Uso de tinción de rojo de alizarina para detectar la pérdida ósea inducida químicamente en larvas de pez cebra

Resumen

Aquí, hemos utilizado la tinción de rojo alizarina para mostrar que la exposición al acetato de plomo causa un cambio de masa ósea en las larvas de pez cebra. Este método de tinción se puede adaptar a la investigación de la pérdida ósea en larvas de pez cebra inducida por otros tóxicos peligrosos.

Resumen

La pérdida ósea inducida químicamente debido a la exposición al plomo (Pb) podría desencadenar una serie de impactos adversos en los sistemas esqueléticos humanos y animales. Sin embargo, los efectos y mecanismos específicos en el pez cebra siguen sin estar claros. El rojo de alizarina tiene una alta afinidad por los iones de calcio y puede ayudar a visualizar el hueso e ilustrar la masa mineral esquelética. En este estudio, nuestro objetivo fue detectar la pérdida ósea inducida por acetato de plomo (PbAc) en larvas de pez cebra mediante el uso de tinción de rojo de alizarina. Los embriones de pez cebra fueron tratados con una serie de concentraciones de PbAc (0, 5, 10, 20 mg/L) entre 2 y 120 h después de la fecundación. La tinción esquelética de montaje completo se realizó en larvas a los 9 días posteriores a la fertilización, y el área total teñida se cuantificó utilizando el software ImageJ. Los resultados indicaron que los tejidos mineralizados se tiñeron de rojo, y el área teñida disminuyó significativamente en el grupo de exposición a PbAc, con un cambio dependiente de la dosis en la mineralización ósea. Este artículo presenta un protocolo de tinción para investigar los cambios esqueléticos en los defectos óseos inducidos por PbAc. El método también se puede utilizar en larvas de pez cebra para la detección de la pérdida ósea inducida por otros productos químicos.

Introducción

Estudios recientes han confirmado que la osteoporosis debida a glucocorticoides, inhibidores de la aromatasa y consumo excesivo de alcohol es común ^1,2. El plomo (Pb) es un metal tóxico que se encuentra en las plantas, el suelo y los ambientes acuáticos³. Aunque los efectos adversos de Pb en el cuerpo humano han atraído mucha atención, su impacto irreversible en el hueso necesita ser investigado más a fondo. La intoxicación por plomo causa una amplia gama de cambios patológicos tanto en el esqueleto en desarrollo como en el adulto, que afectan las actividades normales de la vida. Los es....

Protocolo

Todos los procedimientos con animales descritos aquí han sido revisados y aprobados por el Instituto de Cuidado de Animales del Comité de Ética de la Universidad de Soochow.

1. Cría de peces y recolección de embriones ¹⁴

1. Alimente a los peces tres veces al día; Asegúrese de que el pez cebra se mantenga a 28,5 ± 0,5 °C con un ciclo de luz/oscuridad de 14:10 h.
2. Separe los peces adultos machos y hembras mediante tablas de aislamiento en tanques de desove en una proporción de macho a hembra de 2: 1 por la noche.
3. A la mañana siguiente, retire las tablas de aislamiento a las 9:....

Resultados

La tinción de rojo alizarina es un método sensible y específico para medir los cambios en la mineralización ósea en larvas de pez cebra. En este estudio, hemos observado que PbAc tuvo efectos adversos sobre las larvas de pez cebra, incluyendo muerte, malformación, disminución de la frecuencia cardíaca y acortamiento de la longitud corporal. Además, se evaluaron las áreas de esqueleto mineral de las larvas de pez cebra para examinar la pérdida ósea inducida por PbAc. A 9 dpf (Figura 1A

Discusión

El pez cebra es un modelo adecuado para estudiar la enfermedad metabólica ósea. En comparación con los modelos de roedores, los modelos de pez cebra son relativamente rápidos de establecer, y la medición de la gravedad de la enfermedad es más fácil. En larvas de pez cebra de tipo salvaje, la mineralización del esqueleto de la cabeza ocurre a 5 dpf y el esqueleto axial a 7 dpf¹⁵. Por lo tanto, los huesos craneales como PS, OP, CB y NC están bien desarrollados a 9 dpf. Después de que las l.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M Tris-HCl (pH=7.5)	Solarbio,Beijing,China	21	for detaining
4% Paraformaldehyde Fix Solution	BBI,Shanghai,China	14	fixing tissues
10x PBS buffer	BBI,Shanghai,China	15	for fixing
35% H2O2	Yonghua,Jiangsu,China	8	removing pigment
50 mL Centrifuge tube	AKX,Jiangsu,China	4
95% Anhydrous ethanol	Enox,Jiangsu,China	2	destaining
Alizarin red (Purity 99.5%)	Solarbio,Beijing,China	1	staining
Biochemical incubator	Yiheng,Shanghai,China	3	raising zebrafish embryos
Electronic scale	Sartorius,Germany	5	weighing the solid raw materials
Glycerin (Purity 99.5%)	BBI,Shanghai,China	7	storing the stained fish
ImageJ (software)	USA	9	digital analysis
KOH (Purity 99.9%)	Sigma,America	10	bleaching solution
Lead acetate trihydrate (Purity 99.5%)	Aladdin,Shanghai,China	11
MgCl2 (Purity 99.9%)	Aladdin,Shanghai,China	12	cleaning solution
NIS-Elements F (software)	Nikon, Japan	13	observing and taking photos
Pipe	AKX, Jiangsu, China	18	removal of embryos and solution
plates (24-well)	Corning,America	17	container for staining embryos
plates (6-well)	Corning,America	16	container for breeding embryos
Shaking table	Beyotime, China	19	mixing the solution
Stereo microscope	Nikon,Japan	20	observing and taking photos
Zebrafish	Zebrafish Experiment Center of Soochow University,Suzhou,China	22	experimental animal