Cuantificación de especies reactivas de oxígeno utilizando sonda de dicacetato de 2′,7′-diclorofluoresceína y citometría de flujo en células gliales de Müller

Resumen

Aquí, proponemos un protocolo sistematizado, accesible y reproducible para detectar especies reactivas celulares de oxígeno (ROS) utilizando una sonda de dicacetato de 2′,7′-diclorofluoresceína (DCFH-DA) en células gliales de Müller (MGC). Este método cuantifica los niveles totales de ROS celulares con un citómetro de flujo. Este protocolo es muy fácil de usar, adecuado y reproducible.

Resumen

El equilibrio redox tiene un papel importante en el mantenimiento de la homeostasis celular. El aumento de la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS) promueve la modificación de proteínas, lípidos y ADN, lo que finalmente puede conducir a la alteración de la función celular y la muerte celular. Por lo tanto, es beneficioso para las células aumentar su defensa antioxidante en respuesta a insultos perjudiciales, ya sea activando una vía antioxidante como Keap1 / Nrf2 o mejorando los eliminadores redox (vitaminas A, C y E, β caroteno y polifenoles, entre otros). La inflamación y el estrés oxidativo están involucrados en la patogénesis y progresión de las retinopatías, como la retinopatía diabética (RD) y la retinopatía del prematuro (ROP). Dado que las células gliales de Müller (MGC) desempeñan un papel clave en la homeostasis del tejido retiniano neural, se consideran un modelo ideal para estudiar estos mecanismos de protección celular. En este sentido, cuantificar los niveles de ROS con un método reproducible y sencillo es fundamental para valorar el aporte de vías o moléculas que participan en el mecanismo de defensa celular antioxidante. En este artículo, proporcionamos una descripción completa de los procedimientos necesarios para la medición de ROS con sonda DCFH-DA y citometría de flujo en MGC. Aquí se proporcionan pasos clave para el procesamiento de datos de citometría de flujo con el software, por lo que los lectores podrán medir los niveles de ROS (medios geométricos de FITC) y analizar histogramas de fluorescencia. Estas herramientas son muy útiles para evaluar no solo el aumento de ROS después de un insulto celular, sino también para estudiar el efecto antioxidante de ciertas moléculas que pueden proporcionar un efecto protector sobre las células.

Introducción

La retina neural es un tejido muy organizado que presenta capas neuronales bien definidas. En estas, las neuronas (células ganglionares, amacrinas, bipolares, horizontales y fotorreceptoras) están interconectadas entre sí y también con células gliales de Müller (MGC) y astrocitos, lo que lleva a una adecuada fototransducción y procesamiento de la información visual ^1,2. Se sabe que los MGC tienen un papel importante en el mantenimiento de la homeostasis retiniana porque atraviesan toda la sección retiniana y, por lo tanto, pueden interactuar con todos los tipos de células que modulan múltiples procesos protectores. Se ha reportado que los MGC tienen varias funciones importantes para el mantenimiento y la supervivencia de las neuronas retinianas, incluyendo la glucólisis para proporcionar energía a las neuronas, la eliminación de desechos neuronales, el reciclaje de neurotransmisores y la liberación de factores neurotróficos, entre otros ^3,4,5.

Por otro lado, la inflamación, el estrés oxidativo y nitrosativo están implicados en la patogénesis y progresión de muchas enfermedades humanas, incluidas las retinopatías ^{6,7,8,9,10,11}. El equilibrio redox en las células depende de una regulación estricta de los niveles de ROS. Las ROS se generan constantemente en condiciones fisiológicas como resultado de la respiración aeróbica principalmente. Los principales miembros de la familia ROS incluyen radicales libres reactivos como el anión superóxido (O_2͘͘͘͘^•−), radicales hidroxilo (^•OH), varios peróxidos (ROOR′), hidroperóxidos (ROOH) y el peróxido de hidrógeno sin radicales (H₂O₂)^12,13. En los últimos años, se ha hecho evidente que las ROS desempeñan un importante papel de señalización en las células mediante el control de procesos esenciales. Los MGC tienen una fuerte defensa antioxidante por la activación del factor nuclear transcripcional eritroide-2 relacionado con el factor 2 (Nrf2) y la posterior expresión de proteínas antioxidantes para eliminar la producción excesiva de ROS en condiciones patológicas 14,15,16. Cuando las células pierden su equilibrio redox debido a una producción exagerada de ROS o una capacidad defectuosa para eliminar ROS, la acumulación de estrés oxidativo promueve modificaciones dañinas en proteínas, lípidos y ADN, lo que lleva al estrés celular o la muerte. El aumento del sistema de defensa antioxidante de la retina mejora la resolución y prevención de retinopatías, como roP y RD 17,18,19,20,21,22,23,24. Por lo tanto, la medición de la producción de ROS en tiempo real es una herramienta poderosa y útil.

