida de un residuo de asparagina (Asn) dentro de las secuencias de tripéptidos Asn-X-Ser/Thr, donde X podría ser cualquier aminoácido excepto prolina.

Los glicanos pueden adoptar estructuras lineales o ramificadas y están compuestos de monosacáridos o polisacáridos unidos covalentemente por enlaces glicosídicos. En los procariotas, los glicanos suelen mostrar diversidad en la composición y estructura del azúcar en comparación con los glicanos eucariotas4. Además, se han descrito dos vías de glicosilación bacteriana diferentes que difieren en la forma en que el glicano se ensambla y se transfiere a la proteína aceptora: glicosilación secuencial y en bloque 5,6. Para la glicosilación secuencial, el complejo glicano se acumula directamente sobre la proteína mediante la adición sucesiva de monosacáridos. En la glicosilación en bloque, un glicano preensamblado se transfiere a la proteína desde un oligosacárido ligado a lípidos por una oligosacarilasa especializada (OTasa). Se ha demostrado que ambas vías están involucradas en los procesos de glicosilación N y O 7.

La glicosilación de proteínas tiene un papel en la modulación de las propiedades fisicoquímicas y biológicas de las proteínas. La presencia de un glicano puede influir en cómo la proteína interactúa con su ligando, lo que afecta la actividad biológica de la proteína, pero también puede afectar la estabilidad de la proteína, la solubilidad, la susceptibilidad a la proteólisis, la inmunogenicidad y las interacciones microbio-huésped 8,9. Sin embargo, varios parámetros de glicosilación, como el número de glicanos, la composición del glicano, la posición y el mecanismo de unión, también podrían afectar la función y la estructura de la proteína.

Las glicosiltransferasas (GT) son las enzimas clave en la biosíntesis de glicanos complejos y glicoconjugados. Estas enzimas catalizan la formación de enlaces glicosídicos entre una fracción de azúcar de una molécula donante activada y un aceptor de sustrato específico. Los GT pueden usar nucleótidos y no nucleótidos como moléculas donantes y dirigirse a diferentes aceptores de sustrato, como proteínas, sacáridos, ácidos nucleicos y lípidos10. Por lo tanto, comprender los GT a nivel molecular es importante para identificar sus mecanismos de acción y especificidad, y también permite comprender cómo la composición de azúcar de los glicanos que modifican moléculas relevantes se relaciona con la patogenicidad. La carbohydrate Active enzyme database (CAZy)11 clasifica los GT según su homología de secuencia, lo que proporciona una herramienta predictiva ya que, en la mayoría de las familias GT, el pliegue estructural y los mecanismos de acción son invariantes. Sin embargo, cuatro razones dificultan la predicción de la especificidad del sustrato de muchos GT: 1) no se ha determinado un motivo de secuencia claro que determine la especificidad del sustrato en procariotas12, 2) muchos GT y OT muestran promiscuidad del sustrato13,14, 3) los GT funcionales son difíciles de producir en alto rendimiento en forma recombinante y 4) la identificación de sustratos donantes y aceptores es compleja. A pesar de ello, recientes estudios de mutagénesis han permitido obtener avances significativos en la comprensión de los mecanismos catalíticos y restar la unión de los GT.

En las bacterias, la O-glicosilación parece ser más frecuente que la N-glicosilación. Los sitios de O-glicosilación no muestran una secuencia de consenso, y muchas de las proteínas O-glicosiladas son secretadas o proteínas de la superficie celular, como flagelinas, pili o autotransportadores1. La glicosilación de flagelina muestra variabilidad en el número de sitios aceptores, la composición de glicanos y la estructura. Por ejemplo, Burkholderia spp flagellins tienen solo un sitio de aceptación, mientras que en Campylobacter jejuni, flagellins tienen hasta 19 sitios de aceptación15,16. Además, para algunas bacterias, el glicano es un solo monosacárido, mientras que otras bacterias poseen glicanos heterogéneos comprometidos de diferentes monosacáridos para formar oligosacáridos. Esta heterogenicidad ocurre incluso entre cepas de la misma especie. Las flagelinas de Helicobacter solo son modificadas por el ácido pseudamínico (PseAc)17, y las flagelinas de Campylobacter pueden ser modificadas por PseAc, la forma acetamidino del ácido pseudaminic (PseAm) o ácido legionamínico (LegAm), y los glicanos derivados de estos azúcares con acetil, N-acetilglucosamina o sustituciones propiónicas18,19. En Aeromonas, las flagelinas son modificadas por glicanos cuya composición varía desde un solo derivado ácido PseAc hasta un heteropolisacárido20, y la unión de glicanos a los monómeros de flagelina es siempre a través de un derivado PseAc.

