Un enfoque de ensayo cometario de alto rendimiento para evaluar el daño del ADN celular

Resumen

El ensayo del cometa es un medio popular para detectar daños en el ADN. Este estudio describe un enfoque para ejecutar diapositivas en variantes representativas del ensayo de cometas. Este enfoque aumentó significativamente el número de muestras al tiempo que disminuyó el tiempo de ejecución del ensayo, el número de manipulaciones de portaobjetos y el riesgo de daño a los geles.

Resumen

Las células están continuamente expuestas a agentes que surgen de los ambientes internos y externos, que pueden dañar el ADN. Este daño puede causar una función celular aberrante y, por lo tanto, el daño del ADN puede desempeñar un papel crítico en el desarrollo de, posiblemente, todas las principales enfermedades humanas, por ejemplo, cáncer, enfermedades neurodegenerativas y cardiovasculares y envejecimiento. La electroforesis en gel unicelular (es decir, el ensayo del cometa) es uno de los métodos más comunes y sensibles para estudiar la formación y reparación de una amplia gama de tipos de daño en el ADN (por ejemplo, roturas de cadena simple y doble, sitios álcali-lábiles, enlaces cruzados ADN-ADN y, en combinación con ciertas enzimas de reparación, purinas oxidadas y pirimidinas), tanto in vitro como in vivo . Sistemas. Sin embargo, el bajo rendimiento de la muestra del ensayo convencional y el laborioso análisis de la muestra son factores limitantes para su aplicación más amplia posible. Con la "puntuación" de los cometas cada vez más automatizada, la limitación es ahora la capacidad de procesar un número significativo de diapositivas de cometas. Aquí, se ha desarrollado una variante de alto rendimiento (HTP) del ensayo de cometas (ensayo de cometa HTP), que aumenta significativamente el número de muestras analizadas, disminuye el tiempo de ejecución del ensayo, el número de manipulaciones de portaobjetos individuales, los requisitos de reactivos y el riesgo de daño físico a los geles. Además, la huella del tanque de electroforesis disminuye significativamente debido a la orientación vertical de las guías y la refrigeración integral. También se informa aquí un enfoque novedoso para enfriar las diapositivas de ensayo de cometas, que facilita de manera conveniente y eficiente la solidificación de los geles del cometa. Aquí, se ha descrito la aplicación de estos dispositivos a métodos representativos de ensayo de cometas. Estas simples innovaciones apoyan en gran medida el uso del ensayo cometa y su aplicación a áreas de estudio como la biología de la exposición, la ecotoxicología, el biomonitoreo, la detección / prueba de toxicidad, junto con la comprensión de la patogénesis.

Introducción

Las células están expuestas continuamente a agentes que surgen de los ambientes internos y externos, que pueden dañar el ADN ^1,2. Este daño puede causar una función celular aberrante³, y por lo tanto el daño del ADN puede desempeñar un papel crítico en el desarrollo de muchas enfermedades humanas importantes, por ejemplo, cáncer, enfermedades neurodegenerativas y cardiovasculares, y envejecimiento⁴. El ensayo cometa (también llamado electroforesis en gel unicelular) es un método cada vez más popular para detectar y cuantificar el daño del ADN celular.

En su forma más simple, el ensayo de cometas alcalinos (ACA) detecta roturas de hebras (SB; tanto simples como dobles), junto con sitios apurinicos/apirimidínicos y sitios alcalinos lábiles (ALS), los cuales se convierten en roturas de una sola hebra en condiciones alcalinas⁵. El ensayo cometa de pH neutro puede evaluar roturas francas de una y dos hebras⁶. Además, el ACA, en combinación con varias enzimas de reparación del ADN, puede detectar una gama considerable de tipos de daño en el ADN, por ejemplo, purinas oxidadas (identificadas por el uso de glicosilasa de ADN 8-oxoguanina humana 1; hOGG1⁷); pirimidinas oxidadas (usando endonucleasa III; EndoIII) y dímeros de pirimidina ciclobutano (utilizando endonucleasa T4 V; T4endoV)⁸. El ensayo cometa también se puede utilizar para evaluar lesiones de ADN inducidas por agentes de reticulación, como cisplatino 9,10,11. Como lo indica el nombre formal del ensayo, es decir, electroforesis en gel de una sola célula, el ensayo se basa en que las células bajo análisis son una suspensión de una sola célula; Más comúnmente, estas son células cultivadas, pero pueden aislarse de sangre total 12,13, o se puede usar sangre entera^14,15. Alternativamente, se puede generar una suspensión de una sola célula a partir de tejidos sólidos.

Aparte de algunas excepciones, sobre todo los informes CometChip del laboratorio Engleward 16, el protocolo general de ensayo de cometas no ha cambiado drásticamente desde el descrito originalmente por los inventores del ensayo (Östling y Johansson¹⁷ y Singh et^al.18). El ensayo cometario implica numerosos pasos (Figura 1). Muchos de estos pasos implican la transferencia de los geles delgados de agarosa que contienen células, una diapositiva a la vez y, por lo tanto, representan un riesgo de daño o pérdida del gel, poniendo en peligro el éxito del experimento. En consecuencia, el ensayo del cometa puede llevar mucho tiempo, especialmente si se está ejecutando un número significativo de diapositivas. Por lo general, un máximo de 40 portaobjetos se ejecutan en un tanque de electroforesis grande (33 cm x 59 cm x 9 cm), que se encuentra dentro de una bandeja aún más grande que contiene hielo húmedo para enfriar. Recientemente se ha informado que el tiempo de ejecución del ensayo se puede acortar a 1 día disminuyendo la duración de la etapa de lisis y no secando los portaobjetos antes de teñir¹⁹.

