Generación y expansión de líneas tumorales de mesotelioma pleural maligno primario

Resumen

El objetivo de este documento de método es demostrar una metodología robusta y reproducible para el enriquecimiento, generación y expansión de líneas celulares tumorales primarias a partir de mesotelioma pleural resecado quirúrgicamente.

Resumen

Faltan metodologías actuales para la expansión de líneas celulares tumorales primarias a partir de tipos de tumores raros. Este protocolo describe métodos para expandir las células tumorales primarias del mesotelioma pleural maligno (MPM) resecado quirúrgicamente al proporcionar una visión general completa del proceso desde la digestión hasta el enriquecimiento, la expansión, la criopreservación y la caracterización fenotípica. Además, este protocolo introduce conceptos para la generación de tumores que pueden ser útiles para múltiples tipos de tumores, como la tripsinización diferencial y el impacto de los métodos de disociación en la detección de marcadores de superficie celular para la caracterización fenotípica. La principal limitación de este estudio es la selección de células tumorales que se expandirán en un sistema de cultivo bidimensional (2D). Las variaciones de este protocolo, incluidos los sistemas de cultivo tridimensionales (3D), los suplementos de medios, el recubrimiento de placas para mejorar la adhesión y los métodos alternativos de desagregación, podrían mejorar esta técnica y la tasa de éxito general de establecer una línea tumoral. En general, este protocolo proporciona un método básico para establecer y caracterizar las células tumorales de este tumor raro.

Introducción

El mesotelioma pleural maligno (MPM) es un tumor poco frecuente altamente asociado con la exposición al asbesto. Aunque los enfoques basados en la inmunoterapia han mostrado resultados alentadores, hay una escasez de opciones de tratamiento disponibles para los pacientes que desarrollan esta enfermedad, y la tasa general de supervivencia a 5 años es baja ^1,2. Se están realizando esfuerzos en múltiples instituciones para comprender mejor esta enfermedad e identificar nuevos objetivos terapéuticos que puedan mejorar los resultados de los pacientes. Si bien existen múltiples modelos de ratón con mesotelioma, el acceso a las células tumorales primarias del mesotelioma es más limitado³. La expansión in vitro de las células tumorales del mesotelioma primario proporcionaría un valioso sistema modelo que se puede utilizar para estudiar las células tumorales directamente y su interacción con las células inmunes autólogas, como los linfocitos infiltrantes de tumores. Si bien ha habido informes sobre la expansión de las líneas de células tumorales de mesotelioma primario, estas son pocas y no proporcionan un procedimiento de operación estándar (SOP) detallado. Además, pocas líneas celulares están disponibles en fuentes comerciales como American Type Culture Collection (ATCC). Si bien la disponibilidad de líneas tumorales primarias es limitada, se ha demostrado que las células tumorales pueden expandirse a partir de derrames pleurales y directamente desde el tejido tumoral ^4,5. Además, se ha demostrado que las líneas celulares tumorales expandidas preservan el perfil molecular del tumor original ^4,5,6.

Nuestro laboratorio está estudiando el microambiente inmune al tumor de MPM y ha desarrollado un método para expandir las líneas de células tumorales primarias de MPM a partir de casos resecados quirúrgicamente. Este método se adapta de nuestra experiencia en el establecimiento de líneas celulares tumorales de melanoma metastásico primario. El objetivo de este trabajo es proporcionar un enfoque detallado y práctico para la expansión de la línea tumoral de mesotelioma primario utilizando un sistema modelo 2D y el posterior perfil fenotípico. Dado el éxito reciente de las estrategias de bloqueo de puntos de control dirigidas a CTLA4 y PD-1 en el entorno de primera línea², la capacidad de generar muchas líneas tumorales primarias podría promover la comprensión de ambos mecanismos intrínsecos de resistencia tumoral, así como proporcionar un sistema modelo importante para evaluar el reconocimiento de células T, profundizando así nuestra comprensión de la respuesta inmune en MPM.