En general, la glicosilación de las flagelinas es esencial para el ensamblaje del filamento flagelar, la motilidad, la virulencia y la especificidad del huésped. Sin embargo, mientras que flagelinas de C. jejuni16, H. pylori17, y Aeromonas sp. 21 no puede ensamblarse en filamento a menos que los monómeros de proteínas sean glicosilados, Pseudomonas spp. y Burkholderia spp. 15 no requieren glicosilación para el ensamblaje de flagelos. Además, en algunas cepas de C. jejuni , los cambios en la composición de azúcar del glicano flagelo afectan la interacción bacteriano-huésped y pueden desempeñar un papel en la evasión de ciertas respuestas inmunes16. La autoaglutinación es otra característica fenotípica afectada por modificaciones en la composición de los glicanos asociados con las flagelinas. Una menor autoaglutinación conduce a una reducción en la capacidad de formar microcolonias ybiopelícula 22. En algunas bacterias, la capacidad de los flagelos para desencadenar una respuesta proinflamatoria se relacionó con la glicosilación de flagelina. Así, en P. aeruginosa, la flagelina glicosilada induce una mayor respuesta proinflamatoria que la23 no glicosilada.

Las aeromonas son bacterias Gram-negativas omnipresentes en el medio ambiente, lo que les permite estar en la interfaz de todos los componentes de One Health 24. Las Aeromonas mesófilas tienen un solo flagelo polar, que se produce constitutivamente. Más de la mitad de los aislados clínicos también expresan flagelina lateral, inducible en medios o placas de alta viscosidad. Diferentes estudios han relacionado ambos tipos de flagelos con las primeras etapas de la patogénesis bacteriana25. Mientras que las flagelinas polares reportadas hasta la fecha son O-glicosiladas a 5-8 Ser o Thr residuos de sus dominios inmunogénicos centrales, las flagelinas laterales no son O-glicosiladas en todas las cepas. Aunque los glicanos de flagelo polar de diferentes cepas muestran diversidad en su composición de carbohidratos y longitudde cadena 20, se ha demostrado que el azúcar de enlace es un derivado del ácido pseudaminic.

El objetivo de este manuscrito es describir un método para obtener mutantes nulos en GTs específicos o regiones cromosómicas que contienen GT para analizar su participación en la biosíntesis de polisacáridos relevantes y en la patogenicidad bacteriana, así como el papel del propio glicano. Como ejemplo, identificamos y eliminamos una región cromosómica que contiene GT de Aeromonas para establecer su implicación en la glicosilación polar de flagelina y analizar el papel del glicano de flagelina. Mostramos cómo eliminar un GT específico para establecer su función en la biosíntesis de este glicano y el papel del glicano modificado. Aunque utilizando Aeromonas como ejemplo, el principio se puede utilizar para identificar y estudiar islas de glicosilación de flagelos de otras bacterias Gram-negativas y analizar la función de los GT implicados en la biosíntesis de otros glicanos como el lipopolisacárido del antígeno O.

Protocolo

La representación esquemática del procedimiento se muestra en la Figura 1.

