Extirpación de ojos en larvas vivas de pez cebra para examinar el crecimiento dependiente de la inervación y el desarrollo del sistema visual

Resumen

El artículo explica cómo extirpar quirúrgicamente los ojos de las larvas vivas de pez cebra como el primer paso hacia la investigación de cómo la entrada de retina influye en el crecimiento y desarrollo del tectum óptico. Además, el artículo proporciona información sobre la anestesia larvaria, la fijación y la disección cerebral, seguida de inmunohistoquímica e imágenes confocales.

Resumen

El pez cebra exhibe un notable crecimiento de por vida y habilidades regenerativas. Por ejemplo, los nichos especializados de células madre establecidos durante la embriogénesis apoyan el crecimiento continuo de todo el sistema visual, tanto en el ojo como en el cerebro. El crecimiento coordinado entre la retina y el tectum óptico garantiza un mapeo retinotópico preciso a medida que se agregan nuevas neuronas en los ojos y el cerebro. Para abordar si los axones de la retina proporcionan información crucial para regular los comportamientos de las células madre y progenitoras tectales, como la supervivencia, la proliferación y / o la diferenciación, es necesario poder comparar los lóbulos tectales inervados y denervados dentro del mismo animal y entre animales.

La extirpación quirúrgica de un ojo del pez cebra larval vivo seguida de la observación del tectum óptico logra este objetivo. El video que lo acompaña muestra cómo anestesiar larvas, afilar electrolíticamente agujas de tungsteno y usarlas para extirpar un ojo. A continuación, muestra cómo diseccionar cerebros de larvas fijas de pez cebra. Finalmente, el video proporciona una visión general del protocolo para la inmunohistoquímica y una demostración de cómo montar embriones teñidos en agarosa de bajo punto de fusión para microscopía.

Introducción

El objetivo de este método es investigar cómo la entrada de retina influye en el crecimiento y desarrollo del tectum óptico, el centro de procesamiento visual en el cerebro del pez cebra. Al extraer un ojo y luego comparar los dos lados del tectum óptico, se pueden observar y normalizar los cambios técnicos dentro de la misma muestra, lo que permite la comparación entre múltiples muestras. Los enfoques moleculares modernos combinados con esta técnica proporcionarán información sobre los mecanismos subyacentes al crecimiento y desarrollo del sistema visual, así como a la degeneración y regeneración axonal.

Los sistemas sensoriales (visual, a....

Protocolo

Los métodos en este documento se llevaron a cabo de acuerdo con las pautas y la aprobación de los Comités Institucionales de Cuidado y Uso de Animales de Reed College y University College London. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre las cepas de pez cebra utilizadas en este estudio.

1. Preparar materiales y herramientas

1. Hacer soluciones.
   1. Hacer embrión medio (E3¹⁴) diluyendo una cepa de 60x (300 mM NaCl, 10.2 mM KCl, 20 mM CaCl 2-dihidrato y 20 mM MgCl_{2-hexahidrato} en agua desionizada, autoclave y almacenada a temperatura ambiente).<....

Resultados

Para confirmar si la extirpación ocular fue completa y evaluar cómo cambia el tectum óptico, se realizaron cirugías en la cepa Tg[atoh7:RFP], que marca todas las RGC con una RFP dirigida a la membrana y, por lo tanto, todos los axones que se proyectan desde la retina y forman el nervio óptico²⁴. Aunque el uso de esta cepa no es absolutamente necesario, permite la observación y visualización directa del nervio óptico termini en el tectum neuropil óptico. Otros enfoques para etique.......