Existen varios métodos para medir la producción de ROS o el estrés oxidativo en las células. Entre estos, la sonda de 2′,7′-diclorofluoresceína diacetato (DCFH-DA) es una de las técnicas más utilizadas para cuantificar directamente el estado redox de una célula 25,26,27,28. Esta sonda es lipofílica y no fluorescente. La difusión de esta sonda a través de la membrana celular permite su escisión por esterasas intracelulares en los dos enlaces éster, produciendo un producto relativamente polar e impermeable a la membrana celular, 2′,7′-diclorofluoresceína (H₂DCF). Esta molécula no fluorescente se acumula intracelularmente, y la posterior oxidación por ROS produce el producto altamente fluorescente DCF. La oxidación de la sonda es producto de la acción de múltiples tipos de ROS (peroxinitrito, radicales hidroxilo, óxido nítrico o peróxidos), que pueden detectarse mediante citometría de flujo o microscopía confocal (emisión a 530 nm y excitación a 485 nm). La limitación de esta técnica es que el superóxido y el peróxido de hidrógeno no reaccionan fuertemente con H₂DCF^25,29. En este artículo, utilizamos la sonda DCFH-DA para medir y cuantificar ROS por citometría de flujo. Por esa razón, inducimos la producción de ROS estimulando mgC con inductor de ROS, A o B, antes de cargar las células con la sonda fluorescente. Además, utilizamos un compuesto antioxidante. Finalmente, mostramos datos representativos y fiables obtenidos utilizando este protocolo.

Protocolo

NOTA: Para las composiciones de búfer, consulte la Tabla 1.

1. Preparación del cultivo celular

NOTA: Aquí se describe la preparación del cultivo de células MIO-M1, una línea celular glial humana de Müller inmortalizada espontáneamente (Moorfield's/Institute of Ophthalmology- Müller 1). Utilice siempre la técnica aséptica adecuada y trabaje en una campana de flujo laminar.