Los autores actuales han informado previamente de un enfoque novedoso para el ensayo de cometas alcalinas de alto rendimiento (HTP ACA), en el que múltiples (lotes de 25) portaobjetos de microscopio de ensayo de cometas pueden manipularse simultáneamente durante todo el proceso de ensayo de cometas^20,21,22. Este enfoque patentado minimiza el riesgo de daño o pérdida de los geles que contienen muestras al eliminar la necesidad de manipular los portaobjetos del microscopio individualmente y se puede aplicar a todas las variantes del ensayo de cometa, que utilizan portaobjetos de microscopio. Las rejillas que contienen portaobjetos protegen los geles durante las manipulaciones y, en consecuencia, el procesamiento de la muestra es más rápido y eficiente. Las guías también pueden someterse a electroforesis en los bastidores, mantenidos en la orientación vertical, en lugar de horizontal. Esto, y el enfriamiento integral, disminuyen significativamente la huella del tanque de electroforesis y eliminan la necesidad de hielo húmedo. En conjunto, esto representa una mejora significativa con respecto al procedimiento convencional. El equipo utilizado se ilustra en la Figura 2. Los protocolos descritos aquí, utilizando este nuevo enfoque, demuestran la aplicación representativa a células cultivadas y sangre entera¹⁴ para la detección de sitios álcali-lábiles (ELA), enlaces cruzados entre cadenas de ADN (ICL) y los sustratos de varias enzimas de reparación del ADN.

Protocolo

En el presente estudio se utilizaron muestras de sangre disponibles comercialmente. En nuestra institución, la aprobación de la Junta de Revisión Institucional no es necesaria para el uso de sangre disponible comercialmente.

1. Preparación de materiales para el ensayo cometario

1. Preparación de los portaobjetos del microscopio
   1. Verter agarosa de punto de fusión normal al 1% (p/v) [disuelta en agua de doble destilación (_ddH2O)] en un tubo de 50 ml y microondas para disolver la agarosa en el_ddH2O. Almacenar a 37 °C para evitar la solidificación antes de recubrir los portaobjetos. En caso de solidificación, deseche y prepare fresco.
   2. Pre-recubrimiento de portaobjetos de microscopio sumergiendo los portaobjetos en el tubo de 50 ml que contiene 1% (p/v) de agarosa de punto de fusión normal.
   3. Limpie la parte posterior de las diapositivas rápidamente después de sumergirlas.
      NOTA: Si no se limpia correctamente la parte posterior de las diapositivas, aumentará el ruido de fondo de las diapositivas durante el paso de análisis con microscopio.
   4. Etiquete la diapositiva recubierta con un marcador permanente en la esquina inferior derecha de la sección esmerilada (Figura 3A). Esto muestra qué lado de la diapositiva está pre-recubierto.
   5. Deje que la agarosa se asiente y se seque durante la noche a temperatura ambiente.
   6. Envuelva los portaobjetos secos en papel de seda y guárdelos en una caja.

2. Preparación de las muestras

1. Células cultivadas
   NOTA: En primer lugar, trate las células con los agentes dañinos antes de comenzar el ensayo del cometa. A continuación, realice lo siguiente.
   1. Si las células son adherentes, tripsinizar las células para liberarlas del matraz de cultivo celular o placas de Petri de cultivo celular, en la confluencia adecuada de células. Neutralice la tripsina agregando medios que contengan suero.
   2. Transfiera las células a un tubo de 50 ml, centrifugar (por ejemplo, para HaCaTs, centrifugar a 300 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente), retire suavemente el sobrenadante y agregue 1 ml de PBS al pellet celular.
   3. Realizar el recuento de celdas.
   4. Transfiera 30.000 células a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y centrifugadora a 7.607 x g durante 5 minutos a 4 °C.
   5. Retire suavemente el sobrenadante y guarde la bolita celular en hielo en la oscuridad antes de realizar el ensayo del cometa.
      NOTA: Las células deben ser analizadas regularmente para detectar contaminación por micoplasma antes de realizar el ensayo cometa para prevenir, entre otros efectos, la formación de daño artefactual en el ADN y la respuesta alterada al daño del ADN, como se informó en otra parte²³. Las condiciones de centrifugación pueden cambiarse, según sea necesario, dependiendo del tipo de célula utilizada.
2. Preparación de células cultivadas para el ensayo de reparación
   1. Cultivo de células en el matraz de cultivo celular o placas de Petri.
   2. Lave las células con 1 ml de PBS dos veces antes de tratar las células con agentes dañinos (por ejemplo, para las células BE-M17, tratar con 50 μM de_H2O2durante 20 min) en hielo para evitar que la reparación ocurra durante el tratamiento.
   3. Lave las células suavemente con 1 ml de PBS dos veces para eliminar cualquier agente dañino residual.
   4. Vuelva a introducir el medio de cultivo celular y permita que las células se reparan durante duraciones variables (por ejemplo, 0 min, 30 min, 2 h, 6 h, 24 h y 30 h) en una incubadora humidificada (37 °C, 5% de_CO2).
   5. En cada punto de tiempo, recolectar 30,000 células en un medio de cultivo celular que contiene 10% de dimetilsulfóxido (DMSO) y almacenarlas a -80 ° C.
   6. Antes de realizar el ensayo del cometa, descongelar las células rápidamente a 37 °C en un baño maría y centrifugarlas a 7.607 x g durante 5 min a 4 °C.
   7. Retire el sobrenadante y almacene la bolita celular en hielo antes de realizar el ensayo (es decir, a partir del paso 3).
3. Preparación de sangre total
   NOTA: El siguiente método se beneficia de (i) ser un enfoque mínimamente invasivo para obtener una muestra de sangre, (ii) no requerir el aislamiento de PBMC antes del ensayo cometa, y (iii) permitir que las muestras de sangre (con un volumen < 250 μL) se almacenen a -80 °C, hasta 1 mes (aunque la evidencia más reciente sugiere que es posible un almacenamiento más prolongado), sin necesidad de crioconservantes, y sin riesgo ni formación de daños artefactuales¹⁴. La aprobación ética, o equivalente, puede ser necesaria antes de obtener muestras de sangre de pacientes o animales. Alternativamente, se pueden utilizar muestras de sangre disponibles comercialmente como en el presente estudio. En nuestra institución, la aprobación de la Junta de Revisión Institucional no es necesaria para el uso de sangre disponible comercialmente.
   1. Con una pipeta, transfiera muestras de sangre entera (<250 μL) (tabla de materiales) a un tubo de recolección que contenga un volumen mínimo que contenga 0,4 mg de EDTA (por 250 μL de sangre).
   2. Congelar las muestras de sangre a -80 °C antes de realizar el ensayo del cometa HTP.
   3. Descongele las muestras de sangre almacenadas (<250 μL) a temperatura ambiente, sin calentar.
   4. Transfiera 5 μL de sangre entera a tubos de microcentrífuga antes de realizar el ensayo cometa (ver paso 3).