Discusión

Las técnicas descritas en este artículo ilustran uno de los muchos enfoques para estudiar el desarrollo del sistema visual de vertebrados en el pez cebra. Otros investigadores han publicado métodos para diseccionar la retina embrionaria y realizar análisis de expresión génica¹⁹ o visualizar la actividad neuronal en el tectum óptico³⁰. Este artículo proporciona un enfoque para explorar cómo la entrada diferencial de la retina puede influir en los comportamientos cel.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment and supplies:
Breeding boxes	Aquaneering	ZHCT100
Dow Corning high vacuum grease	Sigma or equivalent supplier	Z273554
Erlenmeyer flasks (125 mL)			For making Marc's Modified Ringers (MMR) with antibiotics for post-surgery incubation
Fine forceps - Dumont #5	Fine Science Tools (FST)	11252-20
Glass Pasteur pipettes	DWK Lifescience	63A53 & 63A53WT	For pipetting embryos and larvae
Glass slides for microscopy	VWR or equivalent supplier	48311-703	Standard glass microscope slides can be ordered from many different laboratory suppliers.
Glassware including graduated bottles and graduated cylinders			For making and storing solutions
2-part epoxy resin	ACE Hardware or other equivalent supplier of Gorilla Glue or equivalent	0.85 oz syringe	https://www.acehardware.com/departments/paint-and-supplies/tape-glues-and-adhesives/glues-and-epoxy/1590793
Microcentrifuge tube (1.7 mL)	VWR or equivalent supplier	22234-046
Nickel plated pin holder (17 cm length)	Fine Science Tools (FST)	26018-17	To hold tungsten wire while sharpening and performing surgeries/dissections.
Nylon mesh tea strainer or equivalent	Ali Express or equivalent		For harvesting zebrafish eggs after spawning; https://www.aliexpress.com/item/1005002219569756.html
Paper clip			For Tungsten needle sharpening device.
Petri dishes 100 mm	Fischer Scientific or equivalent supplier	50-190-0267
Petri dishes 35 mm	Fischer Scientific or equivalent supplier	08-757-100A
Pipette pump	SP Bel-Art or equivalent	F37898-0000
Potassium hydroxide (KOH)	Sigma	909122	For Tungsten needle sharpening device. Make a 10% w/v solution of KOH in the hood by adding pellets to deionized water.
Power supply (variable voltage)			For Tungsten needle sharpening device. Any power supply with variable voltage will work (even one used for gel electrophoresis).
Sylgard 184 Elastomer kit	Dow Corning	3097358
Tungsten wire (0.125 mm diameter)	World Precision Instruments (WPI)	TGW0515	Sharpen to remove eye and dissect larvae.
Variable temperature heat block	The Lab Depot or equivalent supplier	BSH1001 or BSH1002	Set to 40-42 °C ahead of experiments.
Wide-mouth glass jar with lid (e.g., clean jam or salsa jar)			For Tungsten needle sharpening device.
Wires with alligator clip leads			For Tungsten needle sharpening device.
Microscopes:
Dissecting microscope			Any type will work but having adjustable transmitted light on a mirrored base is preferred.
Laser scanning confocal microscope			High NA, 20-25x water dipping objective lens is recommended. Microscope control and image capture software (Elements) is used here but any confocal microscope will work.
Reagents for surgeries and dissections:
Calcium chloride dihydrate	Sigma	C7902	For Marc's Modified Ringers (MMR) and embryo medium (E3).
HEPES	Sigma	H7006	For Marc's Modified Ringers (MMR).
Low melting point agarose	Invitrogen	16520-050	Make 1% in embryo medium (E3) or Marc's Modified Ringers (MMR).
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma	1374248	For embryo medium (E3).
Magnesium sulfate	Sigma	M7506	For Marc's Modified Ringers (MMR).
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	19210	Dilute 8% (w/v) stock with 2x concentrated PBS (diluted from 10x PBS stock).
Penicillin/Streptomycin	Sigma	P4333-20ML	Dilute 1:100 in Marc's Modified Ringers.
Phosphate buffered saline (PBS) tablets	Diagnostic BioSystems	DMR E404-01	Make 10x stock in deionized water, autoclave and store at room temperature. Dilute to 1x working concentration.
Potassium chloride	Sigma	P3911	For Marc's Modified Ringers (MMR) and embryo medium (E3).
Sodium chloride	Sigma	S9888	For Marc's Modified Ringers (MMR) and embryo medium (E3).
Sodium hydroxide	Sigma	S5881	Make 10 M and use to adjust pH of MMR to 7.4.
Sucrose	Sigma	S9378
Tricaine-S	Pentair	100G #TRS1	Recipe: https://zfin.atlassian.net/wiki/spaces/prot/pages/362220023/TRICAINE
Reagents for immunohistochemistry:
Alexafluor 568 tagged Secondary antibody to detect rabbit IgG	Invitrogen	A-11011	Use at 1:500 dilution for wholemount immunohistochemistry.
DAPI or ToPro3	Invitrogen	1306 or T3605	Make up 1 mg/mL solutions in DMSO; 1:5,000 dilution for counterstaining.
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma	D8418	A component of immunoblock buffer.
Methanol (MeOH)	Sigma	34860	Mixing MeOH with aqueous solutions like PBST is exothermic. Make the MeOH/PBST solutions at least several hours ahead of time or cool them on ice before using.
Normal goat serum	ThermoFisher Scientific	50-062Z	A component of immunoblock buffer. Can be aliquoted in 1-10 mL volumes and stored at -20 °C.
Primary antibody to detect phosphohistone H3	Millipore	06-570	Use at 1:300 dilution for wholemount immunohistochemistry.
Primary antibody to detect Red Fluorescent Protein (RFP; detects dsRed derivatives)	MBL International	PM005	Use at 1:500 dilution for wholemount immunohistochemistry.
Proteinase K (PK)	Sigma	P2308-10MG	Make up 10 mg/mL stock solutions in PBS and use at 10 µg/mL.
Triton X-100	Sigma	T8787	Useful to make a 20% (v/v) stock solution in PBS.
Software for data analysis
ImageJ (Fiji)			freeware for image analysis; https://imagej.net/software/fiji/
Rstudio			freeware for statistical analysis and data visualization; https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/
Adobe Photoshop or GIMP			Proprietary image processing software (Adobe Photoshop and Illustrator) are often used to compose figures). A freeware alternative is Gnu Image Manipulation Program (GIMP; https://www.gimp.org/)
Zebrafish strains			available from the  Zebrafish International Resource Centers in the US (https://zebrafish.org/home/guide.php) or in Europe (https://www.ezrc.kit.edu/). Specialized transgenic strains that have not yet been deposited in either resource center can be requested from individual labs after publication.