1. Prepare el medio completo modificado eagle 's medium (DMEM) de Dulbecco. A DMEM que contiene 4,5 g/L de D-glucosa y 110 mg/L de piruvato de sodio, agregue 10% de FBS inactivado por calor, 10 mM de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinatenosulfónico (HEPES), 2 mM de L-glutamina y 50 U/mL de penicilina/estreptomicina. Prepare el medio fresco, el día en que se descongelarán las células MIO-M1.
2. Descongele las células MIO-M1 congeladas el día 1.
   1. Para hacer esto, retire el criovial que contiene 5 x 10⁵ células MIO-M1 en FBS con 10% dmSO del almacenamiento de nitrógeno líquido e inmediatamente colóquelo en un baño de agua de 37 ° C.
      NOTA: Siempre use una máscara facial o gafas de seguridad, ya que los crioviales almacenados en nitrógeno líquido presentan un riesgo de explosión cuando se descongelan.
   2. Descongele las células MIO-M1 rápidamente (en menos de 1 min) calentando el vial en el baño de agua a 37 °C hasta que quede solo un poco de hielo en el vial.
   3. Limpie el exterior del vial con etanol al 70% y transfiéralo a una campana de flujo laminar.
   4. Transfiera las células descongeladas del vial a un tubo estéril de 15 ml y luego agregue 6 ml de medio DMEM completo precalentado gota a gota.
   5. Centrifugar la suspensión celular a aproximadamente 600 x g durante 5 min. Después de la centrifugación, se visualizará un sobrenadante transparente y un pellet completo. Deseche el sobrenadante con una pipeta sin perturbar la bolita celular.
   6. Disociar suavemente el pellet y resuspendir las células en 10 ml de medio DMEM completo. Transfiera esta suspensión celular a una placa de cultivo de tejido de 100 mm de diámetro e incube la placa durante aproximadamente 2 días a 37 °C, 5% CO₂.
3. Cuando las células MIO-M1 se vuelvan 80%-90% confluentes en el día 4, realice los siguientes pasos.
   1. Transfiera la placa a una campana de flujo laminar desde la incubadora. Retire con cuidado el sobrenadante y lave 2 veces con 5 ml de PBS estéril y precalentado. Aspirar el PBS.
   2. Dispensar 1 ml de solución de tripsina-EDTA al 0,5% e incubar a 37 °C en la incubadora de CO₂ durante 3-5 min para separar las células.
   3. Agregue 7 ml del medio DMEM completo para inhibir la acción de la tripsina. Desagregar los MGC tripsinizados agrupados mediante el pipeteo lento hacia arriba y hacia abajo (P1000). Recoger la suspensión celular en un tubo de 15 ml.
   4. Centrifugadora a 600 x g durante 5 min. Deseche el sobrenadante. Resuspender suavemente el pellet celular en 2 ml de medios DMEM completos. Transfiera 1 ml de esta suspensión celular a una placa de 100 mm que contenga 9 ml de medio DMEM completo precalentado.
   5. Repite la acción con otra placa de 100 mm. Incubar la placa durante aproximadamente 1 día a 37 °C en una incubadora de CO_{2 al} 5%.
4. Cuando ambas placas se vuelvan confluentes al 80% -90% (en el día 6), transfiera la placa a una campana de flujo laminar. Siga el paso 1.3. para obtener un pellet celular.
5. Disociar suavemente el pellet y resuspendir las células en 5 ml de medios DMEM completos. Cuente las células MIO-M1 utilizando un hemocitómetro (cámara de Neubauer) y una solución de azul tripano siguiendo los pasos a continuación.
   1. Coloque la cubierta de vidrio en el área central de la cámara Neubauer. Coloque la cámara sobre una superficie plana (por ejemplo, una mesa o banco de trabajo).
   2. Mezcle un volumen igual de tinción azul tripano con las células. Por ejemplo, mezcle 60 μL de azul de tripano con 60 μL de células para una dilución de 1:2.
   3. De esta mezcla, cargue 10 μL con una micropipeta en una cámara Neubauer.
   4. Coloque la cámara Neubauer cargada en el escenario del microscopio. Luego, encienda la luz y ajuste el brillo.
   5. Mueva la etapa del microscopio a una posición óptima y ajuste el enfoque hasta obtener una imagen nítida de las células.
   6. Cuente las celdas dentro de los cuatro cuadrados (subdivididos en 16) ubicados en la esquina del hemocitómetro (volumen: 0.1 mm³ cada uno).
   7. Calcule la concentración de células utilizando las ecuaciones a continuación.
      Concentración = (Número de celdas x 10.000)/Número de cuadrados
      Concentración = (Número de células x 10.000)/4
      Concentración = Número de células x 2500
      NOTA: Si se realiza la dilución celular, la concentración obtenida debe convertirse a la concentración original antes de la dilución.
      Concentración = (Número de células x 2500 x 2) = (Número de células x 5000 células/ml)
   8. Ajuste la suspensión celular a 1 x 10⁵ celdas/ml en medio DMEM completo y placa 2 mL de esta suspensión celular en una placa de 6 pocillos (2 x 10⁵ celdas/pocillo). Agite la placa suavemente para distribuir las células de manera homogénea. Incubar la placa de 6 pocillos durante la noche a 37 °C en una incubadora de_{CO 2 al} 5%.

2. Condiciones y controles del ensayo

1. Incluya los siguientes controles experimentales para cada experimento:
   1. Control de autofluorescencia (células sin sonda DCFH-DA, control para ajustar los parámetros del citómetro de flujo).
   2. Control basal (células no estimuladas).
   3. Control positivo (células tratadas con un inductor ros, A o B).
   4. Control negativo (células tratadas con compuesto antioxidante)
   5. Muestra (células tratadas con compuesto antioxidante e inductor de ROS, A o B).

