Perfil espacial digital para la caracterización del microambiente en glioma infiltrante difuso de tipo adulto

Resumen

La desregulación proteómica juega un papel importante en la propagación de gliomas infiltrantes difusos, pero varias proteínas relevantes permanecen sin identificar. El procesamiento espacial digital (DSP) ofrece un enfoque eficiente y de alto rendimiento para caracterizar la expresión diferencial de proteínas candidatas que pueden contribuir a la invasión y migración de gliomas infiltrativos.

Resumen

Los gliomas infiltrantes difusos se asocian con una alta morbilidad y mortalidad debido a la naturaleza infiltrativa de la diseminación tumoral. Son tumores morfológicamente complejos, con un alto grado de variabilidad proteómica tanto en el propio tumor como en su microambiente heterogéneo. El potencial maligno de estos tumores se ve reforzado por la desregulación de las proteínas involucradas en varias vías clave, incluidos los procesos que mantienen la estabilidad celular y preservan la integridad estructural del microambiente. Aunque se han realizado numerosos análisis masivos y de glioma unicelular, existe una relativa escasez de estratificación espacial de estos datos proteómicos. Comprender las diferencias en la distribución espacial de los factores tumorígenos y las poblaciones de células inmunitarias entre el tumor intrínseco, el borde invasivo y el microambiente ofrece información valiosa sobre los mecanismos subyacentes a la proliferación y propagación del tumor. El perfil espacial digital (DSP) representa una tecnología poderosa que puede formar la base para estos importantes análisis multicapa.

DSP es un método que cuantifica eficientemente la expresión de proteínas dentro de las regiones espaciales especificadas por el usuario en una muestra de tejido. DSP es ideal para estudiar la expresión diferencial de múltiples proteínas dentro y entre regiones de distinción, lo que permite múltiples niveles de análisis cuantitativo y cualitativo. El protocolo DSP es sistemático y fácil de usar, lo que permite un análisis espacial personalizado de los datos proteómicos. En este experimento, los microarrays de tejido se construyen a partir de biopsias archivadas del núcleo del glioblastoma. A continuación, se selecciona un panel de anticuerpos, dirigidos a proteínas de interés dentro de la muestra. Los anticuerpos, que se conjugan previamente a oligonucleótidos de ADN fotocleavable UV, se incuban con la muestra de tejido durante la noche. Bajo microscopía de fluorescencia visualización de los anticuerpos, las regiones de interés (ROIs) dentro de las cuales cuantificar la expresión de proteínas se definen con las muestras. La luz UV se dirige a cada ROI, dividiendo los oligonucleótidos de ADN. Los oligonucleótidos son microaspirados y contados dentro de cada ROI, cuantificando la proteína correspondiente sobre una base espacial.

Introducción

Los gliomas infiltrantes difusamente son el tipo más común de tumor cerebral maligno en adultos y son invariablemente letales. La propensión de las células de glioma a migrar extensamente en el cerebro es un desafío terapéutico importante. El mecanismo por el cual se propagan implica la migración dirigida y la invasión sin control. Se ha demostrado que las células de glioma invasivo exhiben tropismo y migración a lo largo de los tractos de sustancia blanca¹, con investigaciones recientes que implican la desmielinización de estos tractos como una característica activa y protumorigénica². La invasión está mediada por una transición epitelial-mesenquimal, en la que las células gliomas adquieren propiedades mesenquimales al reducir la expresión de genes que codifican proteínas de la matriz extracelular y moléculas de adhesión celular, amplificando la migración y facilitando la propagación a través del microambiente tumoral ^3,4,5.

A nivel molecular, se ha demostrado la disrupción de varias proteínas que confieren estabilidad celular e interactúan con componentes inmunogénicos⁶. Se sabe que los gliomas infiltrativos sufren supresión de proteínas con propiedades antiapoptóticas (por ejemplo, PTEN)⁷. También sobreexpresan proteínas que promueven la evasión de la respuesta inmune del huésped (por ejemplo, PD1/PDL1)⁸. La desregulación de estas vías complejas aumenta la tumorigenicidad y aumenta el potencial maligno.