La principal limitación de este protocolo es que cada tumor contiene un microambiente diferente, y hay un alto grado de variabilidad del éxito de la expansión. Además, este método selecciona células tumorales que pueden expandirse en un sistema de cultivo 2D. Otros métodos que implican la producción de un esferoide 3D o un cultivo de organoides podrían proporcionar un enfoque alternativo que puede permitir una mayor tasa de éxito de expansión o dar como resultado la capacidad de derivar líneas celulares que no pueden expandirse en un sistema 2D tradicional. Se ha demostrado que estos cultivos 3D son útiles para la generación de tipos de tumores que son difíciles de expandir, por ejemplo, el cáncer de páncreas⁷.

Protocolo

Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por la Junta de Revisión de Instituciones (IRB) del MD Anderson Cancer Center de la Universidad de Texas. Esto se refiere a los tumores MPM resecados quirúrgicamente de atención estándar que se extirpan después del consentimiento informado.

1. Preparación de medios de digestión tumoral y otros medios asociados

1. Para preparar los medios de digestión tumoral, agregue 5 ml de pen/estreptococo al 100% (penicilina/estreptomicina) a 500 ml de medio estéril Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 en una campana de flujo laminar.
   1. Transfiera el medio a un filtro estéril de polietersulfona (PES) de 500 ml y 0,22 μm para la filtración al vacío.
      NOTA: Los pasos de filtración y aspiración deben realizarse con una presión de vacío estándar de 75-150 torr.
   2. Etiquete y ponga fecha al medio de digestión del tumor y guárdelo a 4 °C.
      NOTA: El medio se puede almacenar durante 1 mes a 4 °C.
2. Para preparar el cóctel enzimático de digestión tumoral, agregue 2.5 mL de colagenasa al 3% tipo 1, 1 mL de 1.5 mg / ml hialuronidasa, 20 μL de 250,000 unidades / ml DNAse 1 a 16.5 ml de medio de digestión en un tubo cónico de 50 ml en una campana de flujo laminar.
   NOTA: El volumen total del cóctel enzimático de digestión tumoral es de 20 ml; sin embargo, solo se necesitan 10 ml por muestra de tumor. Como tal, el cóctel restante se puede almacenar a -20 ° C hasta que sea necesario. No vuelva a congelar las alícuotas.
3. Para preparar el medio tumoral completo, agregue 5 ml de 100% Pen/Strep y 50 ml de suero fetal bovino (FBS) a 500 ml de RPMI 1640 estéril en una campana de flujo laminar.
   1. Transfiera el medio a un filtro estéril PES de 500 ml y 0,22 μm para la filtración al vacío.
   2. Etiquete y ponga fecha al medio tumoral completo y guárdelo a 4 °C.
      NOTA: El medio se puede almacenar durante 1 mes a 4 °C.
4. Para preparar el medio sérico reducido para la inanición, agregue 5 ml de pluma / estreptococo al 100% y 5 ml de FBS a 500 ml de RPMI 1640 estéril en una campana de flujo laminar.
   1. Transfiera el medio a un filtro estéril PES de 500 ml y 0,22 μm para la filtración al vacío.
   2. Etiquete y ponga fecha al medio sérico reducido y guárdelo a 4 °C.
      NOTA: El medio se puede almacenar durante 1 mes a 4 °C.
5. Para preparar el medio de congelación, agregue 5 ml de dimetilsulfóxido (DMSO) a 45 ml de FBS en una campana de flujo laminar.
   1. Transfiera el medio a un filtro estéril PES de 50 ml y 0,22 μm para filtración al vacío.
   2. Etiquetar y fechar cinco tubos cónicos de 15 ml.
   3. Transfiera 10 ml de medio de congelación a cada tubo y guarde los tubos a -20 °C.
6. Para preparar un medio libre de antibióticos para las pruebas de micoplasma, agregue 50 ml de FBS a 500 ml de RPMI 1640 estéril en una campana de flujo laminar.
   1. Transfiera el medio a un filtro estéril PES de 50 ml y 0,22 μm para filtración al vacío.
   2. Etiquete y ponga fecha al medio libre de antibióticos y guárdelo a 4 °C.
      NOTA: El medio se puede almacenar durante 1 mes a 4 °C.
7. Para preparar el tampón de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) para el análisis fenotípico, agregue 16,6 ml de albúmina sérica bovina estéril a 500 ml de solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) en una campana de flujo laminar.
   1. Etiquete y ponga fecha al tampón FACS y guárdelo a 4 °C.
      NOTA: El tampón FACS no requiere esterilización por filtro siempre que ambos componentes se almacenen estériles. El búfer FACS se puede almacenar antes de abrirse durante 6 meses a 4 °C.

