Detección y captura en tiempo real de subpoblaciones celulares invasivas a partir de cocultivos

Resumen

Describimos un enfoque para detectar y capturar subpoblaciones celulares invasivas en tiempo real. El diseño experimental utiliza el análisis celular en tiempo real mediante el monitoreo de los cambios en la impedancia eléctrica de las células. Se pueden capturar células invasivas de cáncer, inmunes, endoteliales o estromales en tejidos complejos y se puede evaluar el impacto de los cocultivos.

Resumen

La invasión y la diseminación metastásica de las células cancerosas son la principal causa de muerte por cáncer. Los ensayos desarrollados desde el principio para medir el potencial invasivo de las poblaciones de células cancerosas generalmente generan una medición de punto final único que no distingue entre las subpoblaciones de células cancerosas con diferente potencial invasivo. Además, el microambiente tumoral consiste en diferentes células e inmunitarias y del estroma residentes que alteran y participan en el comportamiento invasivo de las células cancerosas. La invasión en los tejidos también juega un papel en las subpoblaciones de células inmunes que se defienden de los microorganismos o eliminan las células enfermas del parénquima y las células endoteliales durante la remodelación del tejido y la angiogénesis. El análisis celular en tiempo real (RTCA) que utiliza biosensores de impedancia para monitorear la invasión celular fue un gran paso adelante más allá de la medición de la invasión en el punto final: esto proporciona mediciones continuas a lo largo del tiempo y, por lo tanto, puede revelar diferencias en las tasas de invasión que se pierden en el ensayo de punto final. Utilizando la tecnología RTCA actual, ampliamos las matrices de doble cámara agregando una cámara adicional que puede contener células estromales y / o inmunes y permite medir la tasa de invasión bajo la influencia de factores secretados de células estromales o inmunes cocultivadas a lo largo del tiempo. Más allá de esto, el diseño único permite separar cámaras en cualquier momento y aislar la célula cancerosa más invasiva u otras subpoblaciones celulares que están presentes en mezclas heterogéneas de aislados tumorales probados. Estas células cancerosas más invasivas y otras subpoblaciones celulares impulsan la progresión maligna a la enfermedad metastásica, y sus características moleculares son importantes para estudios mecanicistas en profundidad, el desarrollo de sondas de diagnóstico para su detección y la evaluación de vulnerabilidades. Por lo tanto, la inclusión de medicamentos de moléculas pequeñas o grandes se puede utilizar para probar el potencial de las terapias que se dirigen al cáncer y / o subpoblaciones de células estromales con el objetivo de inhibir (por ejemplo, células cancerosas) o mejorar (por ejemplo, células inmunes) el comportamiento invasivo.

Introducción

La invasión celular es un proceso importante que permite a las células cruzar las barreras de la membrana basal en respuesta a las señales ambientales proporcionadas por las células estromales. Es un paso crucial durante varias etapas de desarrollo para las respuestas inmunes, la cicatrización de heridas, la reparación de tejidos y las neoplasias malignas que pueden progresar de lesiones locales a cánceres invasivos y metastásicos¹. Los ensayos desarrollados desde el principio para medir el potencial invasivo de las poblaciones celulares generalmente generan una medición de punto final único o requieren un etiquetado previo de las células invasivas². La integración de técnicas de microelectrónica y microfluídica se desarrolla ahora para detectar diferentes aspectos de la biología celular como la viabilidad, el movimiento y la fijación utilizando la impedancia eléctrica de células vivas en microelectrodos ^3,4. La medición de la impedancia permite una evaluación cuantitativa, no invasiva y sin etiquetas del estado celular³. Aquí describimos una matriz de tres cámaras basada en el diseño del sistema de Análisis Celular en Tiempo Real (RTCA) que fue desarrollado por Abassi et ^al.5. La matriz de tres cámaras permite la evaluación de células cocultivadas en la invasión celular y la recuperación de células invasivas para análisis o expansión adicionales.

