Método de doble tinción para detectar la pectina en la interacción planta-hongo

Resumen

Este protocolo describe un método microscópico para detectar la pectina en la interacción café-hongo.

Resumen

Las células vegetales utilizan diferentes mecanismos estructurales, ya sean constitutivos o inducibles, para defenderse de la infección por hongos. La encapsulación es un mecanismo inducible eficiente para aislar los haustorios fúngicos del protoplasto de células vegetales. Por el contrario, la pectina, uno de los componentes poliméricos de la pared celular, es un objetivo de varias enzimas pectolíticas en interacciones necrotróficas. Aquí, se presenta un protocolo para detectar pectina e hifas fúngicas a través de microscopía óptica. Se investiga la encapsulación rica en pectina en las células de las hojas de café infectadas por el hongo de la roya Hemileia vastatrix y la modificación de la pared celular mesófila inducida por Cercospora coffeicola . Las muestras de hojas lesionadas se fijaron con la solución de Karnovsky, se deshidrataron y se incrustaron en metacrilato de glicol durante 2-4 días. Todos los pasos fueron seguidos por el bombeo de vacío para eliminar el aire en los espacios intercelulares y mejorar el proceso de incrustación. Los bloques incrustados se seccionaron en secciones de 5-7 μm de espesor, que se depositaron en un portaobjetos de vidrio cubierto con agua y posteriormente se calentaron a 40 ° C durante 30 min. A continuación, los portaobjetos se tiñeron dos veces con 5% de azul algodón en lactofenol para detectar el hongo y 0,05% de rojo rutenio en agua para detectar pectina (grupos ácidos de ácidos poliurónicos de pectina). Se encontró que los haustorios fúngicos de Hemileia vastatrix estaban encapsulados por pectina. En la cercosporiosis del café, las células mesófilas exhibieron disolución de las paredes celulares, y se observaron hifas y conidióforos intercelulares. El método presentado aquí es efectivo para detectar una respuesta asociada a la pectina en la interacción planta-hongo.

Introducción

Los mecanismos de defensa de la pared celular en las plantas son cruciales para contener la infección por hongos. Los estudios han reportado cambios en el grosor y la composición de la pared celular desde el^{siglo 19 1,2}. Estos cambios pueden ser inducidos por un patógeno fúngico que estimula la formación de una papila, que impide que los hongos entren en la célula o podría usarse para encapsular las hifas para aislar el protoplasto de la célula huésped de la haustoria fúngica. La producción de una barrera dinámica de la pared celular (es decir, papilas y un haustorio completamente encerrado) es importante para promover la resistencia de la planta³. Los estudios histopatológicos sobre enfermedades relacionadas con hongos han investigado la aparición de estos mecanismos y han descrito los polímeros de la pared celular, la celulosa, la hemicelulosa (arabinoxilanos) y la callosa como mecanismos de resistencia al ataque fúngico 4,5,6,7.

La pared celular es la primera barrera contra el ataque de microorganismos, perjudicando la interacción planta-hongo. Los polisacáridos pécticos componen la pared celular y representan aproximadamente el 30% de la composición de la pared celular en las células primarias de las plantas eudicot en las que los homogalacturonanos son el polímero más abundante (aproximadamente el 60%)⁸. El Golgi secreta compuestos complejos de pectina que componen las cadenas de ácido galacturónico, que pueden o no estar metilados ^8,9. Desde 2012, la literatura ha señalado que el grado de esterificación metilo de pectina es crítico para determinar la compatibilidad durante la infección por enzimas pécticas microbianas 10,11,12. Por lo tanto, se requieren protocolos para verificar la presencia y distribución de compuestos pécticos en los patosistemas planta-fúngico.

Se han utilizado diversas técnicas para detectar la encapsulación de papilas o haustorias. Los métodos de referencia utilizados son la microscopía electrónica de transmisión (TEM) de tejido fijo y la microscopía de luz de tejidos vivos y fijos. En cuanto a tem, varios estudios han demostrado el papel estructural de las aposiciones de la pared celular en la resistencia fúngica ^13,14,15,16, y que el uso de lectinas y anticuerpos es un método intrincado para localizar polímeros de carbohidratos¹⁶. Sin embargo, los estudios muestran que la microscopía de luz es un enfoque importante y que las herramientas histoquímicas e inmunohistoquímicas permiten una mejor comprensión de la composición de las papilas y el revestimiento de haustorio ^6,7.