2. Digestión del tejido tumoral

1. Transfiera 10 ml de cóctel enzimático de digestión tumoral del paso 1.2 a un tubo de disociación.
2. Transfiera el trozo de tejido tumoral a una tapa estéril de la placa de 6 pocillos con un bisturí estéril.
   NOTA: La cantidad de medio que se transfiere con el tejido tumoral es suficiente para el procesamiento.
   1. Retire todo el tejido graso, tejido necrótico y / o coágulos de sangre con un nuevo bisturí estéril y fórceps.
      NOTA: El tejido graso es normalmente de aspecto amarillento y semisólido. El tejido necrótico es más oscuro que el tejido circundante en apariencia y muy suave; tanto el tejido graso como el necrótico se romperán fácilmente. El tejido sanguinolento aparece de color rojo brillante y puede liberar sangre en el medio cuando se manipula. Una vez extirpado, el tejido tumoral resultante debe mantener su forma y ser pálido o rosado, dependiendo del tipo de tejido.
   2. Cortar todo el tejido tumoral en 1 mm³ fragmentos pequeños. Para asegurarse de que el tejido no se seque, agregue 500 μL de solución de sal equilibrada de Hank (HBSS) estéril 1x al tejido tumoral.
3. Transferir fragmentos tumorales al tubo de disociación que contiene 10 ml de cóctel enzimático de digestión tumoral (paso 2.1). Cierre el tubo herméticamente, colóquelo con el lado de la tapa hacia abajo sobre el disociador de tejido y agregue el aparato calentador aplicándolo como una manga sobre el tubo de disociación y presionando para que lo haga clic en su lugar.
   NOTA: La capacidad máxima para cada tubo es de 4 g de tumor y 10 ml de volumen.
4. Seleccione la configuración preprogramada en el 37C_h_TDK_1 disociador. Verifique el estado después de 10 minutos para asegurarse de que no haya ningún error de obstrucción como lo indica la luz roja parpadeante.
   NOTA: Este programa procesa a 1.865 rpm durante 1 h con la temperatura encendida a 37 °C.
   NOTA: Si se produce una obstrucción, retire el tubo de disociación y agítelo manualmente para desalojar cualquier tejido atrapado en la tapa; luego reemplace el tubo en el disociador y reanude el programa.
5. Después de la digestión de 1 h, retire el tubo de disociación y colóquelo en una campana de flujo laminar. Filtre el tumor digerido colocando un colador de células de 70 μm encima de un tubo cónico de 50 ml y canalizando el tumor digerido con una pipeta de 10 ml en el filtro. Si el filtro se obstruye, cambie a un filtro nuevo.
   1. Enjuague el tubo de disociación con 10 ml de medios frescos de digestión tumoral y pase el lavado a través del filtro.
   2. Retire el filtro de 70 μm y deséchelo.
   3. Llevar el volumen total a 40 ml con el medio de digestión tumoral.
6. Centrifugar a 500 × g durante 5 min a temperatura ambiente.
7. Usando una pipeta aspiradora de 2 ml unida a una fuente de vacío, aspire el sobrenadante sin alterar el gránulo y resuspenda las células utilizando 10 ml de medio tumoral completo estéril.
8. Repita el paso 2.6.
9. Aspire el sobrenadante como se describe en el paso 2.7. Resuspend las células en 3 ml de medio tumoral completo estéril y transfiera la suspensión celular a un pocillo de una placa estéril de 6 pocillos.
10. Mantenga la placa en una incubadora a 37 °C con un 5% de CO₂.
11. Después de 24 h, transfiera el medio utilizado del tumor digerido en el pozo 1 a un nuevo pozo (pozo 2) en la misma placa de 6 pocillos. Añadir 3 ml de medio tumoral completo estéril al pozo 1.
12. Transfiera el medio usado de los pozos 1 y 2 y combínelo en el pozo 3 en la misma placa de 6 pocillos 24 h después del paso 2.11. Agregue 3 ml de medio tumoral completo estéril en los pozos 1 y 2.
13. Aspire el medio de los 3 pocillos y pipetee 3 ml de medio tumoral completo en cada pozo 48 h después del paso 2.12.