En el sistema analizador celular, las células invaden a través de una matriz extracelular recubierta sobre una membrana porosa y alcanzan una matriz de electrodos interdigitados colocada en el lado opuesto de la barrera. A medida que las células invasivas continúan uniéndose y ocupando esta matriz de electrodos con el tiempo, la impedancia eléctrica cambia en paralelo. El sistema actual comprende una placa de invasión y migración celular (CIM) de 16 pocillos con dos cámaras. El instrumento RTCA-DP (dual purpose) (llamado analizador de células de doble propósito en adelante) contiene sensores para la medición de impedancia y software integrado para analizar y procesar los datos de impedancia. Los valores de impedancia al inicio dependen de la fuerza iónica de los medios en los pocillos y se cambian a medida que las células se unen a los electrodos. Los cambios de impedancia dependen del número de células, su morfología y la medida en que las células se adhieren a los electrodos. Una medición de los pozos con medios antes de que se agreguen las células se considera como la señal de fondo. El fondo se resta de las mediciones de impedancia después de alcanzar el equilibrio con las celdas que se unen y se extienden sobre los electrodos. Un parámetro sin unidad del estado de las celdas en un electrodo denominado Índice de Celda (IC) se calcula de la siguiente manera: IC = (impedancia después del equilibrio - impedancia en ausencia de celdas) / valor de impedancia nominal⁶. Cuando se comparan las tasas de migración de diferentes líneas celulares, el Delta CI se puede utilizar para comparar el estado de la célula independientemente de la diferencia en la conexión que se representa en las primeras mediciones.

La matriz de tres cámaras de nuevo diseño se basa en el diseño existente y utiliza la cámara superior del sistema de analizador de celdas de doble propósito que contiene los electrodos. Las cámaras intermedia e inferior modificadas se adaptan para adaptar el conjunto al analizador de celdas de doble propósito para la medición y el análisis de impedancia utilizando el software integrado. Los dos principales avances que el nuevo diseño proporciona sobre la placa CIM de doble cámara existente (llamada placa analizadora celular en adelante) son: i) la capacidad de recuperarse y luego analizar las subpoblaciones celulares invasivas que están presentes en mezclas celulares heterogéneas y ii) la opción de evaluar el impacto de los factores secretados de células estromales o inmunes cocultivadas en la invasión celular (Figura 1).

Esta tecnología puede ser útil en el estudio de las subpoblaciones de células con diferentes capacidades invasivas. Eso incluye (a) células cancerosas invasivas que invaden los tejidos circundantes o vasos sanguíneos y linfáticos o extravasan en sitios de siembra metastásicos en órganos distantes, (b) células del sistema inmunitario que invaden tejidos para hacer frente a patógenos o células enfermas, (c) células endoteliales que invaden tejidos para formar nuevos vasos sanguíneos durante la reorganización de tejidos o la cicatrización de heridas, así como (d) células estromales del microambiente tumoral que soportan e invaden junto con las células cancerosas. El enfoque permite la inclusión de diafonías estromales que pueden modular la motilidad celular y la invasión. Los estudios de viabilidad que se muestran aquí utilizan esta matriz modificada centrada en la invasión de células cancerosas y la interacción con el estroma como sistema modelo, incluida la invasión endotelial en respuesta a las señales diferenciales de las células cancerosas. El enfoque se puede extrapolar para aislar células cancerosas y otros tipos de células, como subpoblaciones de células inmunes, fibroblastos o células endoteliales. Probamos líneas celulares de cáncer de mama establecidas invasivas y no invasivas como prueba de principio. También utilizamos células de invasión de xenoinjerto derivado del paciente (PDX) en respuesta a células inmunes de la médula ósea humana para mostrar la viabilidad para su uso futuro también en entornos de diagnóstico clínico. Las PDX son tejidos tumorales de pacientes que se implantan en ratones modelo inmunocomprometidos o humanizados para permitir el estudio del crecimiento, la progresión y las opciones de tratamiento para el paciente original ^7,8.