Los hongos patógenos muestran dos tipos principales de estilos de vida: biotróficos y necrotróficos. Los hongos biotróficos dependen de las células vivas para su nutrición, mientras que los hongos necrotróficos matan a las células huésped y luego viven en los tejidos muertos¹⁷. En América Latina, la roya de la hoja del café, causada por el hongo Hemileia vastatrix, es una enfermedad importante en los cultivos de café^18,19. Hemileia vastatrix presenta un comportamiento biotrófico y, entre los cambios estructurales observados en especies o cultivares de café resistentes, se ha reportado una respuesta de hipersensibilidad, deposición de callosa, celulosa y lignina en las paredes celulares, así como hipertrofia celular¹⁴. Según el conocimiento de los autores, la literatura no informa sobre la importancia de la pectina en la resistencia a la roya del café. Por otro lado, los hongos necrotróficos que causan cercosporiosis se dirigen a la pectina a través de un conjunto de enzimas asociadas con la degradación de la pared celular, como las pectinasas y la poligalacturonasa²⁰. La cercosporiosis en el café, causada por el hongo Cercospora coffeicola, también es una amenaza importante para los cultivos de café^21,22. Este hongo causa lesiones necróticas tanto en las hojas como en las bayas. Después de la penetración, C. coffeicola coloniza los tejidos vegetales a través de las vías intracelulares e intercelulares ^23,24,25.

El presente protocolo investiga la presencia de estructuras fúngicas y pectina en las paredes celulares. Este protocolo es útil para identificar la respuesta de la planta asociada con la pectina (teñida con colorante rojo rutenio, que es específico de los grupos ácidos ácidos poliurónicos de la pectina), inducida por el huésped en una interacción biotrófica con el hongo. También ayuda a verificar el efecto de los hongos necrotróficos en la degradación de las paredes celulares pécticas. Los presentes resultados indican que el método de doble tinción es eficaz para discriminar estructuras y la fase reproductiva de los hongos.

Protocolo

1. Preparación de la solución tampón y los reactivos

1. Prepare un tampón de cacodilato de 2 M agregando 4.28 g de cacodilato de sodio a 100 ml de agua destilada y ajuste el pH a 7.25 con 0.2 N HCl.
2. Preparar 100 mL de la solución fijadora karnovsky mezclando 10 mL de glutaraldehído acuoso al 25%, 10 mL de formaldehído acuoso al 10%, 25 mL de tampón de cacodilato al 25% y 0,5 mL de CaCl_{2 26} M. Enrasar el volumen hasta 100 mL con agua destilada.
   NOTA: La solución se puede mantener en un refrigerador durante 6 meses.
   PRECAUCIÓN: La solución tampón de cacodilato es tóxica; por lo tanto, manipule la solución fijadora en una campana extractora de humos o en un área abierta. Evite inhalar los vapores de la solución y use guantes mientras manipula.
3. Preparar la solución nutritiva acuosa de Hoagland mezclando lo siguiente: 3 mM Ca(NO₃)_{2.4H 2}O, 2 mM NH₄H₂PO₄, 5 mM KH₂PO₄, 2 mM MgSO_{4.7H 2}O, 9.07 mM MnSO₄, 0.765 mM ZnSO_{4.7H 2}O, 46.4 mM H₃BO₃, 0.09 mM Na₂MoO₄. H₂O, 0,01 mM CuSO₄ y 36 mM FeSO 4,7H₂O como hierro-EDTA (ácido etilendiamina tetraacético)²⁷.

2. Muestras de plantas e inoculación de hongos

NOTA: Para experimentos en hojas afectadas por la roya del café, cinco plántulas de 2 meses de coffee arabica cv. Los catuaíes fueron cultivados y mantenidos en un invernadero en el Centro de Energía Nuclear en la Agricultura (CENA) de la Universidad de São Paulo, Piracicaba, Estado de São Paulo, Brasil.