1. Identificación bioinformática de la isla de glicosilación de flagelos (IFG) en Aeromonas

  1. Para identificar los grupos biosintéticos de PseAc en los genomas de Aeromonas , utilice la herramienta tblastn de la base de datos NCBI26. Primero, recupere las proteínas ortólogas a PseC y PseI de A. piscicola AH-3 (los códigos de identificación son OCA61126.1 y OCA61113.1) de bases de datos de cepas secuenciadas de Aeromonas , y luego use la herramienta tblastn para buscar sus secuencias de nucleótidos traducidos.
    NOTA: Los genes pse flanquean los FGIs de Aeromonas , con pseB y pseC ubicados en un extremo del cúmulo y pseI en el otro extremo. La ubicación del resto de los genes pse puede ser diferente de un grupo FGI a otro.
  2. Dado que esos genes de flagelina polar de muchas cepas son adyacentes a los IGI, utilice el tblastn de la base de datos NCBI para encontrar proteínas ortólogas a las flagelinas polares FlaA y FlaB de A. piscicola AH-3 (los códigos de identificación son OCA61104.1 y OCA61105.1) y los genes que las codifican.
  3. Además, los IFG de Aeromonas implicados en la biosíntesis de glicanos heteropolisacáridos (grupo II)27 contienen varios genes que codifican enzimas implicadas en la síntesis de ácidos grasos, como luxC y luxE. Utilice el tblastn de la base de datos NCBI para encontrar proteínas ortólogas a LuxC de A. piscicola AH-3 (el código de identificación es OCA61121.1) y el gen que lo codifica.

2. Generación de mutantes nulos en genes de islas de glicosilación de flagelos

NOTA: Este método de mutagénesis se basa en el intercambio alélico de productos de deleción en el marco de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando el vector suicida pDM428 (GenBank: KC795686.1). La replicación del vector pDM4 es lambda pir dependiente, y el intercambio alélico completo se coacciona mediante la utilización del gen sacB ubicado en el vector.