Dentro de muestras de glioma invasivo, el objetivo fue evaluar la expresión diferencial de proteínas clave para el crecimiento, la supervivencia y la proliferación celular, y para la integridad estructural del microambiente entre componentes invasivos y no invasivos. Además, buscamos estudiar la regulación diferencial de proteínas con un papel inmunogénico activo, ofreciendo información sobre el mecanismo por el cual las defensas inmunes comprometidas del huésped pueden mejorar el potencial proliferativo e invasivo de los gliomas. Esto es especialmente relevante dada la reciente amplitud de la investigación que demuestra cómo los marcadores inmunes y los impulsores de la desregulación en la malignidad pueden servir como objetivos de la inmunoterapia. La identificación de dianas terapéuticas viables entre las muchas proteínas implicadas en la inmunovigilancia y la reactividad requiere un enfoque altamente sensible y completo.

Dada la amplia gama de proteínas candidatas que se pueden estudiar, buscamos un método similar a la inmunohistoquímica pero con una mayor eficiencia en el procesamiento de datos. Dentro del campo de la biología del cáncer, DSP se ha convertido en una tecnología poderosa con importantes ventajas sobre herramientas alternativas para el análisis proteómico y la cuantificación. El sello distintivo de DSP es su capacidad de multiplexación de alto rendimiento, que permite el estudio simultáneo de varias proteínas diferentes dentro de una muestra, marcando una distinción importante de las tecnologías estándar pero de plexación inferior como la inmunohistoquímica (IHC)^9,10. La característica múltiplex de DSP no compromete su fidelidad como herramienta cuantitativa y analítica, como lo demuestran los estudios que comparan DSP con IHC. Cuando se utiliza para la cuantificación proteómica de muestras de cáncer de pulmón de células no pequeñas, por ejemplo, se ha demostrado que el DSP tiene resultados similares a IHC¹¹. Además, DSP ofrece una especificación regional personalizable, en la que los usuarios pueden definir manualmente las regiones dentro de las cuales realizar el análisis proteómico. Esto presenta una ventaja sobre los métodos multiplexores de sección completa^10,12. En una sola ronda de procesamiento, DSP ofrece múltiples capas de análisis mediante el estudio de varios objetivos de proteínas en múltiples regiones de interés.

DSP tiene aplicaciones en varios entornos patológicos diferentes. DSP es especialmente ventajoso en el análisis oncológico, ya que la variación espacial puede correlacionarse con la transformación celular y la expresión diferencial de proteínas. Por ejemplo, DSP se ha utilizado para comparar el perfil proteómico del cáncer de mama con el microambiente tumoral adyacente. Esto conlleva implicaciones importantes para la comprensión de la historia natural de este tumor y su progresión, así como la posible respuesta al tratamiento¹³. Otros contextos que ilustran la versatilidad del DSP incluyen la cuantificación espacial de la diversidad de proteínas en el cáncer de próstata¹⁴, la asociación de la expresión del marcador de células inmunitarias con la progresión de la enfermedad en el carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello 15 y la demostración de un gradiente epitelial-mesenquimal de la expresión de proteínas que distingue el cáncer de ovario metastásico del primario de células claras¹⁶ . Mediante la implementación de DSP, caracterizamos la topografía espacial de las proteínas que podrían afectar la tumorigénesis y la invasión de gliomas.

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Protocolo

El protocolo descrito a continuación sigue las pautas del Comité de Ética de Investigación Humana de Dartmouth-Hitchcock. Se obtuvo el consentimiento informado de los pacientes cuyas muestras de tejido fueron incluidas en este estudio. Consulte la sección Tabla de materiales para obtener detalles relacionados con todos los materiales, reactivos, equipos y software utilizados en este protocolo.