Protocolo

El estudio fue revisado y considerado como "exento" por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Georgetown (IRB # 2002-022). Los tejidos de médula ósea recién cosechados se recolectaron de filtros de recolección de médula ósea humana sanos desechados que habían sido desidentificados.

1. Nuevo diseño de cámara (Figura 2)

1. Abra una nueva placa analizadora de celdas de doble cámara. Aparta la cámara superior con electrodos.
2. Usando una fresadora, afeite 2 mm de los pocillos inferiores en forma de U de la placa analizadora de células.
3. Conecte una membrana de polietersulfona (PES) de 2 cm x 7 cm con un tamaño de poro de 0,2 μm al fondo de los pocillos afeitados con adhesivo curado con UV. Deje 30 minutos de tiempo de curación para asegurarse de que el pegamento esté completamente curado e inerte.
4. Usando una fresadora, corte dos ranuras longitudinales (1,5 mm x 5,6 mm) a lo largo de los lados para encajar en las crestas de la tercera cámara recién fabricada.
5. Utilizando una fresadora, cree una tercera cámara de policarbonato que replique las dimensiones generales de la placa analizadora de células; 72 mm x 18 mm (Tabla de Materiales).
6. Cree pozos de 4,8 mm de profundidad y 4,75 mm de diámetro para replicar el diseño de 16 pocillos de la placa analizadora de celdas. Esto permite 90 μL de volumen por pozo.
7. En los lados, cree dos crestas triangulares para que la cámara se bloquee en las rendijas originales creadas en el paso 1.4. La parte horizontal del triángulo es de 1,5 mm, la vertical es de 1,4 mm y la hipotenusa es de 2,052 mm.
8. Cree una perilla en el lado corto que tenga 50,8 mm de diámetro y 1,397 mm de altura para que quepa en la muesca de la placa original (Figura 2, Centro).
9. Use una arandela de goma de 0,9 mm de espesor para cada pozo para proporcionar un ajuste sellado.

2. Cultivo celular (MDA-MB-231, DCIS, DCIS-Δ4, J2-fibroblastos)

1. Lave los cultivos celulares adherentes (~70% de confluencia) con 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS).
2. Agregue una solución de tripsina-EDTA al 0.05% para levantar las células.
3. Neutralizar la solución de tripsina con medios de cultivo celular que contengan suero y contar las células utilizando una alícuota de la suspensión celular.
   NOTA: Los medios de cultivo celular específicos se pueden encontrar en la Tabla 1.

3. Disociación de xenoinjerto derivada del paciente

1. Picar un trozo de tumor fresco (1 cm²) en papilla fina con un bisturí estéril.
2. Colocar en un tubo cónico de 50 ml con 20 ml de medios DMEM F12 suplementados con 3 mg/ml de tripsina y 2 mg/ml de colagenasa.
3. Incubar en un agitador térmico (150 RPM) a 37 °C durante 20 min.
4. Girar el tubo a 500 x g durante 5 min; retire el sobrenadante.
5. Añadir 20 μL de DMEM F12 + 2% FBS para lavar las células; girar a 300 x g durante 5 min y retirar el sobrenadante. Repita el lavado dos veces más.
6. Resuspend en 1 mL de medios PDX (Tabla 1) para contar las celdas.