3. Lisis celular

NOTA: Realice todos los procedimientos en hielo.

1. Use 12,000 células o 2.5 μL de sangre total por gel.
2. Preparar agarosa de bajo punto de fusión al 0,6% (p/v) disuelta en PBS usando un microondas, y colocar en un baño maría a 37 °C para evitar que se solidifique.
3. Etiquete el extremo esmerilado de las diapositivas prerecubiertas con el nombre, la fecha y la información del tratamiento del investigador con un marcador o lápiz permanente.
4. Coloque una placa de enfriamiento en un banco plano e inserte los dos paquetes de enfriamiento congelados en el cajón deslizante debajo de la superficie metálica (como se muestra en la Figura 4)²¹.
5. Coloque los portaobjetos en la placa de enfriamiento y deje que los portaobjetos se enfríen previamente durante 1-2 minutos antes de agregar las celdas que contienen agarosa de bajo punto de fusión al 0,6% (p/v) (paso 3.7).
   NOTA: Dejar los portaobjetos en la placa de enfriamiento durante más de 1-2 minutos puede causar condensación en la superficie del portaobjetos debido a la humedad ambiental. Esto puede hacer que los geles de agarosa de bajo punto de fusión sean menos estables en los portaobjetos.
6. Dispersar el pellet (paso 2.2.7) mediante vórtice. Asegúrese de que todo el sobrenadante se ha retirado del pellet. Coloque los tubos de muestra (que contienen las células granuladas) inmediatamente sobre hielo.
   NOTA: Al colocar los tubos que contienen muestras en la centrífuga, colóquelos con la bisagra hacia afuera para que el pellet se recoja en este lado del tubo. A veces es difícil ver el pellet, y es fácil desalojarlo mientras se retira el sobrenadante. La centrifugación con la tapa del tubo en esta orientación permitirá saber dónde estará el pellet de la celda.
7. Resuspender el pellet celular con 200 μL de agarosa de bajo punto de fusión al 0,6% (agarosa LMP) y mezclar pipeteando hacia arriba y hacia abajo sin crear burbujas. A continuación, transfiera rápidamente 80 μL de células que contienen agarosa LMP a un portaobjetos refrigerado y coloque rápidamente un cubreobjetos sobre el gel.
8. Deje que el gel se asiente en la placa de enfriamiento durante 1-2 minutos.
9. Mientras tanto, prepare una solución de trabajo de 500 ml de tampón de lisis (Tabla 1) y viértala en la placa de lisis (Figura 2).
10. Una vez que se hayan establecido los geles, retire los cubreobjetos rápidamente sosteniendo suavemente el portaobjetos entre el pulgar y el índice y deslizando el cubreobjetos fuera del gel.
11. Coloque las diapositivas que contienen muestras dentro del portaportaobjetos (todas las marcas negras de "puntos" en las diapositivas deben estar orientadas en la misma dirección cuando se colocan en un portador) (Figura 3B) y luego coloque el portadiapositivas dentro de la placa de lisis (Figura 2).
12. Cierre la tapa de la placa de lisis y mantenga la placa de lisis en la nevera durante la noche a 4 °C o 30 min a temperatura ambiente, lo que mejor se adapte al horario¹⁹ del operador.