1. Preparación de la diapositiva¹⁷

1. Recuperar o preparar tejido fijado en formalina e incrustado en parafina a partir de gliomas infiltrantes difusos de tipo adulto humano.
   NOTA: En este experimento, se utilizaron bloques de biopsias con parafina de tres pacientes con glioblastoma.
2. Cree un bloque de micromatriz de tejido (TMA). Tome varios núcleos de 2 mm de cada biopsia y colóquelos en un solo bloque TMA (Figura 1, arriba). Corte secciones del bloque TMA a 4 μm y móntelas en portaobjetos de vidrio. Coloque cada portaobjetos dentro de la junta del portacorrederas. Incubar el tobogán a 60 °C durante 30 min.

2. Preparación del sistema IHC semiautomatizado y configuración del software (para la carga y ejecución de diapositivas)¹⁷

1. Configure los reactivos. Haga clic en el botón Configuración del reactivo . Haga clic en Agregar en la pestaña Configuración .
   1. Registre un búfer de lavado escribiendo un nombre para él en el campo Nombre . Seleccione Auxiliar en el campo Tipo . Haga clic en Guardar.
   2. Registre una solución de bloqueo repitiendo los mismos pasos anteriores (modificados según corresponda, por ejemplo, en el campo Nombre ), pero seleccionando Anticuerpo primario en el campo Tipo . Seleccione los protocolos deseados en los cuadros desplegables para Protocolo de tinción predeterminado y Protocolo HIER predeterminado. Seleccione una opción Protocolo de enzimas predeterminado si lo desea (este cuadro se dejó en blanco en el protocolo actual). Haga clic en Guardar.
2. Registre el sistema de detección, que consiste en una bandeja de contenedor de reactivos con código de barras. Escanee el código de barras.
   1. Comience a introducir los detalles del sistema de reactivos en la ventana Agregar sistema de reactivos de investigación . Escriba un Nombre para el sistema de detección.
   2. Escriba una fecha de caducidad. Resalte la primera fila del gráfico Reactivos y Escanee el código de barras de un nuevo contenedor de reactivos de 30 ml, momento en el que el código de barras rellenará la fila 1.
   3. Coloque el contenedor en la posición 1 del sistema de detección. Seleccione el nombre del tampón de lavado en el cuadro desplegable de la columna Reactivo y haga clic en Agregar. Repita estos pasos para agregar cualquier reactivo adicional en las filas siguientes, incluida la solución de bloqueo.
3. Configure el Protocolo de proteínas para IHC. Haga clic en Configuración de protocolo. Resalte la fila correspondiente al protocolo deseado y haga clic en Copiar. Introduzca el Nombre y rellene cualquier otro campo relevante en la ventana Editar propiedades del protocolo.
   1. Seleccione la casilla Mostrar pasos de lavado. Confirme que los campos Inc (min) y DispenseType son correctos para cada reactivo (10 min para la solución de bloqueo, 0 min para el tampón de lavado y 150 μL para cada DispenseType). Haga clic en Guardar.
4. Prepare el estudio. Llene el recipiente en la posición 1 con un tampón de lavado. Llene 150 μL por portaobjetos y 5 ml de volumen muerto; Deje la tapa abierta. Repita estos pasos para el contenedor en la posición 2, que debe llenarse con una solución de bloqueo. Este recipiente debe tener 150 μL por portaobjetos y 350 μL de volumen muerto.
   1. Cargue la bandeja del contenedor de reactivos en la máquina. Permitir que el sistema realice medidas de reconocimiento de contenedores y confirmación de volumen. Haga clic en Slide Setup | Añadir estudio. Introduzca el ID del estudio y el nombre del estudio y seleccione 150 μL en Volumen de dispensación | el protocolo deseado en el menú desplegable Protocolo de preparación (se sugiere Hornear y desparacar). Resalte el estudio y haga clic en Agregar diapositiva.
   2. Seleccione Tejido de prueba bajo Tipo de tejido | 150 μL en Volumen de dispensación | Individual y Rutina en los cuadros desplegables Modo de tinción . Seleccione un proceso (IHC para el estudio actual) | el Nombre de la solución de bloqueo en el cuadro desplegable del campo Marcador | Protocolo DSP IHC en el campo Tinción de la pestaña Protocolos | * Hornear y desparafinar para la preparación | *HIER 20 min con ER1 para HIER. Deje el campo Enzima en blanco.
   3. Repita este proceso para cada diapositiva. Haga clic en Cerrar una vez finalizado y, a continuación, haga clic en Imprimir etiquetas. Marque todas las etiquetas de diapositivas aún no impresas para el estudio actual y haga clic en Imprimir. Coloque etiquetas en la parte superior de las diapositivas.
5. Cargar y ejecutar diapositivas. Cargue las diapositivas en la bandeja portaobjetos, asegurándose de que la muestra y la etiqueta estén orientadas hacia arriba. Coloque los azulejos de la cubierta sobre las diapositivas, asegurándose de que las diapositivas estén orientadas con pestañas en la parte inferior. Cargue las bandejas deslizantes en el instrumento.
   1. Presione el botón LED para bajar la bandeja y permitir que el instrumento comience el escaneo y reconocimiento de diapositivas. Haga clic en el botón Inicio para comenzar el experimento.
6. Termina el experimento. Presione el botón LED cuando parpadee en verde, lo que indica que se ha completado la ejecución. Retire la bandeja del instrumento y levante con cuidado las baldosas de la cubierta de cada portaobjetos. Coloque los portaobjetos en 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS), elimine el exceso de tampón y delinee cada sección de tejido con una pluma hidrófoba para crear una barrera hidrófoba.