4. Extracción de células de médula ósea

1. Enjuague el filtro de recolección de médula ósea (BM) con 25 ml de 1x PBS.
   NOTA: En este estudio, pbS se agregó a un filtro de recolección de BM usado del hospital para recolectar el BM restante en el filtro.
2. Agregue el BM enjuagado lentamente a un tubo cónico de 50 ml con 25 ml de medio de gradiente de densidad, teniendo cuidado de mantener las capas lo más separadas posible.
3. Girar a 800 x g durante 20 min a 18 °C
4. Desvíe las capas superiores después de la centrifugación (grasa /plasma) y transfiera 5 ml de la capa blanca por encima del medio de gradiente de densidad que tienen las células BM a un tubo cónico de 15 ml.
   NOTA: Alternativamente, sumerja una pipeta de 5 ml en la capa superior hasta que toque la capa intermedia (BM) y saque la capa intermedia muy lentamente sin mover la pipeta.
5. Llene el tubo cónico de 15 ml con 1x PBS (~ 10 ml) y gire a 300 x g durante 15 minutos.
6. Retire el sobrenadante; el pellet blanco restante es el BM.
7. Si se observan glóbulos rojos en el pellet, agregue 5 ml de solución de lisis de glóbulos rojos (Tabla de materiales) y déjelo reposar durante 5 minutos a temperatura ambiente (RT). Girar a 300 x g durante 5 min y retirar el sobrenadante.
8. Agregue 10 ml de 1x PBS para lavar las células, gire a 300 x g durante 5 min y retire el sobrenadante. Repita la lisis de los glóbulos rojos (paso 4.7) hasta que el pellet esté blanco.

5. Siembra y ensamblaje de células

1. Coloque las tres cámaras estériles en la campana de cultivo de tejidos.
2. Ubique la perilla en el lado corto de la cámara inferior. Oriente la cámara inferior de modo que la perilla esté orientada hacia el experimentador.
3. Agregue 30,000-50,000 células en 90 μL de medios a cada pozo de la cámara inferior. Evite formar burbujas. Estas son las células estromales que proporcionarán factores secretados pero no serán detectados por los electrodos de la cámara superior.
4. Utilice medios suplementados con suero bovino fetal al 5% en dos pocillos de cámara inferior como control positivo de la motilidad celular. Use medios suplementados con suero al 0% como control negativo.
5. Deje que la cámara inferior con las celdas se asiente durante 10-15 minutos en la capucha para asentarse.
   NOTA: Este paso se recomienda si las células son adherentes o crecen en suspensión.
6. Gire la cámara inferior a 90 ° y coloque la cámara central en la parte superior para que la perilla de la cámara inferior se deslice hacia la muesca de la cámara central.
   NOTA: La perilla en la cámara inferior y el punto azul en la cámara central están en los extremos opuestos del conjunto.
7. Empuje verticalmente hacia abajo hasta que se escuche un sonido de clic desde cada uno de los lados largos del conjunto.
8. Agregue 160 μL de medios sin suero a todos los pocillos de la cámara central.
9. Asegúrese de que un menisco en forma de cúpula sea visible después de llenar los pozos; de lo contrario, ajuste el volumen final en función de la calibración de la pipeta. Evite formar burbujas.
10. Coloque la cámara superior con electrodos mirando hacia abajo en la cámara central asegurándose de alinear los puntos azules en las cámaras media y superior.
11. Empuje verticalmente hacia abajo hasta que se escuche un sonido de clic desde cada uno de los lados largos del conjunto.
12. Agregue 25-50 μL de medios sin suero a la cámara superior.
13. Monte el conjunto en el analizador celular de doble propósito en la incubadora de cultivo de tejidos y espere 30 minutos antes de medir el fondo.
    NOTA: Este tiempo es necesario para equilibrar la matriz y se puede utilizar para preparar las líneas celulares que se agregarán a la cámara superior.
14. Mida el fondo (ver sección 6) y vuelva a colocar el conjunto en la campana de cultivo de tejidos.
15. Agregue 30,000-50,000 células en 100 μL de medios sin suero a cada pocillo de la cámara superior. Estas son las células que el electrodo detectará una vez que migren con éxito a través de la membrana.
    NOTA: Para lograr la máxima respuesta, se recomienda cultivar células en medios séricos libres o bajos en suero durante 6-18 h antes de realizar el ensayo.
16. Deje reposar el conjunto en la campana durante 30 minutos antes de montarlo en el analizador de celdas de doble propósito para la medición de impedancia.

