Ensayo mecánico de evitación de conflictos para medir el comportamiento del dolor en ratones

Resumen

El ensayo mecánico de evitación de conflictos se utiliza como una lectura no reflexiva de la sensibilidad al dolor en ratones que se puede utilizar para comprender mejor las respuestas afectivo-motivacionales en una variedad de modelos de dolor de ratón.

Resumen

El dolor comprende dimensiones sensoriales (nociceptivas) y afectivas (desagradables). En modelos preclínicos, el dolor se ha evaluado tradicionalmente mediante pruebas reflexivas que permiten inferencias sobre el componente nociceptivo del dolor, pero proporcionan poca información sobre el componente afectivo o motivacional del dolor. Por lo tanto, el desarrollo de pruebas que capturen estos componentes del dolor es muy importante. Por lo tanto, los investigadores necesitan usar ensayos conductuales no reflexivos para estudiar la percepción del dolor en ese nivel. La evitación mecánica de conflictos (MCA) es un ensayo de comportamiento voluntario no reflexivo establecido, para estudiar las respuestas motivacionales a un estímulo mecánico nocivo en un paradigma de 3 cámaras. Un cambio en la preferencia de ubicación de un ratón, cuando se enfrenta a estímulos nocivos competidores, se utiliza para inferir lo desagradable percibido de la luz brillante frente a la estimulación táctil de las patas. Este protocolo describe una versión modificada del ensayo MCA que los investigadores del dolor pueden usar para comprender las respuestas afectivo-motivacionales en una variedad de modelos de dolor de ratón. Aunque no se describen específicamente aquí, nuestros datos de MCA de ejemplo utilizan el adyuvante de Freund completo intraplantar (CFA), la lesión nerviosa evitada (SNI) y un modelo de fractura / yeso como modelos de dolor para ilustrar el procedimiento de MCA.

Introducción

El dolor es una experiencia compleja con componentes sensoriales y afectivos. Una reducción en el umbral de percepción del dolor y la hipersensibilidad a los estímulos térmicos y/o mecánicos son características clave de esta experiencia, que las pruebas de comportamiento del dolor evocadas por estímulos pueden capturar (como la prueba de sensibilidad al calor de Hargreaves y la prueba de von Frey de sensibilidad mecánica)^1,2. Aunque tales pruebas dan resultados robustos y reproducibles, están limitadas por su dependencia de la retirada reflexiva de un estímulo nocivo percibido. Esto ha puesto en duda una dependencia continua de la investigación del dolor solo en estas pruebas. Con ese fin, los investigadores del dolor han estado explorando durante varios años pruebas de comportamiento alternativas / complementarias para su uso en modelos de dolor en roedores en un esfuerzo por capturar más de los componentes afectivos y / o motivacionales del dolor. Estas medidas no evocadas, voluntarias o no reflexivas (por ejemplo, correr con ruedas, actividad de madriguera, preferencia de lugar condicionado ^3,4,5) se están implementando en un intento de mejorar la traducibilidad de la investigación preclínica del dolor.

El ensayo de evitación mecánica de conflictos (MCA) fue descrito originalmente por Harte et al. en 2016⁶, se usa predominantemente en ratas ^7,8 y representa una modificación de un enfoque anterior: el paradigma de evitación de escape del lugar. En este enfoque, un estímulo nocivo de la pata trasera se realiza en una cámara deseable (oscura) para impulsar el comportamiento intencional del animal para escapar / evitar dicha estimulación ^9,10. En lugar de depender de la estimulación nociva manual de la pata trasera por parte de un observador, el ensayo MCA obliga a los ratones a negociar un estímulo potencialmente nocivo para escapar de un entorno aversivo y llegar a la cámara oscura. El conflicto/ evitación que da nombre al ensayo surge de estas dos motivaciones en competencia: escapar de las áreas brillantemente iluminadas y evitar la estimulación nociva de las patas. El ensayo MCA también comparte características con las pruebas de preferencia de lugar condicionadas, donde el emparejamiento del alivio del dolor con señales ambientales impulsa cambios en el comportamiento que reflejan una preferencia por el contexto de alivio del dolor / recompensa¹¹.

Fundamentalmente hablando, todos estos ensayos comparten un enfoque similar: usar un cambio en la preferencia de un animal por un entorno aversivo sobre otro como un indicador de su estado afectivo / motivacional. El ensayo MCA es un paradigma de 3 cámaras que consiste en una cámara brillantemente iluminada seguida de una cámara media oscura con sondas de altura ajustable y una tercera cámara oscura sin ningún estímulo aversivo. Un ratón no herido suele estar motivado para escapar a una cámara oscura, dada la aversión innata de los roedores a la luz brillante¹². En este ejemplo, la motivación natural para escapar de un entorno brillantemente iluminado supera la falta de inclinación a encontrar la estimulación de la pata trasera (las sondas de altura ajustable), que ocurre exclusivamente en el entorno oscuro. Por el contrario, un ratón que experimenta dolor (debido a la inflamación o la neuropatía, por ejemplo) puede optar por pasar más tiempo en el entorno brillantemente iluminado, ya que existe una motivación para evitar la desagradable experiencia táctil de las sondas mecánicas en el contexto de la hipersensibilidad táctil en curso.