4. Electroforesis

1. Retire con cuidado el portaobjetos de la placa de lisis. Tenga cuidado de no alterar los geles.
2. Coloque suavemente el portaportaobjetos en un plato de lavado precargado con ddH 2 Ohelado y déjelo durante 30 minutos asegurándose de que los portaobjetos estén completamente cubiertos con ddH₂O.
3. Inserte un paquete de enfriamiento congelado dentro del cajón deslizante debajo del tanque de electroforesis para mantener una temperatura de amortiguación óptima.
4. Agregue cuidadosamente la solución de trabajo de electroforesis helada (Tabla 1) al tanque de electroforesis y transfiera el portador de la corredera al tanque de electroforesis. Oriente los portaobjetos de tal manera que sus partes transparentes con los geles que contienen células (es decir, NO los extremos esmerilados/etiquetados) apunten hacia el cátodo (electrodo rojo).
5. Deje que los portaobjetos se asienten en el tanque de electroforesis durante 20 minutos para que el ADN se relaje y se relaje. Mantenga la fuente de alimentación apagada durante este paso.
6. Si es necesario, inserte un nuevo paquete de enfriamiento congelado para maximizar el enfriamiento.
7. Realice electroforesis durante 20 min a 1,19 V/cm, o cualquier condición que se haya optimizado.
   NOTA: Se recomienda la optimización de las condiciones de funcionamiento de la electroforesis y el volumen de tampón para cada laboratorio²⁴. El uso de un solo portador de portaobjetos durante la electroforesis no causa ningún efecto de los portaobjetos sobre la resistencia del tampón de electroforesis, y los autores no vieron un efecto significativo en el voltaje o la corriente cuando cambió el número de portaobjetos.
8. Apague la fuente de alimentación, retire con cuidado el portaobjetos del tanque de electroforesis y deje que drene en papel de seda durante 30 s.
9. Coloque el portaportaobjetos en el plato que contiene el tampón de neutralización (Tabla 1). Déjalo durante 20 min.
10. Retire el portaportaobjetos de la placa de neutralización, colóquelo en la fuente de lavado que contiene ddH₂O helado y déjelo durante 20 minutos.
11. Retire el portaportaobjetos del agua y deje que los portaobjetos se sequen en una incubadora a 37 °C durante 1 h, o a temperatura ambiente durante la noche, o no se sequen, dependiendo del horario del operador¹⁹.
    NOTA: Si no hay secado en el paso 4.11, realice el paso de tinción de 5.2.

5. Tinción de yoduro de propidio (PI)

1. Transfiera el portaportaobjetos a una fuente de lavado que contenga_ddH2Ohelada para rehidratar los portaobjetos y déjelo durante 30 minutos.
2. Coloque el portaportaobjetos en una fuente de tinción que contenga 2,5 μg/ml de solución de yoduro de propidio.
   NOTA: El yoduro de propidio es sensible a la luz, así que manéjelo en un área oscura. También es tóxico.
3. Cierre la tapa del plato de tinción e incube durante 20 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente.
4. Transfiera el portaportaobjetos a un plato separado y lávelo con ddH₂O helado durante 20 minutos.
5. Retire el portaportaobjetos del plato y séquelo completamente en la oscuridad, ya sea en una incubadora a 37 °C o a temperatura ambiente, según el horario o la preferencia del operador.
6. Una vez que las diapositivas estén completamente secas, retírelas del portadiapositivas y guárdelas en una caja de diapositivas en la oscuridad hasta que estén listas para el análisis de imágenes.
   NOTA: Las diapositivas permanecerán legibles indefinidamente y se pueden volver a teñir si es necesario.

6. Ensayo de cometa alcalino modificado enzimático

NOTA: El ensayo de cometa alcalino modificado por enzimas emplea un paso de tratamiento enzimático después de la lisis pero antes de la electroforesis. La actividad de la enzima causa roturas en el ADN en sitios que son sustratos para la enzima. Antes de realizar este ensayo, se debe optimizar la concentración de enzimas y la duración de la incubación de enzimas.

1. Después de la lisis celular (paso 3), lavar los portaobjetos dos veces con ddH₂O helado durante 20 minutos cada una.
2. Retire el portatoboganes del agua y transfiera los portaobjetos a una bandeja forrada con toallas de papel.
3. Añadir 80 μL de la enzima a la concentración optimizada (por ejemplo, 3,2 U/ml de hOGG1 para células BE-M17, diluido en tampón de reacción enzimática) y cubrir con un cubreobjetos para esparcir la enzima sobre la muestra que contiene gel.
4. Incubar los portaobjetos a 37 °C durante la duración optimizada (por ejemplo, 45 min para hOGG1).
5. Después de la incubación, retire los cubreobjetos suavemente y transfiera los portaobjetos al portador.
   NOTA: No lave los portaobjetos después del tratamiento enzimático; Realice directamente la electroforesis desde el paso 4.3.

7. Ensayo de cometa alcalino modificado con enlaces cruzados entre cadenas de ADN (ICL)

NOTA: El concepto de esta variante de la ICL-ACA es que la presencia de ICL en el ADN retardará la migración electroforética del ADN dañado, inducida después de la exposición a un insulto generado oxidativamente. En este caso, cuanto más corta es la cola del cometa, mayor es el número de ICL^25,26,27,28.

1. Tratar las células con un reactivo que induce ICL (por ejemplo, cisplatino; consulte el Archivo complementario).
2. Exponga las células tratadas con uno de los siguientes agentes para inducir suficientes roturas de hebras para crear una cola de cometa del tamaño adecuado (~ 20% de ADN de cola): peróxido de hidrógeno (50 μM H 2 O 2 durante 30 min), radiación ionizante (2-5 Gy) o ultravioleta B (UVB) (0.5 J / cm₂).
3. Además, producir un control positivo de ruptura de hebra tratando un lote de células con el mismo agente y dosis, como se usa en el paso 7.2 (es decir, ningún tratamiento con agente inductor de ICL).
4. Centrifugar las células a 7,607 x g durante 5 min, desechar el sobrenadante, lavar el pellet celular tres veces con 1 ml de PBS y procesar como para el ensayo de cometa alcalino (pasos 3-5).
5. Calcule los niveles de reticulación entre cadenas de ADN utilizando la siguiente fórmula.
   