6. Medición de fondo e impedancia

1. Coloque la matriz en la base en el instrumento analizador de células de doble propósito.
2. Abra el software del analizador de células y seleccione la base que se utilizará.
3. Haga clic en la pestaña Mensaje y asegúrese de que diga Conexiones OK para asegurarse de que la matriz esté bien colocada en la base y que los electrodos estén bien alineados con los sensores.
4. Haga clic en la pestaña Notas del experimento y complete la mayor cantidad de información posible sobre el experimento.
5. Haga clic en la pestaña Diseño y complete la descripción del diseño de la matriz.
6. Haga clic en la pestaña Programar y agregue dos pasos desde el menú Pasos ; un paso de fondo (un barrido) y un paso de prueba con 100 barridos, un barrido cada 15 minutos, totalizando 25 h.
7. Después de que la matriz haya estado en la incubadora del analizador de celdas de doble propósito durante 30 minutos, haga clic en el botón Reproducir para iniciar la medición en segundo plano. Aparecerá una ventana que solicita elegir la carpeta para guardar los datos.
8. Una vez realizada la medición de fondo, retire la matriz de la base y colóquela de nuevo en la campana de cultivo celular.
9. Agregue células a la cámara superior como se describe en el paso 5.13 y mantenga el conjunto en la campana de cultivo de tejidos durante 30 minutos para que las células se asienten.
10. Vuelva a colocar la matriz en el analizador de celdas de doble propósito y compruebe la ficha Mensaje para ver el mensaje Conexiones correctas .
11. Haga clic en el botón Reproducir para iniciar la medición de impedancia.
12. Haga clic en la pestaña Trazar para monitorear el progreso de la señal.
13. Si se alcanza el punto final antes de las 25 h, haga clic en el paso Abortar del menú desplegable Ejecutar .
14. Para exportar datos, haga clic con el botón secundario en el gráfico, elija Copiar en el formato de lista y, a continuación, pegue los datos en una hoja de cálculo.
    NOTA: Los datos se pueden exportar como índice de celda o índice de celda delta. También se puede elegir información de gráfico y /o diseño para la exportación.

7. Desprendimiento y recogida de células

1. Monitoree la tasa de migración en tiempo real en el analizador de células de doble propósito para determinar el punto de parada de interés (6-18 h).
   NOTA: El punto de parada depende de la tasa de invasión de la célula y cuando se logra una señal de invasión distinta del control negativo.
2. Una vez logrado, desmonte el conjunto del analizador celular de doble propósito y colóquelo en la campana de cultivo de tejidos.
3. Prepare un número apropiado de tubos de microcentrífuga de 1,5 ml para recoger las células de los pozos de interés.
4. Coloque el conjunto en un plato de 10 cm para que contenga líquidos cuando las cámaras se desprendan.
5. Empuje los extremos flexibles de ajuste en el lado largo de la cámara central hacia adentro hasta que se escuche un sonido de clic.
6. Desmonta la cámara superior e invierta en un nuevo plato de 10 cm.
7. Use un elevador de células con una cuchilla de 13 mm para recolectar las células de todos los pozos que albergan la misma condición experimental (es decir, tipo de célula, tratamiento farmacológico, etc.).
   NOTA: Diseñe la configuración para que tenga al menos dos pozos para cada condición experimental para lograr un cambio estadísticamente significativo de los controles negativos.
8. Enjuague o sumerja la cuchilla en solución salina tamponada con 1x fosfato para recolectar las células en tubos de microcentrífuga de 1.5 ml.
9. Girar hacia abajo las células a 500 x g durante 5 min.
10. Propagar las células recogidas (ver sección 8) o realizar análisis de punto final como RNA-seq unicelular.
    NOTA: Para el ARN-seq a granel, use un kit de extracción de ARN de bajo número celular.

8.3D propagación y recuperación celular

NOTA: Debido al pequeño número de células recolectadas, sembra las células en 3D utilizando una matriz extracelular (ECM) para mejorar la viabilidad. Dicho esto, el cultivo 2D también es una opción en este punto, especialmente si las células utilizadas son de líneas celulares establecidas.