3. Realización del ensayo

NOTA: El ensayo se realiza el día 7. Siempre use la técnica aséptica adecuada y trabaje en una campana de flujo laminar a menos que se indique lo contrario.

1. Preparar DMEM sérico bajo. Suplemento DMEM que contiene 4,5 g/L de D-glucosa y 110 mg/L de piruvato de sodio con 0,5% de FBS inactivado por calor, 10 mM de HEPES, 2 mM de L-glutamina y 50 U/mL de penicilina/estreptomicina. Prepare el medio fresco el día en que se tratará el MIO-M1.
2. Transfiera la placa de 6 pocillos (60%-70% de confluencia) a una campana de flujo laminar desde la incubadora. Aspire el sobrenadante y lave las células 1x con PBS. Agregue 2 ml del DMEM sérico bajo por pocillo e incube la placa de 6 pocillos durante 2 h a 37 ° C, 5% CO₂. Esto se hace para matar de hambre a las células.
3. Después de morir de hambre en suero, trate las células con el compuesto antioxidante durante 6 h.
   1. Aspirar el sobrenadante y añadir 2 mL de la cepa diluida a las siguientes condiciones: control negativo (células tratadas con compuesto antioxidante) y muestra (células tratadas con compuesto antioxidante e inductor de ROS, A o B).
   2. Incubar la placa de 6 pocillos durante 6 h a 37 °C, 5% CO₂.
      NOTA: Si usa otro compuesto antioxidante o inhibidor de ROS, estandarice el tiempo y la concentración óptimos para los estímulos.
4. Después de 6 h de incubación, trate las células con inductor de ROS, A o B, durante 30 min.
   1. Añadir los estímulos a las siguientes condiciones: control positivo (células tratadas con un inductor de ROS, A o B) y pocillos de muestra (células tratadas con compuesto antioxidante e inductor de ROS, A o B).
      NOTA: Mantenga las soluciones de stock en hielo.
   2. Incubar la placa de 6 pocillos durante 30 min a 37 °C, 5% CO₂.
      NOTA: Si utiliza otro inductor de ROS, estandarice adecuadamente el tiempo y la concentración óptimos para los estímulos.
5. Cargue las celdas con la sonda DCFH-DA.
   1. Aspire el sobrenadante y lave las células en la placa de 6 pocillos 3x con PBS para eliminar todos los estímulos.
   2. Apague la luz de la campana de flujo laminar y trabaje en la oscuridad. Preparar una dilución de 1:1000 de la solución madre de sonda DCFH-DA de 5 mM para obtener una concentración final de 5 μM DCFH-DA en DMEM sin rojo fenol en un tubo de 15 mL.
   3. Mezcle suavemente con un vórtice y agregue 1 ml de esta solución a los siguientes pocillos: control basal (células no estimuladas), control positivo (células tratadas con un inductor de ROS), control negativo (células tratadas con compuesto antioxidante) y pocillos de muestra (células tratadas con compuesto antioxidante e inductor de ROS, A o B).
   4. Añadir 1 ml de DMEM sin rojo fenol a las células de control de la autofluorescencia.
   5. Incubar la placa de 6 pocillos durante 30 min a 37 °C, 5% CO₂.
      NOTA: La sonda es sensible a la luz. Deseche toda la solución de sonda no utilizada.