  1. Construcción de productos de eliminación de PCR en el marco.
    1. Diseñe dos pares de cebadores que amplifiquen las regiones de ADN aguas arriba (cebadores A y B) y aguas abajo (cebadores C y D) del gen o región seleccionada que se eliminará (Figura 2B).
    2. Asegúrese de que los cebadores A y D tengan más de 600 pb aguas arriba desde el inicio y aguas abajo desde la parada, respectivamente, del gen o genes que se van a eliminar. Estos dos cebadores deben incluir en el extremo 5' un sitio de restricción para una endonucleasa que permita la clonación en pDM4.
      NOTA: El sitio de restricción incluido en el extremo 5' de los cebadores A y D no debe ser el mismo que los sitios dentro de los amplicones AB o CD.
    3. Asegúrese de que los cebadores B y C estén dentro del gen que se va a eliminar o dentro del primer y último gen, respectivamente, de la región a eliminar. Asegúrese de que ambos cebadores (B y C) estén en el marco y ubicados entre 5-6 codones dentro del gen. Además, asegurar que ambos cebadores incluyan en el extremo 5' una secuencia complementaria de 21 pb (Tabla 1) que permita unir los amplicones de ADN AB y CD.
    4. Cultivar la cepa Aeromonas seleccionada en 5 ml de caldo de soja tríptico (TSB) durante la noche (O/N) a 30 °C. Utilice un kit disponible comercialmente para la purificación del ADN genómico y siga las instrucciones del fabricante (Tabla de materiales). Cuantificar 2 μL del ADN purificado utilizando un espectrofotómetro.
      NOTA: Utilice agua destilada doble como espacio en blanco, con el instrumento configurado para registrar la absorbancia a 260 nm. Registre la absorbancia con 2 μL de ADN purificado 3-5 veces y calcule una lectura de absorbancia promedio. Use la ley de Beer-Lambert para calcular la concentración de ADN, donde A = Ɛ.c.l. donde "A" es absorbancia, "Ɛ" es el coeficiente de extinción promedio molar para el ADN, "c" es la concentración de ADN y "l" es la longitud del camino (consulte la instrucción del fabricante para la longitud del camino de cada instrumento).
    5. Utilice 100 ng de ADN cromosómico purificado como plantilla en dos conjuntos de PCR asimétricas con cebadores A-B y C-D (Tabla de Materiales). Utilice una relación molar de 10:1 de pares de imprimación A:B y D:C (material suplementario).
      NOTA: Las PCR asimétricas permiten la amplificación preferencial de una hebra de la plantilla más que de la otra.
    6. Analizar los productos de PCR por electroforesis en un gel de agarosa al 1%. Utilice TAE (40 mM Tris-acetato, 1 mM EDTA) como tampón de funcionamiento en gel y un ajuste de potencia de 8 V/cm. Para visualizar el ADN, agregue bromuro de etidio (0,5 μg/ ml) al gel y visualice los productos de PCR utilizando una estación de bioimagen (Tabla de materiales).
    7. Elimine los amplicones del gel con un bisturí, purifique siguiendo el protocolo del fabricante (Tabla de Materiales) y cuantifiquelos.
    8. Únase a los amplicones AB y CD por sus secuencias superpuestas de 21 pb en el extremo 3' de los productos de PCR (Figura 3). Mezclar 100 ng de cada amplicón (AB y CD) en un tubo de PCR con reactivos de PCR (PRE-AD PCR), pero sin cebadores, y extender utilizando el programa de termociclador (Material Suplementario). Luego, agregue 100 μM de cebadores A y D a la reacción (AD PCR) y amplifique como un solo fragmento (Material suplementario).
    9. Analizar el producto de PCR (amplicón AD) por electroforesis en un gel de agarosa al 1% utilizando las condiciones descritas en el paso 2.1.6, extirpar el amplicón del gel, purificar siguiendo el protocolo del fabricante y cuantificar el amplicó (Tabla de Materiales).
  2. Construcción de plásmido recombinante pDM4 con la deleción in-frame.
    1. Cultivar un cultivo de O/N de Escherichia coli cc18λ pir que contenga pDM4 en caldo De Molin de Luria-Bertani (LB) (10 mL) con cloranfenicol (25 μg/mL) a 30 °C.
    2. Girar el cultivo a 5.000 x g a 4 °C y suspender el pellet en 600 μL de agua destilada estéril. Realizar la extracción y purificación del plásmido pDM4 utilizando un kit de purificación de plásmidos disponible comercialmente, siguiendo las instrucciones del proveedor (Tabla de Materiales).