1. Descongelar una alícuota de la matriz de la membrana basal a 4 °C durante la noche. Mantenga la matriz de la membrana basal en hielo hasta que esté lista para usar.
2. Agregue 25 μL de matriz de membrana basal fría a la bolita de células vivas recolectadas y pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo para mezclar. Evite formar burbujas.
3. Agregue la mezcla de matriz de membrana celular-basal al fondo de un pequeño pozo de cultivo de tejidos (es decir, en una placa de 96 pocillos), formando una cúpula. Trate de no tocar las paredes del pozo. Incubar a 37 °C durante 20 min antes de añadir suavemente 100 μL de medios gota a gota.
4. Para recuperar las células, aspire el medio y agregue 100 μL de dispasa a cada pozo.
5. Incubar en RT durante 10 min, pipeteando hacia arriba y hacia abajo ocasionalmente.
6. Transfiera las células y la matriz de membrana basal disuelta a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Agregue 1 ml de 1x PBS, gire a 300 x g durante 5 min y retire el sobrenadante. Repita el lavado una vez.
7. Aspirar el sobrenadante. Divida las células en el pellet o realice un análisis de punto final.

Resultados

Utilizando la matriz de tres cámaras de nuevo diseño, la invasión de las células se probó en presencia o ausencia de células estromales como los fibroblastos. La invasión celular MDA-MB-231 se mejoró cuando se sembraron fibroblastos suizos 3T3 irradiados (cepa J2) en la cámara inferior, lo que permitió el intercambio de factores entre las dos líneas celulares. Curiosamente, la invasión de MDA-MB-231 aumentó cuando las células 3T3-J2 se duplicaron en número (Figura 3A). Por otr...

Discusión

Hemos modificado el diseño de una matriz de doble cámara para incluir una tercera cámara para monitorear la invasión celular en tiempo real en presencia de células estromales. Hemos observado distintos efectos de los fibroblastos cocultivados en células cancerosas invasivas y no invasivas, lo que indica que la matriz se puede utilizar para distinguir entre subpoblaciones de células cancerosas que responden de manera diferente a los factores producidos por las células estromales cocultivadas. La matriz también se...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin-EDTA	Thermofisher	25300-054
Adhesive	Norland Optical Adhesive	NOA63
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma	A9418
Cell lifter	Sarstedt	83.1832
Cholera Toxin from Vibrio cholerae	Thermofisher	12585-014
CIM-plate	Agilent	5665817001	Cell analyzer plate
Collagenase from Clostridium histolyticum	Sigma	C0130
Dispase	StemCell	7913
DMEM	Thermofisher	11995-065
DMEM-F12	Thermofisher	11875-093
Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated	Omega Scientific	FB-12
HEPES	Thermofisher	15630106
Horse serum (HS)	Gibco	16050-122
Human EGF	Peprotech	AF-100-15
Human umbilical Vein endothelail cells (HUVEC)	LONZA (RRID:CVCL_2959)	C-2517A
HUVEC media	LONZA	CC-3162
Hydrocortisone	Sigma	H4001
Insulin Transferrin Selenium Ethanolamine (ITSX) (100x)	Thermofisher	51500056
Insulin, Human Recombinant, Zinc Solution	Sigma	C8052
J2 Fibroblasts	Stemcell (RRID:CVCL_W667)	100-0353
LymphoPrep	Stemcell	7851	Density gradient medium for the isolation of mononuclear cells
Matrigel	Corning	354230	Basement membrane matrix
MCFDCIS.com cells ( DCIS)	RRID:CVCL_5552
MDA-MB-231 cells	RRID:CVCL_0062
Milling machine			Bridgeport Series 1 Vertical
Phosphate-buffered saline (1x)	Thermofisher	10010049
Polyethersulfone (PES) membrane	Sterlitech	PCTF029030
RBC lysis solution	Stemcell	7800
RNeasy Micro Kit	Qiagen	74004
RTCA DP analyzer	Agilent	3X16	Dual purpose cell analyzer
Trypsin	Sigma	T4799