   NOTA: MOTM (Mean Olive Tail Moment) es un punto final de ensayo de cometa ampliamente utilizado para describir el ensayo de cometa modificado con ICL, y se define como el producto de la longitud de la cola y la fracción de ADN total en la cola (es decir, momento de cola = longitud de la cola x % de ADN en la cola)²⁹; TMdi: momento de cola de las muestras tratadas con agente de reticulación y_H2O2(u otro inductor rompedor de hebras); TMcu: momento de cola de muestras no tratadas con un agente de reticulación y no tratadas con H2O2 (sin tratamiento), y TMci: momento de cola de muestras no tratadas con un agente de reticulación pero tratadas con_H2O2.

8. Puntuación de cometas y análisis de datos

NOTA: El término "cometa" deriva de las imágenes de las células dañadas cuando se observan bajo un microscopio después de que se ha realizado el ensayo (Figura 5). En condiciones de electroforesis, el ADN en las células no dañadas en gran medida no migra, sino que permanece en un esferoide denominado "cabeza" de cometa. Sin embargo, la presencia de roturas de hebras permite que el ADN de la célula migre fuera de la cabeza y forme una "cola", lo que lleva a una apariencia como un cometa (Figura 5). Cuanto más ADN hay en la cola, más daño está presente.

1. Encienda el microscopio de fluorescencia con el filtro PI (rojo) (λ = 536/617 nm) y el software de puntuación del ensayo de cometas.
2. Agregue una gota de agua con una pipeta Pasteur al gel y cúbrala con un cubreobjetos.
3. Coloque los portaobjetos en el microscopio de fluorescencia y "puntúe" los cometas.
   NOTA: La puntuación es un medio por el cual se evalúan los cometas, para determinar la cantidad de daño presente en cada cometa. En términos generales, esto se puede lograr mediante el uso de dos enfoques, de acuerdo con la preferencia elegida por el usuario, ya sea a simple vista (midiendo el tamaño de los cometas en una escala de cero a cuatro) o utilizando software libre o disponible comercialmente³⁰. En general, ambos enfoques evalúan el tamaño de la cola del cometa, aunque se puede determinar una variedad de puntos finales relacionados con el cometa. Si utiliza el software, haga clic en el centro de la cabeza del cometa y espere hasta que el software detecte el cometa automáticamente, y luego evalúe el punto final elegido (Figura 5).
4. Puntúe 50 cometas por gel y 100 cometas por muestra (es decir, cada muestra corresponde a diferentes tratamientos dañinos para el ADN o sus réplicas).
5. Replicar los experimentos (n = 2) o triplicar los experimentos (n = 3).
   NOTA: Si sólo se realizan n = 2 experimentos de replicación, no se puede realizar un análisis estadístico, pero si n = 3, se realiza la prueba de normalidad de D'agostino. La mayoría de los datos de ensayos de cometas no pasan una prueba de normalidad. En este caso, use una prueba no paramétrica (prueba de Kruskal-Wallis con la prueba de comparaciones múltiples de Dunn, y la significación de las pruebas de Mann-Whitney establecida en p < 0.05).

Resultados

Optimización del voltaje de electroforesis para el HTP ACA
Queratinocitos humanos (HaCaTs; Tabla de materiales) fueron irradiados con diferentes dosis de radiación ultravioleta A (UVA) (5 o 10 J/cm²; Figura 6A), UVB (0,5 o 1 J/cm²; Figura 6B), o tratados con 50 μM_H2O2(Figura 6C) para inducir daño. Se probaron tres voltajes diferentes de la electroforesis para determinar el voltaje óptimo para la electroforesis. Los resultados de los tres tratamientos que dañan el ADN revelaron que, si bien todos los voltajes generaron dosis-respuestas lineales, la respuesta más sensible se obtuvo con 1,19 V / cm. HaCaTs mostró el daño basal más alto en el ADN usando 1.19 V / cm durante la electroforesis en comparación con 1 V / cm y 1.09 V / cm (Figura 6A-C). Además, utilizando 1,19 V/cm, se observa el mayor % de ADN de la cola, después de todos los tratamientos dañinos (Figura 6)³¹.

Detección de daño en el ADN en sangre entera humana usando Fpg modificado HTP ACA
La sangre de sujeción humana (Tabla de materiales) se irradió con diferentes dosis de 10 J / cm² UVA para inducir daño. Se utilizaron cuatro concentraciones diferentes de Fpg (1, 2, 4 u 8 U/mL) para determinar la concentración óptima para el tratamiento enzimático en HTP ACA. Los resultados mostraron que los niveles óptimos de daño en el ADN se revelaron con 4 U/mL Fpg (Figura 7A). Imágenes representativas de cometas a partir de muestras de sangre irradiadas por UVA (Figura 7B).

Detección de ADN ICL en una línea celular representativa de cáncer de ovario utilizando el HTP ACA modificado con ICL
Una línea celular de cáncer de ovario (SKOV-3; Tabla de materiales) se trató con combinaciones de cisplatino de 200 μM y/o tratamiento posterior con 50 μM_H2O2durante 30 min en hielo. No se observó ningún daño apreciable en las células no expuestas (Figura 8A). La exposición a_H2O2por sí sola generó un MOTM significativo (Figura 8B). En contraste, las células en las que se indujo ICL mostraron una disminución de MOTM (Figura 8C)²⁸.