    3. Digiere 1 μg de pDM4 y 400 ng de amplicón AD durante 2 h con una endonucleasa capaz de digerir ambos extremos del amplicón AD y el sitio de clonación de pDM4 (Figura 3). Siga el protocolo del fabricante de enzimas para las condiciones de reacción (Tabla de materiales).
    4. Limpie el plásmido y el amplicón digeridos con un kit de purificación de ADN y cuantifiquelos siguiendo las instrucciones del fabricante (Tabla de materiales).
    5. Para evitar la religación de la pDM4 linealizada, retire el grupo fosfato de ambos extremos 5' utilizando la enzima fosfatasa alcalina siguiendo las instrucciones del fabricante (Tabla de Materiales). Luego, limpie el plásmido tratado y cuórmelo usando un espectrofotómetro como se describe en el paso 2.1.4 (Tabla de materiales).
    6. Combine 150 ng de la pDM4 alcalina digerida y fosfatasa tratada con 95-100 ng de amplicón AD digerido en una relación vector molar:inserto de 1:4. Preparar la reacción de ligadura en un volumen de 15 μL, siguiendo las instrucciones del fabricante (Tabla de Materiales).
    7. Incubar O/N a 20 °C o durante el fin de semana a 4 °C. Después de la incubación, inactivar la ligasa T4 a 70 °C durante 20 min.
    8. Utilizar la ligadura para introducir el plásmido en la cepa EScherichia coli MC1061λpir por electroporación. Use bacterias electrocompetentes y cubetas de electroporación de 2 mm de espacio.
  3. Preparación de E. coli electrocompetente y electroporación de plásmido recombinante pDM4
    1. Inocular una sola colonia de E. coli MC1061λpir cepa en caldo Luria-Bertani (LB) Miller y cultivar O/N a 30 °C con agitación a 200 rpm.
    2. Diluir 2 mL del cultivo bacteriano en 18 mL de caldo LB e incubar a 30 °C con agitación (200 rpm) hasta alcanzar una densidad óptica (OD600) entre 0.4-0.6.
    3. Pellet el cultivo bacteriano por centrifugación a 5.000 x g y 4 °C durante 15 min. Deseche el sobrenadante y suspenda el pellet en 40 mL de H2O destilado refrigerado.
    4. Repita este paso de limpieza dos veces más para eliminar todas las sales de cultivo. Finalmente, suspenda el pellet en 4 mL de H2O destilado refrigerado y transfiera 1 mL de la suspensión a cada uno de los cuatro tubos cónicos de microfuge de 1,5 mL.
    5. Pellet el cultivo bacteriano por centrifugación a 14.000 x g y 4 °C durante 5 min. Retire el sobrenadante sin perturbar el pellet y suspenda cada pellet en 100 μL de H2O destilado refrigerado.
    6. Agregue 3-3.5 μL de la mezcla de ligadura a cada tubo e incube en hielo durante 5 min. Luego, transfiera el contenido de cada tubo a una cubeta de electroporación refrigerada de 2 mm de espacio y aplique 2 kV, 129 Ω y una constante de tiempo de alrededor de 5 ms.
      NOTA: Preenfríe las cubetas de electroporación sobre hielo. Mantenga las bacterias en hielo durante todo el procedimiento.
    7. Después de la electroporación, agregue 250 μL de medio SOC a cada una de las cuatro cubetas para recuperar su contenido, transfiéralas a un tubo de cultivo (aproximadamente 1 ml) e incube durante 1 h a 30 ° C con agitación (200 rpm).
    8. Placa las células transformadas en placas de agar Luria-Bertani (LB) suplementadas con cloranfenicol (25 μg / ml) para garantizar que todas las colonias que crecen en la placa tengan la columna vertebral del plásmido.
    9. Recoger algunas colonias de las placas de agar LB con cloranfenicol e incubar O/N a 30 °C. Cuando las colonias crezcan, verifique la inserción de la construcción de deleción en pDM4 mediante PCR utilizando cebadores que flanqueen el lado de clonación de pDM4: pDM4for y pDM4rev (Tabla 1), y colonias lisadas como plantilla (Material suplementario).
    10. Elija una colonia con un palillo de dientes estéril y sumérjalo en un tubo de 1.5 ml que contenga 15 μL de Tritón X-100 al 1%, 20 mM Tris-HCl pH 8.0, 2 mM EDTA pH 8.0. Incubar los tubos a 100 °C durante 5 min, y luego 1 min en hielo.
    11. Girar los tubos en una microfuge a 12.000 x g durante 10 min para gletear bacterias y escombros. Utilice 1 μL del sobrenadante como plantilla en la reacción de PCR (Tabla de Materiales). La temperatura de recocido del par de imprimación es de 50 °C, y la reacción de PCR requiere un 10% de DMSO (material suplementario).