4. Preparación celular para citometría de flujo

1. Después de 6 h, mantenga la placa en hielo. A partir de este paso, no es necesario utilizar una técnica aséptica adecuada y trabajar en una campana de flujo laminar.
2. Lave las células 3 veces con 2 ml de PBS frío por pozo. Agregue 0.5 ml de tampón de separación en frío a cada pozo. Cosecha las células canalizando suavemente hacia arriba y hacia abajo usando una pipeta P1000.
3. Recójalos en tubos etiquetados de 1,5 ml y centrífuga a 600 x g durante 5 min a 4 °C.
   NOTA: Al cosechar las células, evite la formación de burbujas ajustando la pipeta P1000 a 0,4 ml. A partir de este paso, trabaje rápido.
4. Cuando termine la centrifugación, coloque tubos etiquetados de 1,5 ml con las células en hielo. Deseche el sobrenadante con cuidado y disocie suavemente el gránulo celular con golpeteo.
5. Agregue 1 ml de tampón FACS a cada tubo etiquetado de 1,5 ml para lavar las células. Si es necesario, use un vórtice en su intensidad más baja para la disociación completa del pellet celular. Centrifugarlos a 600 x g durante 5 min a 4 °C. Repita estos pasos 2 veces más. (Realizar tres lavados en total).
6. Cuando termine el último lavado, etiquete 5 ml de tubos de poliestireno de fondo redondo (tubos de citometría de flujo) para todas las condiciones experimentales (consulte el paso 2).
7. Cuando finalice la centrifugación, resuspender los gránulos celulares en 200 μL de tampón FACS. Disociar suavemente el pellet en cada tubo de 1,5 ml mediante el uso de un vórtice. Transfiera a tubos de fondo redondo de 5 ml etiquetados. Mantenga los tubos en hielo hasta que se analicen en el citómetro de flujo.

5. Adquisición de datos en un citómetro de flujo

1. Usando el software de citometría de flujo, cree un nuevo experimento. Para ello, en la barra de menús, vaya a Experimento y haga clic en Nuevo experimento (Ctrl+E).
2. Además, en la barra de menús, vaya a Ver y haga clic en las siguientes opciones: Barra de herramientas, Barra de estado, Navegador, Citómetro, Inspector, Hoja de cálculo, Panel de adquisición y Editor biexponencial para ver estas ventanas en el espacio de trabajo.
3. A la izquierda del software, haga clic en el Specimen_001 . Esto abrirá una lista de tubos (Tube_001, Tube_002, etc.). Para etiquetar los tubos para los controles y las diferentes condiciones experimentales, haga doble clic en Tube_001, Tube_002, etc. y cámbiele el nombre (consulte el paso 2.).
4. Seleccione los canales/parámetros a analizar (FSC, SSC, FITC y APC o cualquier otro fluorocromo para ver el cuadrante) en el primer tubo desde la configuración del citómetro del experimento.
5. Haga clic en el icono Puntero de tubo actual para seleccionar el tubo y el icono cambiará a verde. Coloque el tubo de "control de autofluorescencia" en el brazo del aspirador, moviendo la base con cuidado solo hacia la izquierda.
   1. Para ejecutar el ejemplo "control de autofluorescencia", vaya a la ventana Panel de adquisición y haga clic en Adquirir datos. Abra un diagrama de puntos para FSC (en el eje x) versus SSC (en el eje y).
   2. Ajuste rápidamente el voltaje de dispersión hacia adelante y lateral para asegurarse de que los eventos aparezcan en el gráfico. En la ventana Panel de adquisición, haga clic en Detener adquisición. En este experimento, se utilizaron los siguientes ajustes de voltaje: FSC - 200 V, SSC - 423 V.
6. Para establecer el voltaje FITC, ejecute el "control positivo (celdas tratadas con un inductor ROS, A o B)". Ajuste el voltaje para que todos los eventos aparezcan en un histograma de FITC. En este caso, use un voltaje de 280 V. En la ventana Panel de adquisición, haga clic en Detener adquisición.
7. Coloque de nuevo el tubo de "control de autofluorescencia" en el brazo del aspirador. En la ventana Panel de adquisición, haga clic en Adquirir datos y, a continuación, en Registrar datos y seleccione las condiciones de detención deseadas (por ejemplo, 50.000 eventos). Dibuje una puerta alrededor de las celdas de interés, excluyendo las células muertas y los escombros.
   NOTA: Estos se observan como eventos mucho más pequeños que la población celular principal y aparecen en la parte inferior izquierda de la gráfica.
8. Cuando finalice la adquisición, retire el tubo del brazo aspirador. El equipo se lavará solo. En la ventana Panel de adquisición, haga clic en Siguiente tubo y ejecute el control Basal (celdas no estimuladas). Haga clic en Adquirir datos y, a continuación, en Registrar datos.
   1. Desde la puerta inicial (puerta que excluye las celdas muertas y los escombros), cree otro diagrama de puntos de FITC (en el eje x) frente a APC (en el eje y). Dibuje una puerta de cuadrante y ajuste las coordenadas para visualizar los eventos en el cuadrante inferior izquierdo de la gráfica FITC versus APC.
9. Para grabar las siguientes muestras, extraiga el tubo y haga clic en Siguiente tubo > Adquirir datos > Registrar datos.
   NOTA: El citómetro de flujo utilizado aquí (ver Tabla de Materiales) registra un máximo de 1 x 10⁶ eventos por tubo.
10. Cuando finalice la grabación de todos los tubos, exporte los datos al disco D. Para ello, haga clic en Archivo > Exportar > archivos FCS > versión Select 3.0 o 3.1.
    NOTA: Aunque la adquisición de datos utilizando un software (consulte la Tabla de materiales) se describe en detalle en este protocolo, se puede utilizar cualquier otro software de citometría de flujo. Los parámetros de adquisición (FSC, SSC y FITC) se pueden establecer de la misma manera para obtener los resultados.