Formación y reparación de ICL de ADN inducida por cisplatino en una línea celular representativa de cáncer de ovario
El HTP ACA modificado con ICL se utilizó para determinar el curso temporal para la formación y reparación de ICL de ADN inducida por cisplatino en una línea celular de cáncer de ovario (A2780; Tabla de materiales). Las células se trataron con cisplatino de 100 μM durante 1 h, y luego se incubaron en medios libres de cisplatino (RPMI 1640 medio suplementado con suero bovino fetal (FBS) al 10% (v / v)) para un curso de tiempo posterior. En varios puntos temporales, se realizó el ACA HTP modificado con ICL para establecer los niveles de ICL (Figura 9)²⁸. No se detectaron ICL antes del tratamiento con cisplatino. Sin embargo, después de un solo tratamiento con cisplatino de 100 μM, los niveles de ICL aumentaron significativamente, alcanzando un máximo a las 12 h, después de lo cual los niveles disminuyeron de nuevo a cero después de 30 h.

Correlación entre los niveles de ADN ICL y ADN platino
Tres células de cáncer de ovario fueron tratadas con cisplatino de 100 μM para inducir diferentes niveles de ADN-ICL, antes del análisis por el HTP ACA modificado con ICL y la espectrometría de masas acoplada inductivamente (ICP-MS; consulte el Archivo complementario para obtener más detalles). Como se muestra en la Figura 10, se indujeron diferentes niveles de ADN-ICL en las tres líneas celulares, junto con diferentes niveles de Pt en el ADN. Se observó una correlación positiva (R² = 0,9235) entre los niveles de ICL de ADN y las concentraciones de platino, indicando la asociación entre los niveles de ADN de platino y la ICL²⁸ correspondiente.

Reparación por escisión de bases en células BE-M17 infectadas y no infectadas por micoplasma
Las células BE-M17 infectadas y no infectadas por micoplasma se trataron con 50 μM H2_O2durante 30 min y se incubaron con medio completo (medio de Eagle modificado de Dulbecco suplementado con FBS al 10% (v / v)) durante diferentes duraciones (0 min, 30 min, 1 h, 2 h, 6 h, 24 h o 30 h) durante las cuales se permitió que las células se repararan. En cada punto de tiempo, las células se recolectaron y congelaron a -80 ° C, en un medio que contenía DMSO al 10%, antes de realizar el HTP ACA modificado con hOGG1 (paso 6). Después de 30 min, los niveles de SB/ELA habían disminuido a 21% TD (porcentaje de ADN de cola) en las células no infectadas, mientras que las células infectadas mostraron 49% TD (Figura 11A). Después de ~ 15 h, los niveles de SB / ALS habían regresado a la línea de base en células infectadas y no infectadas. Para las purinas oxidadas, el BE-M17 no infectado mostró inicialmente un pequeño aumento en el daño, antes de regresar a la línea de base dentro de las 30 h (Figura 11B). En contraste, las células infectadas mostraron un aumento sostenido y significativo de las purinas oxidadas, que permanecieron elevadas, y no volvieron a los niveles basales incluso después de 30 h (Figura 11B)²³.