    12. Inocular las colonias que amplificaron el producto de interés en 10 mL de caldo LB con cloranfenicol (25 μg/mL) y cultivar O/N a 30 °C. Extraiga el plásmido de los cultivos como se describe en los pasos 2.2.1-2.2.2. Secuencia utilizando los cebadores pDM4 siguiendo las instrucciones del fabricante (Tabla de Materiales).
  4. Transferencia de la eliminación en el marco al Aeromonas colar
    NOTA: El plásmido recombinante pDM4 debe introducirse en el plásmido seleccionado Aeromonas cepa por apareamiento triparental (Figura 4). Aeromonas la cepa tiene que ser resistente a la rifampicina para ser seleccionada después del apareamiento triparental. Por lo tanto, cultive las cepas seleccionadas O/N en TSB a 30 °C, centrífuga 2 mL, 4 mL y 6 mL de cultivos a 5.000 x g durante 15 min, suspender cada pellet en 100 μL de TSB, y placa en TSA con rifampicina (100 μg/mL).
    1. Preparar cultivos O/N de E. coli MC1061λpir con el plásmido recombinante pDM4 en agar LB con cloranfenicol de 25 μg/mL (cepa donante), la cepa Aeromonas resistente a la rifampicina en TSA con rifampicina de 100 μg/mL (cepa receptora), y la E. coli HB101 con el plásmido pRK2073 en agar LB con 80 μg/mL de espectinomicina (cepa auxiliar) a 30 °C.
    2. Cuando las colonias hayan crecido, suspenda el mismo número de colonias (10-15 colonias) de las cepas donante, receptora y ayudante suavemente con un palillo estéril en tres tubos LB con 150 μL de LB.
    3. Luego, en una placa de agar LB, sin antibióticos, mezcle las tres suspensiones bacterianas en dos gotas en un receptor: ayudante: proporción de donante de 5: 1: 1 (50 μL del receptor, 10 μL del donante y 10 μL de ayudante). Incubar la placa boca arriba O/N a 30 °C. Realizar el control negativo de la conjugación utilizando la cepa donante sin plásmido recombinante.
      NOTA: La cepa auxiliar transporta el plásmido conjugativo pRK2073 y ayuda a la transferencia de la pDM4 a las Aeromonas. No use vórtice para suspender las distensiones del donante, el receptor y el ayudante para evitar romper el pili.
    4. Cosecha las bacterias de la placa de agar LB agregando 1 ml de caldo LB y extendiéndola con un esparcidor de vidrio estéril para obtener una suspensión bacteriana. Use una pipeta para transferir la suspensión bacteriana a un tubo cónico de microfuge de 1.5 ml y vórtice vigorosamente.
    5. Para seleccionar las colonias receptoras que contienen el plásmido recombinante pDM4, placa 100 μL de la suspensión bacteriana cosechada en placas de agar LB con rifampicina (100 μg/mL) y cloranfenicol (25 μg/mL).
    6. Girar 200 μL y 600 μL de las muestras en una microfuga a 5.000 x g durante 15 min, suspender el pellet en 100 μL de caldo LB y enchapar en agar LB con rifampicina (100 μg/mL) y cloranfenicol (25 μg/mL). Incubar todas las placas durante 24-48 h a 30 °C.
    7. Recoger las colonias cultivadas, transferir a placas LB con rifampicina (100 μg/mL) y cloranfenicol (25 μg/mL), e incubarlas O/N a 30 °C. A continuación, confirmar que las colonias son Aeromonas mediante la prueba de oxidasa29 y que se insertó plásmido recombinante pDM4 (primera recombinación) en la región cromosómica específica mediante PCR utilizando los cebadores E y F (Material Suplementario), que se unen fuera de la región amplificada con los cebadores A y D (Tabla de Materiales). Como se describe en el paso 2.3.11, utilice 1 μL de colonias lisadas como plantilla.
    8. Para completar el intercambio alélico para la eliminación en el marco, coaccionar a las colonias con el plásmido suicida integrado a una segunda recombinación. Cultivar las colonias recombinantes en 2 mL de LB con sacarosa al 10% y sin antibióticos, O/N a 30 °C.
    9. Placa 100 μL de los cultivos bacterianos del paso 2.4.8 en placa de agar LB con sacarosa (10%). Además, placa 100 μL de diferentes diluciones de cultivo (10-2-10-4) e incubaR O/N a 30 °C.
    10. Para confirmar la pérdida de pDM4, recoja las colonias, transfiera a placas LB con y sin cloranfenicol (25 μg/mL), incube O/N a 30 °C y luego seleccione las colonias sensibles al cloranfenicol.
    11. Analizar las colonias sensibles mediante PCR utilizando el par de cebadores E-F y 1 μL de colonias lisadas como plantilla (Tabla de Materiales y Material Complementario). Seleccione las colonias cuyo producto de PCR se correlacionó con el tamaño de la construcción eliminada.