3. Generación de línea celular tumoral primaria

1. Utilizando un microscopio de fase invertida, determine el porcentaje de contaminación por fibroblastos en el cultivo de paso temprano.
   NOTA: Los fibroblastos son generalmente largos e irregulares y tienen una membrana celular mal definida. Aparecen delgados o planos en una escala Z.
   1. Si la contaminación por fibroblastos es superior al 20% de las células en el cultivo de paso temprano, continúe el cultivo después de reemplazar el medio completo con medio sérico reducido.
   2. Repita el reemplazo con medio sérico reducido en el paso 3.1.1 dos veces por semana durante 3-4 semanas.
   3. Cuando el cultivo alcanza el 80% de confluencia, pase las células dividiéndose 50:50 en 2 nuevos pocillos de una placa de 6 pocillos. Continúe con el pasaje 50:50 en medios séricos reducidos una vez que las células alcancen el 80% de confluencia.
   4. Repita el paso 3.1.3 durante un máximo de 4 semanas, pasando en matraces de cultivo más grandes según sea necesario dividiendo 50:50 una vez que el cultivo alcance el 80% de confluencia. Si la población de fibroblastos no se reduce al 10% o menos, continúe con el paso 3.2 para intentar el método de tripsinización diferencial para eliminar la contaminación por fibroblastos. De lo contrario, continúe con el paso 3.3.
2. Para enriquecer las células tumorales, enjuague suavemente el pozo con 1x PBS para eliminar el medio que contiene suero.
   1. Agregue tripsina de la siguiente manera: 1 ml por pozo si está en una placa de 6 pocillos, 2 ml para un matraz T25, 3 ml para un matraz T75.
   2. Coloque la placa o matraz de 6 pocillos en una incubadora a 37 °C durante 1 min. Retire la placa o el matraz de la incubadora y compruebe la adhesión de las células con un microscopio invertido. Si las células están parcialmente levantadas o flotando, retire suavemente las células suspendidas y la tripsina solamente. Coloque las células en un tubo cónico de 15 ml que contenga un volumen igual o mayor de medio tumoral completo.
      NOTA: Esta colección parcial de células basada en propiedades de adhesión es la primera de múltiples fracciones.
   3. Repita los pasos 3.2.1 y 3.2.2 hasta que se levanten todas las celdas o se eliminen 4 fracciones.
   4. Centrifugar todas las fracciones independientes a 500 × g durante 5 min a temperatura ambiente.
   5. Aspire el sobrenadante como se describe en el paso 2.7 y resuspenda las células utilizando 5 ml de medio sérico estéril y reducido.
   6. Coloque las células en un matraz T25 para cada fracción y coloque los matraces en una incubadora a 37 °C.
   7. Evaluar el cultivo después de 48 h para determinar qué fracción está enriquecida para las células tumorales frente a los fibroblastos. Deseche los matraces ricos en fibroblastos. Si la contaminación por fibroblastos es <10%, continúe la expansión en el medio tumoral completo y proceda al paso 4. Si la contaminación por fibroblastos es del 10-30%, repita los pasos 3.1.2-3.1.4. Si la contaminación por fibroblastos es superior al 30%, repita los pasos 3.2-3.2.7.
3. Si se detectan pocos o ningún fibroblasto dentro del cultivo de paso temprano, continúe pasando las células en medio tumoral completo dividiendo 50:50 una vez que las células estén 80% confluentes en su placa o matraz de 6 pocillos.

