Microscopía de fuerza atómica para estudiar las propiedades físicas de las células epidérmicas de raíces vivas de Arabidopsis

Resumen

El protocolo de indentación de microscopía de fuerza atómica ofrece la posibilidad de diseccionar el papel de las propiedades físicas de la pared celular de una célula particular de un tejido u órgano durante el crecimiento normal o restringido (es decir, bajo déficit de agua).

Resumen

Aquí se describe un método para caracterizar las propiedades físicas de la pared celular de las células epidérmicas de raíces vivas de Arabidopsis a través de nanoindentaciones con un microscopio de fuerza atómica (AFM) junto con un microscopio óptico de fluorescencia invertida. El método consiste en aplicar fuerzas controladas a la muestra mientras se mide su deformación, permitiendo cuantificar parámetros como el aparente módulo de Young de las paredes celulares a resoluciones subcelulares. Requiere una cuidadosa inmovilización mecánica de la muestra y una correcta selección de penetradores y profundidades de hendidura. Aunque solo se puede usar en tejidos externos, este método permite caracterizar los cambios mecánicos en las paredes celulares de las plantas durante el desarrollo y permite la correlación de estos cambios microscópicos con el crecimiento de un órgano completo.

Introducción

Las células vegetales están rodeadas por una pared celular que es una estructura compleja compuesta de redes interactivas de polisacáridos, proteínas, metabolitos y agua que varía en grosor de 0,1 a varios μm dependiendo del tipo de célula y la fase de crecimiento ^1,2. Las propiedades mecánicas de la pared celular juegan un papel esencial en el crecimiento de las plantas. Los bajos valores de rigidez de la pared celular se han propuesto como una condición previa para el crecimiento celular y la expansión de la pared celular, y cada vez hay más pruebas de que todas las células detectan fuerzas mecánicas para re....

Protocolo

1. Preparación del material vegetal y condiciones de crecimiento

1. Para generar el material vegetal necesario, esterilice las semillas de tipo salvaje Arabidopsis y líneas mutantes de interés.
   NOTA: En este protocolo, utilizamos lo siguiente: ttl1: líneas de inserción de ADN-T Salk_063943 (para TTL1; AT1G53300) - Columbia-0 (Col-0) tipo salvaje; el mutante Procuste1 (prc1-1), que consiste en una mutación knock-out (Q720stop) en el gen CESA6 (AT5G64740), como se describió previamente en^10,11; y TTL1 x PRC1-1 doble mutante.
   1. ....

Resultados

Experimentos de forzamiento-sangría
El siguiente texto presenta algunos resultados esperados cuando se realiza un experimento de sangría forzada para mostrar la salida típica que se espera cuando el protocolo está bien ejecutado.

Curvas fuerza-desplazamiento
En la Figura 2 se presentan gráficas representativas de indentación de fuerza que se obtuvieron sangrando de muestras vivas en una posición colocada en el centro .......

Discusión

La mecánica celular y de pared celular se está volviendo cada vez más relevante para obtener información sobre cómo la mecánica afecta los procesos de crecimiento. A medida que las fuerzas físicas se propagan a distancias considerables en los tejidos sólidos, el estudio de los cambios en las propiedades físicas de la pared celular y cómo se detectan, controlan, sintonizan e impactan el crecimiento de la planta se están convirtiendo en un importante campo de estudio

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 x Phosphate-Buffered Saline (PBS)			Include sodium chloride and phosphate buffer and is formulated to prevent osmotic shock and maintain water balance in living cells.
AFM software	Bruker, Billerica, MA, USA
Atomic force microscopy (AFM)	BioScope Catalyst, Bruker, Billerica, MA, USA
Catalyst Probe holder-fluid	Bruker, Billerica, MA, USA	CAT-FCH	A probe holder for the Bioscope Catalyst, designed for fluid operation in contact or Tapping Mode.  Also compatible with air operation.
Cryoscopic osmometer; model OSMOMAT 030	Gonotech, Berlin, Germany
Murashige & Skoog Medium	Duchess Biochemie	M0221	Original concentration, (1962)
Optical inverted microscope coupled to the AFM	Olympus IX81, Miami, FL, USA
PEGAMIL	ANAEROBICOS S.R.L., Buenos Aires, Argentina	100429	Neutral, non acidic silicone glue
Petri dishes	Deltalab	200201.B	Polystyrene, 55 x 14 mm, radiation sterile.
Propidium iodide	Sigma	P4170	For root viability test.
Silicon nitride probe, DNP-10, cantilever A	Bruker, Billerica, MA, USA	DNP-10/A	For force modulation microscopy in liquid operation. Probe tip radius of 20-60 nm. 175-μm-long triangular cantilever,  with a spring constant of 0.35 N/m.
Tweezers	Sigma	T4537