3. Ensayos de motilidad

NOTA: En algunas especies bacterianas con flagelos glicosilados, las modificaciones en los niveles de glicosilación o composición de glicanos afectan el ensamblaje de flagelinas, que generalmente se refleja como una reducción de la motilidad o ausencia de motilidad. Por lo tanto, se realizaron dos ensayos de motilidad con los mutantes nulos.

  1. Ensayo de motilidad en medios líquidos
    1. Cultivo Aeromonas cepaS O/N en 1 mL de TSB a 25-30 °C. Para adherir un portaobjetos de la cubierta del microscopio a un portaobjetos excavado, tome una pequeña cantidad de silicona con la punta de un palillo de dientes y coloque una pequeña gota en las cuatro esquinas del portaobjetos de la cubierta. Luego, deposite 1 μL del cultivo de Aeromonas en el centro de la diapositiva de la cubierta y mezcle en una gota de medios TSB frescos (2 μL).
    2. Coloque un portaobjetos excavado en el tobogán de la cubierta. Haga coincidir la excavación con la gota depositada, presione suavemente y gire la diapositiva boca abajo.
    3. Analizar la motilidad de la natación mediante microscopía de luz utilizando un microscopio óptico (Tabla de Materiales) con un objetivo 100x utilizando aceite de inmersión.
      NOTA: La cepa de tipo salvaje de Aeromonas debe usarse como control positivo. Como control negativo, use una bacteria no flagelada como Klebsiella.
  2. Ensayo de motilidad en medios semisólidos
    1. Cultivo Aeromonas cepas O/N en TSB (1 mL) a 25-30 °C. Luego, transfiera 3 μL del cultivo al centro de una placa de agar suave (1% de triptona, 0.5% de NaCl, 0.25% de bacto agar) e incube la placa boca arriba O / N a 25-30 ° C.
    2. Usando una regla, mida la migración bacteriana a través del agar desde el centro de la placa hacia la periferia.

4. Purificación de flagelos

  1. Aislamiento de flagelos anclados a la superficie bacteriana
    1. Cultivo Aeromonas cepas O/N en TSB (10 mL) a 25-30 °C. Luego, expanda el cultivo en un matraz con TSB (900 mL) y deje que crezca O/N a 25-30 °C con agitación (200 rpm).
    2. Centrifugar a 5.000 x g durante 20 min a 4 °C. Suspender el pellet en 20 mL de tampón Tris-HCl de 100 mM (pH 7.8).
    3. Para retirar los flagelos anclados, corte la suspensión en un vórtice con una barra de vidrio (2-3 mm de diámetro) durante 3-4 min, y luego pase repetitivamente (mínimo seis veces) a través de una jeringa de 21 G.
    4. Bacterias de pellets por dos centrifugaciones consecutivas a 4 °C: primero, a 8.000 x g durante 30 min. Retire el sobrenadante y la centrífuga a 18.000 x g durante 20 min. Recoge el sobrenadante, que contiene flagelos libres.
    5. Ultracentrifugar el sobrenadante a 100.000 x g durante 1 h a 4 °C y suspender el pellet en 150 μL de 100 mM Tris-HCl (pH 7,8) más 2 mM de tampón EDTA. El pellet contiene filamentos de flagelos.
    6. Analizar 5-10 μL del pellet resuspendido del paso 4.1.5 por electroforesis en un gel SDS-Poliacrilamida al 12% y visualizar las proteínas utilizando tinción azul Coomassie.
      NOTA: Siga las instrucciones del fabricante para la electroforesis de proteínas y la tinción en gel. Como control positivo de la flagelina glicosilada, utilice los flagelos purificados de la cepa de tipo salvaje. Purificar la fracción enriquecida de flagelos en un gradiente de cloruro de cesio (ClCs).
  2. Gradiente de cloruro de cesio para purificar flagelos.
    1. Mezclar 12,1 g de CsCl con 27 mL de H2O destilado.
    2. Transfiera la fracción enriquecida de flagelos (150 μL) a un tubo ultra claro de pared delgada (14 mm x 89 mm) (Tabla de materiales) y llénelo con 12 ml de solución CsCl.
    3. Ultracentrífuga el tubo a 60.000 x g durante 48 h a 4 °C en un rotor de cucharón oscilante (Tabla de Materiales).
    4. Recoge la banda de flagelos en el gradiente CsCl con una jeringa y dializa contra 100 mM Tris-HCl (pH 7,8) más 2 mM EDTA. A continuación, analizar los flagelos dializados por electroforesis en un gel SDS-Poliacrilamida al 12% y tinción azul coomassie (paso 4.1.6) o por espectrometría de masas.