1. Cultive plantas de café en macetas de plástico de 500 ml llenas de solución nutritiva acuosa de Hoagland (pH de ~ 5.5) durante 4 meses en una cámara de crecimiento mantenida a 27 ± 3 ° C con un fotoperíodo de 12 h creado por lámparas LED en el flujo de fotones de 250 μmol de fotones ^{s-1 m-2}. Reemplace la solución nutritiva de Hoagland cada semana durante 4 meses.
2. Inocular cuatro hojas expandidas de cinco plantas en sus superficies abaxiales con 1 x 10³ H. vastatrix uredosporas siguiendo el método descrito en la referencia²⁸. Después de la inoculación, mantenga las plantas durante 48 h en la oscuridad cubriéndolas con una bolsa de plástico negra. Cosechar las lesiones 30 días después de la inoculación.
3. Cosecha lesiones características causadas por Cercospora coffeicola de Coffea arabica cv. Plantas de Obatã ubicadas (coordenadas: -22.906506126269942, -47.015075902025266) en el Instituto Biológico, Campinas, Estado de São Paulo, Brasil. Antes de procesar la muestra, analizar las lesiones en un estereomicroscopio para verificar la presencia de café C. coffeicola conidia. Luego, monte algunas diapositivas con los conidios para confirmar la etiología de la enfermedad²².

3. Recolección de muestras, fijación y deshidratación

1. Usando un bisturí y una pinza, recolecte una muestra de hoja de ~ 10 mm² en la región media de la lesión (manchas amarillas; Figura 1) y sumergirlo en 30 ml de solución fijadora de Karnovsky (Figura 1 y Figura 2A). El paso de fijación puede tener lugar en un refrigerador durante 48 h.
2. Durante al menos cuatro veces, someta la muestra de hoja a un vacío bajo (500-600 mBar) utilizando una bomba de aceite durante 15 minutos cada una para aumentar la permeabilidad de la solución fijadora en el tejido de la hoja. Realice este paso con la rotación de muestra (Figura 1).
3. Después de la fijación, lave la muestra de la hoja tres veces en tampón de cacodilato de 0,5 M (pH 7,2) diluido en agua destilada durante 5 minutos cada una y luego transfiérala a una serie etanólica graduada (30%, 50%, 70%, 90% (2x) y 100% (2x)) durante 15 min en cada concentración de etanol (Figura 1 y Figura 2B).

4. Procedimiento de incrustación de Historesin

1. Transfiera gradualmente las muestras a metacrilato de glicol (GMA) en tres pasos, siguiendo las instrucciones del fabricante. Primero, haga la Solución A mezclando el polvo de GMA (1 g) con 100 ml de resina básica (kit de historesina; Tabla de Materiales) bajo agitación magnética, y luego siga los pasos a continuación.
   1. Sumergir las muestras en Solución 1:2 A: 100% etanol durante 3 h.
   2. Sumergir las muestras en Solución 1:1 A: 100% etanol durante 3 h.
   3. Sumergir las muestras en una resina básica pura durante 2-4 días. Durante este paso, someta las muestras a un vacío bajo al menos cuatro veces al día durante 15 minutos seguido de rotación.

5. Polimerización

NOTA: El proceso de polimerización requiere moldes de plástico de 1,2 ml, resina básica y endurecedor (consulte la Tabla de materiales para los detalles del kit comercial).