4. Expansión de la línea celular tumoral primaria de paso temprano

1. Una vez que el cultivo del tumor primario contenga un 10% o menos de contaminación por fibroblastos, aspire el medio y reemplácelo con un medio tumoral completo estéril dos veces por semana.
   NOTA: El volumen medio óptimo para un T25 es de 5 ml; T75 es de 12 ml; T150 es de 25 ml.
   1. Pasar el cultivo 50:50 a matraces más grandes según sea necesario una vez que alcance el 80% de confluencia en la placa o matraz.
      NOTA: Es posible que el cultivo deba pasarse en una proporción más alta dependiendo de su crecimiento. Ajuste para que el cultivo alcance el 80% de confluencia cada 3-5 días.
2. Pasaje hasta que la cultura esté en el pasaje 4 o superior. Una vez que el cultivo esté confluente al 80% en un mínimo de dos matraces T75, continúe con el paso 5.

5. Caracterización y almacenamiento de la línea celular tumoral primaria establecida

1. Criopreservar un matraz T75 como congelación de paso temprano. Para las pruebas de micoplasma de los matraces T75 restantes, continúe con el paso 5.2.
   1. Para la criopreservación de células de paso temprano, descongelar 1 tubo de medio de congelación alicitado preparado en la etapa 1.5.
   2. Recolecte las células por tripsinización lavando primero la placa con 1x PBS como se describe en el paso 3.2 y agregando tripsina como se describe en el paso 3.2.1.
   3. Coloque el matraz en una incubadora a 37 °C durante 3 min. Retire el matraz de la incubadora y compruebe la adhesión de las células con un microscopio invertido. Si las células están levantando o flotando, retire suavemente las células suspendidas y la tripsina. Coloque las células en un tubo cónico de 15 ml que contenga un volumen igual o mayor de medio tumoral completo.
      NOTA: Si las células permanecen adheridas después de 3 minutos, vuelva a colocar el matraz en la incubadora durante 2 minutos adicionales.
   4. Mezcle bien el tubo pipeteando suavemente y retire 20 μL para contar.
   5. Centrifugar el tubo a 500 × g durante 5 min a temperatura ambiente.
   6. Mientras las células están girando, cuente utilizando un protocolo de conteo específico del laboratorio, como el azul de tripano o el yoduro de acridina naranja / propidio (AO / PI).
   7. Resuspender las células después de la centrifugación en medio de congelación con un mínimo de 2 × 10⁶ celdas/medio de congelación de 1 ml.
   8. Transfiera 1 ml de la suspensión celular del paso 5.1.7 a crioviales preetiquetados de 1,5 ml.
   9. Coloque los crioviales en una cámara de congelación de velocidad controlada y transfiéralos inmediatamente a -80 °C.
   10. Almacene las células a -80 °C durante un máximo de 1 semana antes de transferirlas a nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo.
2. Divida un matraz T75 50:50 para la prueba de micoplasma. Cambie el medio por un medio libre de antibióticos preparado en el paso 1.6.
   1. Después de 72 h, descongele el reactivo de detección de micoplasma, el sustrato y los controles a temperatura ambiente durante 15 minutos antes de la prueba.
   2. Recoger 1 mL del sobrenadante de cada cultivo a probar y colocarlo en un tubo cónico de 15 mL.
   3. Granular cualquier célula suspendida centrifugando el sobrenadante a 500 × g durante 5 min a temperatura ambiente.