En este artículo se describe una versión modificada del ensayo MCA. Hemos adaptado el método original (que se realizó en ratas⁶) para su uso en ratones. También hemos reducido el número de alturas de sonda probadas de seis a tres (0, 2 y 5 mm por encima de la altura del piso) para agilizar la adquisición de datos. Este enfoque ha sido probado a través de múltiples modelos de dolor, y validado con analgésicos conocidos, lo que indica que la hipersensibilidad al dolor y / o los cambios afectivos y motivacionales asociados están impulsando estos cambios en el comportamiento. Este enfoque es relativamente rápido de llevar a cabo y adaptable en comparación con otras medidas no reflexivas, que pueden llevar muchos días de habituación y entrenamiento ^1,2. En conjunto con otras medidas de dolor, MCA puede generar información valiosa sobre los aspectos afectivos y motivacionales del dolor.

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Protocolo

Todos los experimentos que involucran el uso de ratones y los procedimientos seguidos en ellos fueron aprobados por los Comités Institucionales de Cuidado y Uso de Animales del MD Anderson Cancer Center y la Universidad de Stanford, en estricta conformidad con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud.

1. Construcción de MCA

1. Construir cámara 1 con las siguientes dimensiones: 125 mm x 125 mm x 125 mm (ancho x fondo x alto) a partir de acrílico blanco opaco de 3 mm de espesor utilizado para las paredes laterales, piso, techo. Use un acrílico transparente de 3 mm de espesor para la pared frontal. Pegue todos los lados con mucha anticipación usando adhesivo acrílico dedicado.
   PRECAUCIÓN: El adhesivo acrílico se considera material peligroso (inflamable, dañino para el vapor, puede ser dañino si se ingiere, puede irritar la piel o los ojos). Dichos adhesivos solo deben usarse de acuerdo con las instrucciones del fabricante (es decir, con el EPP adecuado en un área bien ventilada).
2. Conecte la tapa de la cámara 1 con una bisagra, de modo que los ratones se puedan colocar fácilmente y recuperar de la cámara. Conecte cinta de diodo emisor de luz (LED) autoadhesiva a la superficie interna de la tapa para proporcionar una iluminación de ~ 4800 lux.
3. Cierre la cámara 1 del resto del MCA deslizando una lámina acrílica opaca dentro y fuera de su posición.
4. Construya la cámara de prueba MCA, cámara 2, como una cámara sin iluminación de 270 mm de largo fabricada en acrílico rojo oscuro translúcido (3 mm de grosor) en todos los lados, con una tapa con bisagras en la parte superior. Coloque una rejilla de 13 x 31 de orificios de 2 mm en el piso de la cámara 2 a través de la cual pueda sobresalir una serie de sondas romas con puntas de 0,5 mm de diámetro (por ejemplo, pasadores de mapa embotados).
   NOTA: Pasadores contundentes con un bloque de papel de lija de 120 granos o similar. Límpielos en agua tibia con detergente antes de desinfectarlos con desinfectante esporcida.
5. Ajuste la altura de las sondas colocando láminas acrílicas adicionales debajo de la placa base de la sonda (Figura 1). Con este enfoque, configure el dispositivo con tres ajustes: 0 mm, 2 mm y 5 mm de altura de sonda.
6. Como alternativa a los pines de mapa embotados o materiales similares, utilice los archivos de la impresora 3D para imprimir el piso de la cámara 2 y la placa de la sonda (consulte el Archivo complementario 1: SpikeBed-MCA.stl, que se refiere a las sondas mecánicas, y el Archivo complementario 2: MCA_baseplate.stl que forma el piso de la cámara 2).
   NOTA: Si la impresión 3D no está disponible, pegue los pines de mapa a una hoja acrílica utilizando el mismo adhesivo acrílico utilizado para construir las paredes del dispositivo.
7. Imprima con un material lavable y biocompatible, como plástico nylon 12 o similar (recomendado).
8. Construir cámara 3 con las siguientes dimensiones: 125 mm x 125 mm x 125 mm como una caja de acrílico rojo oscuro translúcida sin iluminación (en todos los lados), colocada en el extremo opuesto a la cámara 1. Coloque una tapa con bisagras en la cámara, similar a las cámaras 1 y 2. Esta cámara sirve como un área de escape oscurecida de las sondas mecánicas en la cámara 2.