6. Análisis de los datos adquiridos

1. Abra el software y agregue las muestras mediante el botón de acción Agregar muestras ; se encuentra en la barra de tareas o en la banda Navegar.
   1. Haga clic en Agregar muestras.
   2. Con el explorador de archivos, vaya a la carpeta Experimental.
   3. Seleccione la carpeta Experimental y haga clic en Elegir.
      NOTA: Los archivos de ejemplo se cargan como parte del grupo "Todos los ejemplos" en el área de trabajo.
2. Haga doble clic en el primer ejemplo del área de trabajo: Control de autofluorescencia.
   NOTA: Esta acción abre una ventana Gráfico que traza eventos a lo largo de los parámetros de dispersión hacia adelante (FSC-A en el eje X) frente a dispersión lateral (SSC-A en el eje y).
3. Dibuje una puerta poligonal para aislar las células de interés, excluyendo las células muertas y los escombros.
   1. Haga clic en la herramienta Puerta de polígono .
   2. Haga clic dentro de la gráfica para formar la puerta del polígono. Haga tantos lados como sea necesario.
   3. Haga doble clic en el último punto para cerrar el polígono y crear la puerta deseada.
   4. Proporcione un nombre para la puerta, como "celdas MIO-M1", y presione OK.
      NOTA: Aparece una nueva ventana de gráfico que muestra solo los eventos MIO-M1 sin celdas muertas ni escombros.
   5. Repetir con todas las muestras a analizar.
4. Cambie la trama a un histograma. Para ello, haga clic en la etiqueta de parámetro del eje X y seleccione FITC-A. Haga clic en la etiqueta del parámetro del eje Y y seleccione Histograma. Esto cambia la gráfica a un histograma unidimensional.
5. Agregue estadísticas mediante la ventana Agregar estadísticas.
   1. Debajo del gráfico de histograma, haga clic en Agregar estadísticas. El programa abrirá una nueva ventana de estadísticas.
   2. A la izquierda de la nueva ventana seleccione las estadísticas Media geométrica.
   3. Seleccione las celdas MIO-M 1 de población.
   4. En la lista de parámetros disponibles, seleccione FIT-C.
   5. Haga clic en el botón Agregar para aplicarlos al análisis.
      NOTA: Esto crea las nuevas estadísticas "media geométrica: FITC" en el árbol de cierre de muestra, y sus valores se muestran en el espacio de trabajo.
6. Ponga estos valores medios geométricos en un programa de estadística y analice.
7. Haga clic en el icono L para abrir el Editor de diseño; este icono se encuentra en la pestaña Menú del espacio de trabajo. Coloque la ventana Espacio de trabajo y el Editor de diseño uno al lado del otro.
   NOTA: El Editor de diseño es una ventana de espacio de trabajo separada con herramientas para mostrar múltiples gráficos gráficos y estadísticas en un informe gráfico simple. Este se puede exportar con el archivo de extensión que prefieras, como PDF o JPG, entre otros.
   1. Desde el árbol de cierre de una muestra en la ventana Área de trabajo, arrastre la población de celdas MIO-M 1 al Editor de diseño.
   2. Asegúrese de que en el Editor de diseño se muestre un gráfico de histograma que contenga los eventos de la puerta. La información básica adicional se detallará en un cuadro de texto a continuación.
   3. Arrastre todas las muestras para compararlas en el mismo gráfico. El programa los superpondrá.
   4. Haga clic con el botón derecho en el gráfico del histograma y seleccione Propiedades. El programa abrirá una nueva ventana de definición de gráficos. Esta ventana tiene cuatro pestañas (Anotar, Fuentes, Leyenda y Especificar). Haga clic en la ficha Especificar y cambie el eje Y de Automático a Modal. Haga clic en Aplicar.
   5. Haga clic con el botón derecho en la muestra y cambie Coloración, Estilo de línea, Grosor de línea, etc. para personalizar el gráfico.
   6. Para exportar la imagen, haga clic en la pestaña Archivo e, inmediatamente después, seleccione Guardar imagen en la banda Documento. Elija el tipo preferido de archivo de imagen (por ejemplo, PDF).
      NOTA: Se abre un cuadro de diálogo guardar que le pedirá que seleccione una ubicación de guardado. Haga clic en Guardar.
8. Guarde el análisis como un archivo de área de trabajo (.wsp).
   1. En la esquina superior izquierda, haga clic en el icono Análisis de citometría y seleccione Guardar como.
   2. Elija Guardar como espacio de trabajo (WSP) para guardar el documento con datos y análisis.
   3. Escriba un nombre para el archivo de área de trabajo.
   4. Haga clic en Guardar.