3. Incubación de anticuerpos y tinción de núcleos¹⁷

1. Seleccione un panel de anticuerpos para localizar los antígenos de interés (consulte la Tabla 1 para los anticuerpos utilizados en este experimento).
   NOTA: Cada anticuerpo ya ha sido conjugado a un oligonucleótido de ADN con un segmento fotodivisible UV (PC-oligo) que lo identifica de forma única (oligos de indexación, Figura 2).
2. Haga una solución funcional de anticuerpo-PC-oligo añadiendo, para cada portaobjetos, 8 μL de cada anticuerpo (diluido 1:40) en el panel. Utilice el reactivo de bloqueo como diluyente para alcanzar el volumen final de 200 μL para cada portaobjetos. Incubar durante la noche a 4 °C (Figura 3, Paso 1).
   NOTA: También se pueden agregar marcadores morfológicos, colorantes biológicos o anticuerpos marcados con fluorescencia a la solución en este paso.
3. Al día siguiente, coloque el portaobjetos en un frasco de Coplin y lave 3 x 10 min en 1x TBS-T. Postfijo en paraformaldehído al 4% durante 30 min a temperatura ambiente, seguido de 2 x 5 min en 1x TBS-T.
4. Añadir la tinción nuclear SYTO13 (diluida 1:10 en 1x TBS) durante 15 min a temperatura ambiente. Lave 2x con 1x TBS-T y, a continuación, guarde la diapositiva en 1x TBS-T.

