Imágenes de dispersión Raman estimuladas en dos colores en tiempo real del cerebro del ratón para el diagnóstico de tejidos

Resumen

La microscopía de dispersión Raman estimulada (SRS) es una técnica de imagen potente, no destructiva y sin etiquetas. Una aplicación emergente es la histología Raman estimulada, donde las imágenes SRS de dos colores en las transiciones Raman de proteínas y lípidos se utilizan para generar imágenes de pseudo-hematoxilina y eosina. Aquí, demostramos un protocolo para imágenes SRS de dos colores en tiempo real para el diagnóstico de tejidos.

Resumen

La microscopía de dispersión Raman estimulada (SRS) se ha convertido en una poderosa técnica de imagen óptica para el diagnóstico de tejidos. En los últimos años, se ha demostrado que el SRS de dos colores puede proporcionar imágenes equivalentes a hematoxilina y eosina (H&E) que permiten un diagnóstico rápido y confiable del cáncer cerebral. Tal capacidad ha permitido emocionantes aplicaciones de diagnóstico de cáncer intraoperatorio. Las imágenes SRS de dos colores del tejido se pueden realizar con una fuente láser de picosegundos o femtosegundos. Los láseres de femtosegundo tienen la ventaja de permitir modos de imagen flexibles, incluidas imágenes hiperespectrales rápidas e imágenes SRS de dos colores en tiempo real. Un enfoque de enfoque espectral con pulsos láser chirriados se usa típicamente con láseres de femtosegundo para lograr una alta resolución espectral.

La adquisición de SRS de dos colores se puede realizar con modulación ortogonal y detección de bloqueo. La complejidad del canto de pulso, la modulación y la caracterización es un cuello de botella para la adopción generalizada de este método. Este artículo proporciona un protocolo detallado para demostrar la implementación y optimización de SRS de enfoque espectral e imágenes en tiempo real de dos colores del tejido cerebral de ratón en el modo epi. Este protocolo se puede utilizar para una amplia gama de aplicaciones de imágenes SRS que aprovechan la alta velocidad y la capacidad de imágenes espectroscópicas de SRS.

Introducción

El diagnóstico tisular tradicional se basa en protocolos de tinción seguidos de un examen bajo un microscopio óptico. Un método de tinción común utilizado por los patólogos es la tinción H&E: la hematoxilina tiñe los núcleos celulares de un azul violáceo, y la eosina tiñe la matriz extracelular y el citoplasma de rosa. Esta simple tinción sigue siendo el estándar de oro en patología para muchas tareas de diagnóstico de tejidos, particularmente el diagnóstico de cáncer. Sin embargo, la histopatología de H&E, particularmente la técnica de seccionamiento congelado utilizada en un entorno intraoperatorio, todavía tiene limitaciones. El procedimiento de tinción es un proce....

Protocolo

Todos los procedimientos experimentales con animales se llevaron a cabo con cerebros de ratón de 200 μm, fijos y seccionados, de acuerdo con el protocolo (# 4395-01) aprobado por el Comité del Instituto de Cuidado y Uso animal (IACUC) de la Universidad de Washington. Los ratones de tipo salvaje (cepa C57BL/6J) son sacrificados con CO₂. Luego, se realiza una craneotomía para extraer sus cerebros para la fijación en paraformaldehído al 4% en solución salina tamponada con fosfato. Los cerebros están incrustados en una mezcla de agarosa al 3% y gelatina al 0,3% y se seccionan en rodajas de 200 μm de espesor mediante un vibratomo.

Resultados

Optimización de la resolución espectral:
La dispersión a través de un material se ve afectada por el medio dispersivo (longitud y material) y la longitud de onda. Cambiar la longitud de la varilla de dispersión afecta la resolución espectral y el tamaño de la señal. Es una relación de toma y daca que se puede sopesar de manera diferente dependiendo de la aplicación. Las varillas estiran el pulso del haz de ser ancho en frecuencia y estrecho en el tiempo a ser estrecho en frecuencia y ancho e.......