2. Habituación y pruebas de MCA en ratones

1. Al igual que con todos los experimentos que involucran resultados conductuales en animales, observe la aleatorización y el cegamiento apropiados para minimizar el sesgo potencial.
   NOTA: Los resultados representativos se generaron mediante el uso de ratones C57BL/6J machos y hembras de 8-12 semanas de edad (número de cepa 000664 de Jackson Laboratories). Los ratones fueron alojados socialmente, hasta 5 por jaula, con acceso a alimentos y agua ad libitum y un ciclo de luz de 07:00 h a 19:00 h. McA tuvo lugar en el período de luz, entre las 09:00 h y las 12:00 h.
2. Un día antes de que se programen las pruebas de referencia, aclimate a los ratones a la unidad MCA durante 5 minutos (mínimo) a 15 minutos (máximo) con sus compañeros de jaula para facilitar la exploración social de todo el dispositivo.
3. A lo largo del proceso, asegúrese de que los LED de la cámara 1 estén apagados, que la barrera entre las cámaras 1 y 2 se deje abierta y que las sondas se ajusten a una altura de cero (es decir, que no sobresalgan a través del piso de la cámara 2).
4. Realizar una prueba basal de ratones (opcional) si el estudio incorpora animales de control negativos (es decir, cirugía simulada o controles de inyección de vehículos). Si lo desea, use una prueba de referencia para excluir cualquier valor atípico no lesionado que nunca cruce a la cámara 2, aunque esto no ha demostrado ser necesario. Si se utiliza, informe todos los criterios de exclusión y el número de ratones excluidos.
   1. Antes de comenzar las pruebas, configure una cámara de video capaz de grabar imágenes de 1080p en un trípode con una vista lateral de todo el dispositivo MCA. Ajuste el campo de visión de tal manera que el MCA llene la imagen grabada.
   2. Una vez que comience la grabación, sostenga una placa de borrado en seco de mano en el campo de visión de la cámara para etiquetar el inicio del video con información de identificación sobre la ejecución de la prueba del animal (por ejemplo, ID del mouse, altura de la sonda, fecha, punto de hora, etc.).
   3. Para la primera ejecución, establezca la altura de la sonda en cero. Transfiera el ratón que se va a probar de su jaula doméstica a la cámara 1 con la puerta de barrera en su lugar. Inicie un temporizador que esté visible en el material de archivo grabado.
      NOTA: El temporizador garantiza que los intervalos entre las diferentes partes de la prueba sean coherentes entre ejecuciones.
   4. Después de 10 s, encienda la cámara 1 LED. Después de que el ratón haya estado en la cámara iluminada durante 20 s, retire la barrera entre las cámaras 1 y 2.
   5. Observar al animal durante 2 min. Mida las latencias y / o los tiempos de permanencia con un cronómetro mientras la prueba está en curso. Alternativamente, las imágenes de video se pueden analizar una vez que se completan las pruebas.
      NOTA: Por razones de rendimiento y evitando la exposición prolongada a estímulos aversivos, el corte se fijó en 2 min.
   6. Medir uno o más de los varios resultados útiles que se han identificado (ver más abajo; Figura 1). Se recomienda analizar las 5 medidas de resultado al comenzar las pruebas, para determinar qué aspectos del comportamiento difieren en una configuración experimental dada.
      1. Opción I: Registre la latencia en la primera entrada a la cámara 2. Opción II: Registre la latencia para cruzar más de la mitad de la cámara 2. Opción III: Registrar el tiempo total de permanencia en la cámara 2. Opción IV: Registre la latencia para llegar a la cámara 3 (escape). Opción V: Similar a la opción II, registre el tiempo total de permanencia en cada cámara dentro de los 2 minutos y conviértalos en proporciones.
         NOTA: Dado que cada experimento es único y puede estar influenciado por factores biológicos y cambios de comportamiento exclusivos del modelo de enfermedad, los investigadores pueden experimentar con estas y otras medidas en sus propias manos.
   7. Una vez que se complete la prueba, devuelva el ratón a su jaula doméstica, limpie las cámaras MCA con etanol al 70% y deje que se seque por completo.
      NOTA: El boli fecal generalmente se puede limpiar de la cámara con relativa facilidad con toallas de papel antes del etanol / desinfectante. Si se necesita una limpieza más profunda, las cámaras 2 y 3 se pueden desmontar y sumergir en agua tibia y jabonosa.
   8. Después de ejecutar todos los ratones de una cohorte con la altura de la sonda establecida en cero, inserte una lámina de acrílico de 3 mm debajo de la placa base de la sonda mecánica y repita los pasos 2.4.2 a 2.4.7 con una altura de sonda de 2 mm.
   9. Después de ejecutar todos los ratones con la altura de la sonda establecida en 2 mm, inserte una segunda lámina de acrílico de 3 mm debajo de la placa base de la sonda y repita los pasos 2.4.2 a 2.4.7 con una altura de sonda de 5 mm.
      NOTA: Un grupo de 8 ratones puede ser probado en aproximadamente 2 h utilizando este enfoque. Use grupos más pequeños si se requiere un tiempo más preciso después de la droga (por ejemplo, para un experimento de curso de tiempo de drogas).
   10. Realice una limpieza final con un desinfectante al final de una sesión de prueba.
5. Repetir las pruebas después de inducir hipersensibilidad al dolor y/o con tratamiento farmacológico.
6. Compare el rendimiento de cada ratón al inicio del estudio con su rendimiento después de inducir el dolor. Evaluar el impacto de una intervención farmacológica comparando animales tratados con vehículos con animales tratados con fármacos en el mismo punto temporal.
7. Realizar análisis estadísticos no paramétricos (por ejemplo, la prueba U de Mann Whitney) si los animales alcanzan el límite de 2 minutos sin satisfacer la medida de resultado deseada, lo que resulta en datos no continuos.