Resultados

Esta metodología proporciona un sistema eficaz para generar mutantes nulos en genes o regiones cromosómicas de Aeromonas que pueden afectar la glicosilación de flagelos y el papel del filamento de flagelos (Figura 1).

El protocolo comienza con la identificación bioinformática de los supuestos IGI y los genes que codifican los GT presentes en esta región. En Aeromonas, la localización cromosómica de los FGIs se basa en la detección de tre...

Discusión

El primer paso crítico de este método es la identificación de regiones involucradas en la glicosilación de flagelos y GTs putativos porque estas enzimas muestran alta homología y están involucradas en muchos procesos. El análisis bioinformático de los genomas de Aeromonas en bases de datos públicas muestra que esta región es adyacente a la región de flagelos polares 2, que contiene los genes de flagelina en muchas cepas y contiene genes involucrados en la biosíntesis del ácido pseudamínico

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por el National Research Council Canada, para el Plan Nacional de I+D (Ministerio de Economía y Competitividad, España) y para la Generalitat de Catalunya (Centre de Referència en Biotecnologia).

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
ABI PRISM Big Dye Terminator v. 3.1 Cycle Sequencing Ready Reaction KitApplied Biosystems4337455Used for sequencing
AccuPrime Taq DNA Polymerase, high fidelityInvitrogen12346-086Used for amplification of AB, CD and AD fragments
AgaroseConda-Pronadise8008Used for DNA electrophoresis
Alkaline phosphatase, calf intestinal (CIAP)PromegaM1821Used to remove phosphate at the 5’ end
Bacto agarBecton Dickinson214010Use for motility analysis
BamHIPromegaR6021Used for endonuclease restriction
BglIIPromegaR6081Used for endonuclease restriction
BioDoc-It Imagin SystemUVPBio-imaging station used for DNA visualization
Biotaq polymeraseBiolineBIO-21040Used for colony screening
Cesium chlorideApplichemA1126,0100Used for flagella purification
ChloramphenicolApplichemA1806,0025Used for triparental mating
Cytiva illustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification KitCytivia28-9034-71Used for purification of PCR amplicons and DNA fragments.
EDTAApplichem131026.1211Used for DNA electrophoresis
Electroporation cuvettes 2 mm gapVWR732-1133Used for transformation
Ethidium bromideApplichemA1152,0025Use for DNA visualization
HyperLadder 1 Kb markerBiolineBIO-33053DNA marker
Invitrogen Easy-DNA gDNA Purification KitInvitrogen10750204Used for bacterial chromosomal DNA purification
Luria-Bertani (LB) Miller agarCondalab996Used for Escherichia coli culture
Luria-Bertani (LB) Miller brothCondalab1551Used for Escherichia coli culture
Nanodrop ND-1000NanoDrop Techonologies IncSpectrophotometer used for DNA quantification
RifampicinApplichemA2220,0005Used for triparental mating
SOC MediumInvitrogen15544034Used for electroporation recovery
SpectinomycinApplichemA3834,0005Used for triparental mating
SW 41 Ti Swinging-Bucket RotorBeckman331362Used for flagella purification
T4 DNA ligaseInvitrogen15224017Used for ligation reaction
Trypticasein soy agarCondalab1068Used for Aeromonas grown
Trypticasein soy brothCondalab1224Used for Aeromonas grown
TryptoneCondalab1612Use for motility analysis
TrisApplichemA2264,0500Used for DNA electrophoresis and flagella purification
Triton X-100ApplichemA4975,0100Used for bacterial lysis
Ultra Clear tubes (14 mm x 89 mm)Beckman344059Used for flagella purification
Veriti 96 well Thermal CyclerApplied BiosystemsUsed for PCR reactions
Zyppy Plasmid Miniprep II KitZymmo researchD4020Used for isolation of plasmid DNA

Referencias

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