Discusión

El esquema de imágenes SRS de dos colores presentado en este protocolo depende de la implementación adecuada de imágenes SRS de un solo color. En las imágenes SRS de un solo color, los pasos críticos son la alineación espacial, la alineación temporal, la profundidad de modulación y el cambio de fase. La combinación espacial de los dos haces se logra mediante un espejo dicroico. Se utilizan varios espejos de dirección para un ajuste fino al enviar las vigas al espejo dicroico. Una vez que los haces se combinan c.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm Achromatic Lens	THORLABS	AC254-100-B	Broadband, 650 - 1,050 nm, achromatic lens focal length, 100 mm
20 MHz bandpass filter	Minicircuits	BBP-21.4+	Lumped LC Band Pass Filter, 19.2 - 23.6 MHz, 50 Ω
200 mm Achromatic Lens	THORLABS	AC254-200-B	Broadband, 650 - 1,050 nm, achromatic lens focal length, 200 mm
Achromatic Half Waveplate	Union Optic	WPA2210-650-1100-M25.4	Broadband half waveplate
Achromatic Quarter Waveplate	Union Optic	WPA4210-650-1100-M25.4	Broadband quarter waveplate
Beam Sampler	THORLABS	BSN11	10:90 Plate Beamsplitter
Dichroic Mirror	THORLABS	DMSP1000	Other dichroics with a center wavelength around 1,000 nm can be used.
DMSO (Dimethyl sulfoxide)	Sigma Aldrich	472301	Solvent for calibration of Raman shift. Other solvents with known Raman peaks can be used.
Electrooptic Amplitude Modulator	THORLABS	EO-AM-NR-C1	Two EOMs are needed for orthogonal modulation and dual-channel imaging. Resonant version is recommended so lower driving voltage can be used.
False H&E Staining Script	Matlab		https://github.com/TheFuGroup/HE_Staining
Fanout Buffer	PRL-414B	Pulse Research Lab	1:4 TTL/CMOS Fanout Buffer and Line Driver, for generating the EOM driving frequency and the reference to the lock-in
Fast Photodiode	THORLABS	DET10A2	Si Detector, 1 ns Rise Time
Frequency Divider	PRL-220A	Pulse Research Lab	TTL Freq. Divider (f/2, f/4, f/8, f/16), for generating 20MHz from the laser output.
Highly Dispersive Glass Rods	Union Optic	CYLROD01	High dispersion H-ZF52A Rod lens 120 mm, SF11 Rod lens 100 mm
Insight DS+	Newport		Laser system capable of outputting two synchronzied pulsed lasers (one fixed beam at 1, 040 nm and one tunable beam, ranging from 680-1,300 nm) with a repetition rate of 80 MHz.
Lock-in Amplifier	Liquid Instruments	Moku Lab	Lock-in amplifier to extract SRS signal from the photodiode. A Zurich Instrument HF2LI or similar instrument can be used as well.
Mirrors	THORLABS	BB05-E03-10	Broadband Dielectric Mirror, 750 - 1,100 nm. Silver mirrors can also be used.
Motorized Delay Stage	Zaber	X-DMQ12P-DE52	Delay stage for fine control of the temporal overlap of the pump and the Stokes lasers. Any other motorized stage should work.
Oil Immersion Condensor	Nikon	CSC1003	1.4 NA. Other condensers with NA>1.2 can be used.
Oscilloscope	Tektronix	TDS7054	Any other oscilloscope with 400 MHz bandwdith or higher should work.
Phase Shifter	SigaTek	SF50A2	For shifting the phase of the modulation frequency
Photodiode	Hamamatsu Corp	S3994-01	Silicon PIN diode with large area (10 x 10 cm2). Other diodes with large area and low capacitance can be used.
Polarizing Beam Splitter	Union Optic	PBS9025-620-1000	Broadband polarizing beamsplitter
Refactive Index Database			refractiveindex.info
Retro-reflector	Edmund Optics	34-408	BBAR Right Angle Prism. Other prisms or retroreflector can be used.
RF Power Amplifier	Minicircuits	ZHL-1-2W+	Gain Block, 5 - 500 MHz, 50 Ω
Scan Mirrors	Cambridge Technologies	6215H	We used a 5mm mirror set with silver coating
ScanImage	Vidrio	ScanImage Basic	Laser scanning microscope control software
Shortpass Filter	THORLABS	FESH1000	25.0 mm Premium Shortpass Filter, Cut-Off Wavelength: 1,000 nm. For efficient suppression of the Stokes, two filters may be necessary.
Upright Microscope	Nikon	Eclipse FN1	Any other microscope frame can be used. If a laser scanning microscope is available, it can be used directly. Otherwise, a galvo scanner and scan lens needed to be added to the microscope.
Water Immersion Objective	Olympus	XLPLN25XWMP2	The multiphoton 25X Objective has a NA of 1.05. Other similar objectives can be used.