   4. Cargue 100 μL de sobrenadantes de muestra y controles en una placa blanca de 96 pocillos. Añadir 100 μL de reactivo de detección de micoplasma a cada muestra y control.
   5. Incubar durante 5 min a temperatura ambiente.
   6. Coloque la placa en un lector de placas y lea la luminiscencia (Lectura A, es decir, primera lectura).
      NOTA: El protocolo del fabricante del kit de micoplasma indica mantener la configuración predeterminada en los lectores de placas multifuncionales. La lectura se establece en el punto final de luminiscencia con un tiempo de integración de 1 s y una ganancia de 135. El lector de placas utiliza una rutina de escala automática para optimizar la señal de ganancia para cada experimento. El tiempo de integración de 1 s es el predeterminado estándar. Ambos ajustes se utilizan para ajustar la intensidad de la señal luminiscente interpretada por el lector de placas y es posible que deban ajustarse en función del lector de placas individual.
   7. Retire la placa del lector de placas y agregue 100 μL del sustrato de detección de micoplasma a cada muestra y a los controles.
   8. Incubar durante 10 min a temperatura ambiente.
   9. Coloque la placa en el lector de placas y lea la luminiscencia (Lectura B, es decir, segunda lectura).
   10. Para determinar la positividad del micoplasma, determine la proporción de lectura B a lectura A.
       NOTA: Las proporciones de positividad de Mycoplasma se describen en el protocolo del fabricante del kit de micoplasma. Las lecturas A y B se adquieren con los mismos ajustes y simplemente reflejan el orden de lectura.
       1. Considere una proporción < 1 para ser micoplasma negativo.
       2. Considere que una proporción de 1-1.2 no es concluyente y repita el paso 5.2.
       3. Considere una proporción > 1.2 para ser positivo para micoplasma y monitoree este cultivo; terminar la cultura si es necesario.
3. Caracterización por citometría de flujo de células tumorales micoplasmáticas negativas
   1. Desalojar las células tumorales utilizando un tampón de disociación celular.
   2. Cuente las celdas y vuelva a suspender las celdas a 1 × 10⁶/ml en el búfer FACS del paso 1.7.
   3. Retire 100 μL de suspensión celular en tubos individuales para la tinción de la superficie.
   4. Centrifugar a 500 × g durante 5 min a temperatura ambiente.
   5. Aspirar el sobrenadante y bloquear los receptores Fc incubando las células en 500 μL de suero de cabra al 5% en tampón FACS a temperatura ambiente durante 10 min.
   6. Añadir 2 ml de tampón FACS y centrifugar la suspensión a 500 × g durante 5 min a temperatura ambiente.
   7. Aspire el sobrenadante y agregue la mezcla de anticuerpos de la mancha superficial (Tabla 1) y el tampón FACS para que el volumen final sea de 100 μL. Cubra las muestras y las manche en hielo durante 30 min.
   8. Repita el paso 5.3.6.
   9. Aspirar el sobrenadante y fijar las células resuspiendo en 200 μL de paraformaldehído al 1% (PFA) más 0,25% etOH. Incubar a temperatura ambiente durante 20 min con las muestras protegidas de la luz.
   10. Repita el paso 5.3.6. Resuspend las células en 200 μL de tampón FACS para su adquisición utilizando un citómetro de flujo apropiado.
       NOTA: Se espera que las células tumorales de mesotelioma sean positivas para mesotelina y N-cadherina. Algunos también pueden expresar CD90.
4. Expandirse en medio tumoral completo y banco como se describe en los pasos 4.1 y 5.1, respectivamente.