1. Mezclar 15 ml de la solución A (paso 4.1) con 1 ml del endurecedor en un vaso de precipitados con rotación durante 2 minutos para producir la solución de polimerización (solución B).
2. Coloque 1,2 ml de la solución de polimerización (Solución B) en moldes de plástico. Usando una púa de madera, transfiera las muestras de hojas lesionadas de resina básica pura a la Solución B (Figura 2C). Evite el uso de pinzas, ya que pueden causar aplastamiento del tejido.
3. Asegúrese de orientar rápidamente las muestras de hojas perpendiculares a los moldes de plástico, ya que la solución B se vuelve viscosa rápidamente en 5 minutos. Se puede colocar más de una muestra de hoja lesionada en un solo molde.
   NOTA: Se recomienda practicar el paso anterior varias veces antes de solicitar muchas muestras. Cuando hay muchas muestras, el tiempo de polimerización es diferente entre los moldes y la orientación perpendicular de las muestras de hojas puede ser difícil de lograr.
4. Cuando se logre la orientación perpendicular de las muestras de hojas, espere 30 minutos y luego transfiera el molde de plástico a una cámara de plástico o vidrio que contenga gel de sílice para evitar la humedad. Espere 2-3 h para la polimerización.
5. Una vez que la resina y la muestra de la hoja se polimericen después del período de 2-3 h, separe el bloque resultante del molde de plástico lijando la base del bloque con una lima de lijado. Luego, pegue el bloque a un trozo de madera (Figura 2D).

6. Seccionamiento

1. Utilizando un microtomo rotativo equipado con cuchillas de acero de 8 cm (Figura 2E), corte el bloque en secciones de 5 μm de espesor. Coloque las secciones en toboganes de vidrio cubiertos con agua destilada. Transfiera los portaobjetos con las secciones flotando sobre el agua a una placa caliente a 40 °C para que se sequen y promuevan la adhesión de las secciones a los portaobjetos de vidrio.
2. Después del secado (Figura 2F), etiquete las diapositivas de vidrio con el nombre de referencia del bloque y el número de diapositiva.

7. Proceso de doble tinción

1. Cubra las secciones con 2 ml de azul de algodón al 5% en lactofenol (40% de glicerol, 20% de fenol y 20% de ácido láctico en agua) y caliéntelas en una placa caliente a 45 ° C durante 5 min (Figura 3A).
2. Retire el exceso de tinte lavando la diapositiva tres veces en un vaso de precipitados lleno de agua destilada (Figura 3B-D).
3. Tinción con 2 mL de rojo rutenio al 0,01% en agua durante 1 min (Figura 3E).
4. Retire el exceso de tinte lavando la diapositiva tres veces en un vaso de precipitados lleno de agua destilada (Figura 3F, G).
5. Coloque una gota de agua destilada sobre las secciones y cubra las secciones con un estuche de 24 mm x 60 mm para realizar análisis de microscopía de luz.

Resultados

La tinción de lactofenol azul algodón en la sección incrustada en GMA reveló la presencia de varias estructuras fúngicas entre y dentro de las células mesófilas del café en las interacciones fúngicas biotróficas y necrotróficas.

En el patosistema biotrófico, cuando se tiñe utilizando el método de doble tinción, las hifas de Hemileia vastatrix que contienen paredes celulares y el contenido denso de protoplastos aparecen en azul oscuro tanto en el parénquima esponjoso co...

Discusión

El presente trabajo introduce una prueba histoquímica alternativa de doble tinción para investigar la composición de pectina de las paredes celulares que encapsula la haustoria en un patológico biotrófico. El objetivo también es demostrar la eficacia del método para detectar hongos necrotróficos y cambios en la pared celular inducidos por él. Aquí, la pectina de las paredes celulares del parénquima del café puede encapsular tanto el cuello como el haustorio del hongo de la roya Hemileia vastatrix. Si...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Blades DB80 HS	Leica	14035838383	Sectioning
Cacodylate buffer	EMS	# 11652	Fixation
Cotton Blue Lactophenol	Metaquímica	70SOLSIG024629	Staining
Formaldehyde	EMS	#15712	Fixation
Glutaraldehyde	EMS	#16216	Fixation
Historesin Kit	Technovit /EMS	#14653	Historesin for embedding
Hot plate	Dubesser	SSCD25X30-110V	Staining
Microscopy	Zeiss	#490040-0030-000	Image capture
Microtome (Leica RM 2540)	Leica	149BIO000C1 14050238005	Sectioning
Plastic molding cup tray	EMS	10176-30	Staining
Ruthenium red	LABHouse	#006004	Staining
Software Axion Vision	Zeiss	#410130-0909-000	Image capture
Vaccum pump	Prismatec	131 TIPO 2 V.C.	Fixation