Figura 1: Descripción general del procedimiento convencional de ensayo de cometas alcalinos. (i) Una suspensión unicelular de células cultivadas o una muestra de sangre total se mezcla con agarosa LMP al 0,6% (p/v). ii) La mezcla de células y agarosa se aplica a portaobjetos de microscopio prerecubiertos y se cubre con un cubreobjetos hasta que se solidifique. (iii) Las células se lisan utilizando un tampón de lisis de pH alto durante la noche, formando cuerpos nucleoides, antes de (iv) lavarse con_ddH2O. (v) El ADN celular se desenrolla en el tampón de electroforesis de alto pH. La presencia de roturas de hebras permite que el ADN se relaje y descanse, y bajo electroforesis, el ADN se extrae del cuerpo nucleoide, formando una cola. Los portaobjetos se (vi) drenan, secan, (vii) neutralizan y (viii) se lavan con_ddH2Oantes de (ix) secarse durante la noche. Luego, los portaobjetos (x) se rehidratan con ddH₂O, (xi) se tiñen, (xii) se lavan y, finalmente, (xiii) se marcan y analizan, generalmente utilizando microscopía fluorescente y software de análisis de imágenes. Esta cifra se reproduce de una publicación anterior²⁰. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Los materiales que componen el sistema de electroforesis cometaria de alto rendimiento. Se muestra el tanque de electroforesis HTP, los bastidores HTP y los platos para lisis, lavado, neutralización y tinción. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Imágenes representativas de un portaobjetos de ensayo de cometa y un bastidor HTP (portaobjetos de microscopio). (A) Para una orientación correcta, la cara pre-recubierta del portaobjetos del microscopio se reconoce por un punto negro en la esquina derecha de un portaobjetos de microscopio. (B) La imagen del bastidor HTP ilustra cómo las guías se mantienen en una orientación vertical apretada, con pestañas en el portador para fijar su orientación dentro del tanque de electroforesis. Cada portador puede acomodar hasta 25 toboganes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Representación de la placa de enfriamiento con portaobjetos de muestra y paquetes de congelación en su lugar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Captura de pantalla de cometas representativos tomada durante la puntuación. HaCaTs (A) sin tratamiento y (B) tratados con 1 J/cm² UVB antes de realizar HTP ACA. La mayoría de los paquetes de software pueden calcular una variedad de puntos finales del cometa, pero los más comunes son el % de ADN de la cola (preferido) o el momento de la cola basado en estas imágenes (azul: inicio de la cabeza, verde: medio de la cabeza y púrpura: final de la cola). La barra de escala es de 10 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Gráficos representativos que ilustran el efecto del voltaje de electroforesis en el porcentaje de ADN de cola, determinado utilizando el HTP ACA. Las células fueron expuestas a (A) 5 o 10 J/cm 2 UVA, (B) 0.5 o 1.0 J/cm 2 UVB, o (C) 50 μM H 2 O ² antes del HTP ACA, con el voltaje de electroforesis a 1, 1.09 o 1.19 V/cm. Los datos representan la media de 200 determinaciones de n = 2 experimentos duplicados³¹. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7: Gráfico representativo e imágenes de cometas de sangre humana analizadas por el HTP ACA modificado con Fpg. Las muestras de sangre humana se irradiaron con 10 J/cm² UVA o se irradiaron de forma simulada («ctrl») en hielo antes de la etapa de lisis. Se utilizaron diferentes concentraciones de Fpg (1, 2, 4 u 8 U/mL) para el tratamiento enzimático antes de la electroforesis. (A) Los datos representan la media ± SEM de 300 determinaciones de n = 3 experimentos. (B) Imágenes representativas de cometas para cada concentración de Fpg en muestras de sangre irradiadas con UVA de 10 J/^cm2 . La barra de escala es de 10 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 8: Imágenes representativas de cometas que ilustran la detección de ICL después del tratamiento con cisplatino. (A) células de control sin ningún tratamiento, (B) células que fueron tratadas con H 2 O 2 (50 μM) solamente, (C) células que fueron tratadas con H 2 O ₂(50 μM) y cisplatino (200 μM), lo que ilustra que la cola es más corta que en (B), debido a la presencia de ICL²⁸. La barra de escala es de 10 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 9: Demostración de la cinética de la formación y reparación de ICL inducida por cisplatino. Las células A2780 se trataron con 100 μM de cisplatino en el medio de cultivo durante 1 h. Luego se eliminó el medio que contenía cisplatino y las células se cultivaron durante varios puntos de tiempo, antes del análisis mediante HTP ACA modificado con ICL. Los datos representan la media ± SEM a partir de n = 3 experimentos²⁸. P < 0,0001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 10: Correlación entre la ICL de ADN y la concentración de platino. La ICL de ADN se determinó mediante el HTP ACA modificado con ICL y los niveles de platino se midieron mediante ICP-MS (con discriminación de energía cuatricinética única, SQ-KED), en tres líneas celulares de cáncer de ovario. R² = 0,9235. Ver Archivo Suplementario para la metodología ICP-MS para cuantificar los niveles de platino en el ADN²⁸. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 11: Un gráfico representativo que ilustra el daño y la reparación del ADN, determinado por el ensayo de cometa modificado con hOGG1, en células BE-M17 infectadas por micoplasma versus no infectadas. Después del tratamiento con 50 μM_H2O2durante 30 min, se permitió que las células se repararan durante diferentes duraciones (0, 30 min, 1 h, 2 h, 6 h, 24 h o 30 h). El HTP ACA modificado con hOGG1 se utilizó para medir (A) SB / ALS y (B) purinas oxidadas en células BE-M17 infectadas (puntos de datos rojos) y no infectadas (puntos de datos negros). Los datos representan la media de 200 determinaciones de n = 2 experimentos duplicados. Esta figura se reproduce con permiso de una publicación anterior²³. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Reactivo	Solución de stock		Solución de trabajo
Tampón de lisis	100 mM Na 2 EDTA, 2,5 M NaCl y 10 mM Tris Base en ddH2O; ajustar el pH a 10 con NaOH de 10 M		Triton X-100 al 1% en solución madre de lisis
Tampón de electroforesis	10 M NaOH y 200 mMNa2EDTA en ddH2O		300 mM NaOH y 1 mM Na2EDTA; pH > 13
Búfer de neutralización	0,4 M Tris Base en ddH2O; ajustar el pH a 7,5 con HCl
Tampón de tinción	1 mg/ml de yoduro de propidio		2,5 μg/ml de yoduro de propidio enddH2O

Tabla 1: Composición de los reactivos utilizados en HTP ACA. Se muestran las concentraciones madre y de trabajo de lisis, electroforesis, neutralización y tampones de tinción.

Expediente complementario. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

Este estudio demuestra la versatilidad proporcionada por el equipo actual, que se puede utilizar para lograr un alto rendimiento con una variedad de variantes representativas y comunes del ensayo cometa (es decir, alcalino, modificado con enzimas, sangre e ICL, y otras variantes también serán adecuadas). Además, el enfoque actual trae consigo varios beneficios ^20,21: (a) el tiempo de ejecución del ensayo disminuye debido a la manipulación de múltiples portaobjetos en paralelo (el tiempo de manejo disminuye en un⁶⁰%); b) se reduzca el riesgo de daño a los geles y, por lo tanto, el riesgo para el experimento; c) disminuyen las necesidades de reactivos (por ejemplo, el volumen del tanque de electroforesis es menor que el tanque convencional); d) se aumenta el número de diapositivas ejecutadas. Un tanque puede proporcionar un aumento del 20% en el número de deslizamientos en comparación con un solo tanque convencional; Sin embargo, múltiples tanques de electroforesis pueden funcionar o ser esclavos (es decir, múltiples tanques controlados por una sola fuente de alimentación), en paralelo desde la misma fuente de alimentación, y aún requieren una huella de sobremesa más pequeña que un solo tanque convencional con bandeja de hielo; y (e) la huella del tanque disminuye debido a la orientación vertical de las diapositivas y el enfriamiento integral (ahorra espacio en el laboratorio); El tanque HTP comprende una base de enfriamiento cerámico de alto rendimiento con un cajón deslizante que puede caber en un paquete de enfriamiento congelado para mantener una temperatura de amortiguación óptima sin tener que realizar el proceso en una cámara frigorífica.