Resultados

Para determinar la contaminación por fibroblastos de cultivos de paso temprano, las células se evalúan utilizando un microscopio de fase invertida para identificar la frecuencia de fibroblastos en relación con las otras células adherentes presentes. La Figura 1 muestra ejemplos de aumento de la contaminación por fibroblastos del 80% (Figura 1A), 50% (Figura 1B) y 30% (Figura 1C), en comparación c...

Discusión

Si bien este protocolo es sencillo, hay algunos pasos críticos que deben seguirse de cerca. La congelación temprana del paso es importante para preservar la capacidad de repetir el proceso de enriquecimiento de células tumorales si inicialmente no tiene éxito. La capacidad de evaluar la contaminación fibroblástica a ojo para decidir la correcta técnica de división e inanición media es vital para prevenir el crecimiento excesivo de fibroblastos en el cultivo. Además, el método de tripsinización diferencial req...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL serological pipettes	BD Falcon	357551
15 mL conical tubes	BD Falcon	352097
2 mL aspirating pipettes	BD Falcon	357558
5 mL serological pipettes	BD Falcon	357543
50 mL conical tubes	BD Falcon	352098
6-well microplates, tissue culture treated	Corning	3516
Accutase	Innovative Cell Technologies	AT104	A protease-collagenase mixture considered to be more effective in preserving epitopes for flow cytometry.
anti-CD325 (N-Cadherin) PE	Invitrogen	12-3259-42
anti-CD90 PE-Cy7	BD Biosciences	561558
anti-Mesothelin APC	Miltenyi	130-118-096
Bovine Serum Albumin 30%	Sigma	A8577-1L
Cell Dissociation buffer, enzyme-free	Thermo Fisher Scientific	13151014
Cell strainer (70 µm)	Greiner Bio-One	542-070
Centrifuge with 15 mL and 50 mL adaptors
Collagenase Type 1	Sigma-Aldrich	C-0130	Dissolve 1.5 g of Collagenase type I into 100 mL of sterile DMEM and aliquot in 5 mL volumes. Label well and store at -20 °C.
Controlled-rate freezing chamber	Thermo Fisher Scientific	15-350-50
Cryovials	Thermo Fisher Scientific	5000-0020
CulturPlate-96	Packard Instrument Company	6005680	White, opaque 96-well microplate.
Dimethyl sulfoxide	Thermo Fisher Scientific	BP231-100
DNAse I (from bovine pancreas)	Sigma-Aldrich	D4527	Aliquot at 50 μL, label well and store at -20 °C. After thawing, keep at 4 °C for up to 1 month.
Dulbecco's Phosphate buffered saline solution 1x	Corning	21-031-CV
Ethanol 200 proof	Thermo Fisher Scientific	A4094
FACS tubes-filter top	BD Falcon	352235
Fetal bovine serum	Gemini-Bio	100-106
GentleMACS C-tubes	Miltenyi	130-093-237
GentleMACS Octo-dissociator with heater apparatus	Miltenyi	130-096-427	Includes specialized heater apparatus sleeves used to apply heat to the C-tubes during dissocation.
Goat serum	Sigma-Aldrich	G9023	Aliquot and store at -20 °C.
Hank's Balanced Salt solution, 500 mL	Corning	MT21022CV
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	H3506	Dissolve 0.15 g of Hyaluronidase into 100 mlLof sterile DMEM and distribute into 1.0 mL aliquots. Label well and store at -20 °C.
Inverted-phase microscope
Laminar flow hood
Live/dead yellow dye	Life Technologies	L-34968
Micropipettor tips, 20 µL	ART	2149P
Micropipettor, 0.5-20 µL
Mycoalert assay control set	Lonza	LT07-518	Aliquot positive controls and store at -20 °C.
Mycoalert Plus mycoplasma detection kit	Lonza	LT07-710	Aliquot reagent and substrate and store at -20 °C. Save remaining buffer and aliquot for negative control and store at -20°C.
Paraformaldehyde 16%	Electron Microscopy Sciences	15710	Prepare stock by filtering through a PVDF syringe filter (Millex cat. no. SLVV033RS) and aliquot under a fume hood. Store at -20 °C.
Penicillin-streptomycin 10,000 U/mL	Gibco	15140-122
Pipet aid
Plate reader with luminescent capabilities	BioTek	Synergy HT	any plate reader with these specifications can be used
RPMI 1640 media	Corning	10-040-CV
Scalpel	Andwin	2975#21
Stericup Quick Release-GP sterile vacuum filtration system, 0.22 µm PES Express PLUS, 500 mL	EMD Millipore	S2GPU05RE
Steriflip-GP filter, 0.22 µm PES Express PLUS, 50 mL	EMD Millipore	SCGP00525
Sterile forceps	Thermo Fisher Scientific	12-000-157
T25 flasks, tissue culture treated	Corning	430639
T75 flasks, tissue culture treated	Corning	430641U
Trypan blue solution 0.4%	Gibco	15250-061
Trypsin EDTA 0.05%	Corning	25-052-CI
ViaStain acridine orange/propidium iodide (AO/PI) solution	Nexcelom	CS2-0106-5ML