Resultados

Como se describe en la sección de protocolo, hemos mostrado datos representativos y cuantitativos que demuestran la detección de citometría de flujo de la producción de ROS con la sonda de fluorescencia DCFH-DA de células MIO-M1 estimuladas con inductor de ROS, A o B. Como era de esperar, observamos cambios en la fluorescencia FITC en células no estimuladas por encima de los niveles de autofluorescencia (Figura 1A, comparar "control basal" vs. "control de autofluorescencia", gráfico d...

Discusión

Varias afecciones patológicas, como el cáncer, las enfermedades inflamatorias, la isquemia/reperfusión, la cardiopatía isquémica, la diabetes y las retinopatías, y también situaciones fisiológicas como el envejecimiento, conducen a la sobreproducción de ROS 6,7,8,9,10,11. Por lo tanto, la detección, medición y comp...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
2′,7′-DCFH-DA	Sigma	35845-1G
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)	Gibco by life technologies	15630-080
BD FACSCanto II flow cytometer	BD Biosciences	FACSCanto
BD FACSDiva software	BD Biosciences
Cell Culture Dishes 100x20 mm	Cell Star- Greiner Bio-One	664 160
Centrifuge	Thermo	Sorvall legend micro 17 R
Centrifuge Tubes (15 ml)	BIOFIL	CFT011150
Centrifuge Tubes (50 ml)	BIOFIL	CFT011500
Cryovial	CRYO.S - Greiner Bio-One	126263
Dimethyl Sulfoxide	Sigma-Aldrich	W387520-1KG
Disodium-hydrogen-phosphate heptahydrate	Merck	106575
DMEM without phenol red	Gibco by life technologies	31053-028
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)	Gibco by life technologies	11995065
Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA), Disodium Salt, Dihydrate	Merck	324503
Fetal Bovine Serum	Internegocios
FlowJo v10 Software	BD Biosciences
Glucose	Merck	108337
hemocytometer, Neubauer chamber	BOECO,Germany
Laminar flow hood	ESCO	AC2-6E8
L-glutamine (GlutaMAX)	Gibco by life technologies	A12860-01
MitoSOX Red	Invitrogen	M36008
Penicillin/Streptomycin	Gibco by life technologies	15140-122
Potassium Chloride	Merck	104936
Potassium-dihydrogen phosphate	Merck	4878
Round polystyrene tubes 5 ml (flow cytometry tubes)	Falcon - Corning	BD-352008
Sodium Azide	Merck	822335
Sodium Chloride	Merck	106404
Sodium Hydroxide	Merck	106462
SPINWIN Micro Centrifuge Tube 1.5 ml	Tarson	500010-N
Tissue Culture Plate 6 well	BIOFIL	TCP011006
Trypan Blue	Merck	111732
Trypsin-EDTA 0.5% 10X	Gibco by life technologies	15400-054
Vortex Mixer	Labnet International, Inc.