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Resultados

El ensayo MCA se ha utilizado con éxito con varios modelos de dolor de ratón mecánicamente distintos. La Figura 2 muestra datos en los que la medida de resultado de elección estaba cruzando el punto medio de la cámara 2 (Figura 2A). Los datos obtenidos mediante el uso del punto medio versus el escape en la cámara 3 son muy similares, ~ 40 s para la mitad del camino versus ~ 45 s para el escape de la cámara 3 en el modelo de lesión nerviosa evitada (SNI) ...

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Discusión

Al igual que con todas las pruebas de comportamiento, el manejo adecuado, la aleatorización y el cegamiento al tratamiento de los animales es esencial en todo momento. Dados los aportes multifactoriales en comportamientos complejos y toma de decisiones, es imperativo que los animales sean manejados, habituados y probados de la manera más consistente posible mientras se minimiza la angustia. También se debe tener cuidado para reproducir el momento de la colocación del mouse en la cámara 1, encender las luces LED y el...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
32.8ft 3000K-6000K Tunable White LED Strip Lights, Dimmable Super Bright LED Tape Lights with 600 SMD 2835 LEDs	Lepro	SKU: 410087-DWW-US	For lighting chamber 1. https://www.lepro.com/32ft-dimmable-tunable-white-led-strip-lights.html
3D printed 'spike bed' and 'chamber 2 floor'	Shapeways	N/A	Optional, for mechanical probes as an alternative to blunted map pins.
70% ethanol	Various	N/A	To clean MCA between mice.
Acryl-Hinge 2	TAP Plastics	N/A	for attaching chamber lids to rear walls. https://www.tapplastics.com/product/plastics/handles_hinges_latches/acryl_hinge_2/122
Chemcast Cast Acrylic Sheet, Clear	TAP Plastics	N/A	3mm thick. For front wall of chamber 1. https://www.tapplastics.com/product/plastics/cut_to_size_plastic/acrylic_sheets_cast_clear/510
Chemcast Cast Transparent Colored Acrylic, Transparent Dark Red - 50%	TAP Plastics	N/A	3mm thick. 50% light transmission. For walls and lids of chambers 2 and 3. https://www.tapplastics.com/product/plastics/cut_to_size_plastic/acrylic_sheets_transparent_colors/519
Chemcast Translucent & Opaque Colored Cast Acrylic, Sign Opaque White - 0.1%	TAP Plastics	N/A	3mm thick. For side walls and lid of chamber 1. https://www.tapplastics.com/product/plastics/cut_to_size_plastic/acrylic_sheets_color/341
Disinfectant (e.g. Quatricide)	Pharmacal Research Laboratories, Inc.	65020F	To disinfect MCA at the end of a testing session.
Dry-erase markers and board	Various	N/A	To add experimental info to the beginning of video footage.
Map pins	Various	N/A	Optional, for mechanical probes. Use sandpaper to blunt sharp points before use. Can be used in place of 3D-printed parts.
Paper towels	Various	N/A	To clean/disinfect MCA.
SCIGRIP Weld-On #3 Acrylic Cement	TAP Plastics	N/A	For assembling acrylic sheets into chambers and affixing hinges. https://www.tapplastics.com/product/repair_products/plastic_adhesives/weld_on_3_cement/131
Stopwatch	Various	N/A	To record escape latencies/dwell times in real-time or from recorded video.
Timer	Various	N/A	To ensure LED turn-on, barrier removal and test completion are timed consistently.
Video camera	Various	HDRCX405 Handycam Camcorder	To record mouse behavior in the MCA device. Can be substituted with any consumer-grade video camera capable of 1080p resolution.
Tripod	Famall	N/A	Any tripod that can hold the camera at bench height for recording MCA footage is acceptable.