Además, la placa de enfriamiento desarrollada por nosotros acomoda 26 portaobjetos de cometas, permite la solidificación rápida de la agarosa de bajo punto de fusión en los portaobjetos de ensayo de cometas y facilita una fácil recuperación de los portaobjetos después de que el gel de agarosa se solidifique. Las innovaciones anteriores hacen que el proceso de ensayo de cometas sea más simple y fácil.

Si bien se han desarrollado otros enfoques de alto rendimiento (por ejemplo, ensayo de cometas de 12 geles, CometChip o formatos de 96 mini-gel)²⁵, muchos científicos prefieren usar los portaobjetos de microscopio convencionales (que incluyen los portaobjetos prerecubiertos disponibles comercialmente u otros portaobjetos especializados). El enfoque actual puede acomodar todo tipo de portaobjetos de microscopio, lo que permite que los experimentos que utilizan estos portaobjetos se amplíen a través de un procesamiento y manejo de portaobjetos más rápidos. Como se señaló anteriormente, el sistema de cometas HTP aporta muchas ventajas, pero hay una limitación notable: el enfoque actual proporciona solo un aumento del 20% en el número de muestras ejecutadas, en comparación con un tanque horizontal convencional (aunque el procesamiento de portaobjetos es mucho más rápido). Los formatos CometChip y 96 mini-gel ejecutan un mayor número de muestras. Hasta la fecha, no sabemos si el enfoque actual puede acomodar los formatos CometChip o 96 mini-gel, aunque predecimos que lo hará. Como se señaló anteriormente, el número de muestras se puede aumentar aún más esclavizando tanques a una sola fuente de alimentación. Al igual que con todos los enfoques, todavía existe la posibilidad de perder o dañar los geles mientras se cargan muestras y se analizan bajo el microscopio, pero esto se debe más a un error del operador, y las posibilidades de esto se minimizan con el enfoque actual.

El uso del sistema de cometas HTP puede ayudar en gran medida a analizar el daño del ADN, facilitando el uso del ensayo del cometa en una amplia gama de aplicaciones, como epidemiología molecular, ciencia reproductiva masculina, estudios de genotoxicología y toxicología ambiental. Esto es particularmente cierto para aquellos usuarios que desean tener todos los beneficios de un rendimiento mejorado y facilidad de uso, sin alejarse de los portaobjetos de microscopio convencionales familiares y rentables.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
22 x 22 mm glass coverslips	Fisher Scientific, Hampton, NH, USA	631-0124
A2780	ECACC,  Louis, MO,  USA	93112519
Concentrated nitric acid (OptimaTM grade)	Fisher Scientific Fair Lawn, NJ, USA	A467-250
Fluorescence microscope equipped with a camera	Zeiss, Jena, Germany
Fresh human whole blood	Zen Bio Inc	SER-WB10ML	Commercial human whole blood sample
GraphPad Prism	GraphPad Software, San Diego, California		Data analysis software
HTP Comet Assay system	Cleaver Scientific	COMPAC- 50
Human Keratinocyte (HaCaTs)	American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, USA	Discontinued	Can be purchased from another company ADDEXBIO TECHNOLOGIES Cat# T0020001
Hydrogen peroxide (H2O2) 30% in water	Fisher Scientific, Hampton, NH, USA	BP2633-500
ICP-MS iCAP RQ ICP-MS system	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA	IQLAAGGAAQFAQKMBIT
Image and Data Analysis software	Perceptive Instrument, Bury St Edmunds, England, UK	125525	Free image analysis softwared is available e.g., ImageJ
Internal Standard Mix	SPEX Certiprep, Metuchen, NJ, USA	CL-ISM1-500	Bismuch (isotope monitored 209 Bi)-concnetration of 10 µg/mL in 5% HNO3
Low melting point Agarose	Invitrogen Waltham, MA, USA	P4864
Na2EDTA (disodium ethylenediaminetetraacetic acid)	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA	E5134
NaCl (Sodium chloride)	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA	S7653
NanoDrop One	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA	701-058108	Nanodrop for measuring DNA concentration
Nanopure Infinity Ultrapure Water System (Barnstead Nanopure)	Thermo Scientific,  Waltham, MA, USA	D11901	Ultrapure water (16 MΩ cm-1)
NaOH (sodium Hydroxide)	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA	E5134
Normal melting point Agarose	Fisher Scientific, Hampton, NH, USA	16520100	For pre-coating slides
OCI-P5X	University of Miami, Miami, FL, USA	N/A	Live Tumor Culture Core facility provided the cells
Platinum (Pt) reference standard	SPEX Certiprep, Metuchen, NJ, USA	PLPT3-2Y	(1000 µg/mL in 10% HCl) containing Bismuch
Propidium Iodide (1.0 mg/mL in water)	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA	12-541BP486410ML
QIAamp DNA Mini Kit	Qiagen Valencia, CA, USA	51304	DNA extraction Kit
Single-frosted glass microscope slides	Fisher Scientific, Hampton, NH, USA	12-541B
SKOV3	ECACC, Louis, MO, USA	91091004
Slide box	Fisher Scientific, Hampton, NH, USA	03-448-2	Light proof, to protect cells from the formation adventitious damage (according to the widely held view) and prevent fading of the fluorescent dye
Slide Chilling plate	Cleaver Scientific, Rugby, England, UK	CSL-CHILLPLATE
Treatment dish	Cleaver Scientific, Rugby, England, UK	STAINDISH4X
Tris-base	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA	93362
Triton X-100	Fisher Scientific, Hampton, NH, USA	BP151-500
Trypsin EDTA (0.5%)	Invitrogen Gibco, Waltham, MA, USA	15400054
Vertical Slide Carrier	Cleaver Scientific, Rugby, England, UK	COMPAC-25