4. Visualización de fluorescencia, identificación de ROI y fotoescisión UV en el instrumento DSP¹⁷

1. Después de pasar el mouse sobre la recopilación de datos en el Centro de control, seleccione Nuevo/Continuar ejecución.
2. Coloque la diapositiva en el portadiapositivas, con la etiqueta hacia el usuario. Baje la abrazadera de la bandeja deslizante, asegurándose de que el tejido sea visible en la ventana alargada. Añadir 6 ml de tampón S.
3. Siga las indicaciones en el Centro de control. Haga zoom entre diferentes ejes con los controles deslizantes X e Y para delinear una región para escanear. Seleccione Escanear. Permita que el escaneo continúe hasta que se haya creado una imagen de toda el área de destino definida.
4. Genera una imagen de 20x. Defina los ROI de forma automática o manual (Figura 3, Paso 2). Para seguir este protocolo, seleccione tres ROI circulares de igual tamaño (diámetro de 250 μm) para cada núcleo de tejido (Figura 4, abajo).
   NOTA: Los ROI son personalizables en tamaño y forma. Se pueden seleccionar varios ROI dentro de cada sección. En este experimento, los ROI circulares se definen manualmente.
5. Apruebe los ROI haciendo clic en el botón Salir del espacio de trabajo de escaneo . Espere a que la luz UV separe los oligos de los anticuerpos.
6. Cuando se haya completado el proceso del instrumento de limpieza , seleccione Nueva recopilación de datos para continuar con las diapositivas o placas actuales. De lo contrario, seleccione Quitar portaobjetos y microplacas.
7. Abra la ventana Finalizar placa haciendo doble clic en el área del icono de la placa en la parte inferior derecha del Centro de control. Si se conoce el número de lote (#) del paquete de código de hibridación (Hyb), ingrese el número y haga clic en Actualizar (opcional durante este paso). Haga clic en Finalizar.
8. Separe el portaportaobjetos y la placa de recolección siguiendo las indicaciones. Almacene las diapositivas en TBS-T. Si los portaobjetos no se van a utilizar durante mucho tiempo, cúbralos con un medio acuoso y un cubreobjetos.

5. Lectura de proteínas¹⁷

1. Utilizar un precinto permeable y secar los aspirados a 65 °C en un termociclador con la parte superior abierta. Añadir 7 μL de agua tratada con pirocarbonato de dietilo y mezclar. Incubar en RT durante 10 minutos, y luego girar hacia abajo rápidamente.
2. Elija las ecuaciones de la sonda R y la sonda U adecuadas de la Tabla 2 para guiar la creación de la combinación de sonda/tampón. Basado en el número de códigos Hyb necesarios para la hibridación en el presente experimento, aplique la ecuación (1) como se muestra a continuación. Mezclar y girar hacia abajo rápidamente.
   # Sonda de códigos Hyb R Sonda de piscina de trabajo U Tampón de hibridación de piscina de trabajo n = _______ (n × 8 μL) = _____ μL + (n × 8 μL) = ______ μL + (n × 80 μL) = _____ μL (1)
3. Agregue 84 μL de mezcla de sonda/tampón a cada paquete de códigos Hyb que se utilizará. Desplázate para mezclar y girar. En una placa de hibridación fresca de 96 pocillos, agregue 8 μL de cada mezcla maestra de código Hyb en los 12 pocillos de la fila indicada.
4. Transfiera 7 μL de la placa de recolección DSP al pocillo correspondiente en la placa de hibridación. Mezclar suavemente. Selle térmicamente y realice un giro rápido. A continuación, incubar durante la noche a 67 °C. Enfríe el plato en hielo y realice un giro rápido.
5. Agrupe los productos hyb de cada pozo en un tubo de tira, canalizando suavemente cada pocillo 5 veces para mezclar. Tapa el tubo de la tira y gira hacia abajo. Congele cualquier producto hyb no agrupado restante a -80 °C. Cargue los tubos de la tira en el sistema de análisis.
6. Guarde el archivo CDF en una unidad USB y, a continuación, transfiera los datos del instrumento DSP al analizador digital. Complete la configuración realizando los siguientes pasos.
   1. Cargue consumibles y muestras agrupadas en la estación de preparación. En la pantalla, presione Iniciar procesamiento. Seleccione Alta sensibilidad, seguido de Siguiente. Presione Seleccionar todo para ver el número de pozos con muestras | Terminar | Siguiente en la notificación por correo electrónico | Inicio.
   2. Una vez que la estación de preparación haya terminado, selle el cartucho y transfiéralo al analizador digital. Presione Iniciar conteo, seleccione Posición de etapa, presione Cargar archivo CDF existente y seleccione el archivo cargado anteriormente. Pulse Listo, seleccione de nuevo la posición del escenario, pulse Listo | Comience a ejecutar el programa.
7. Guarde el archivo comprimido de los archivos de conversión de recuento de reporteros del sistema de análisis en una unidad USB y, a continuación, inserte la unidad en la máquina DSP. En el Centro de control de DSP, coloque el cursor sobre Recopilación de datos y, a continuación, haga clic en Recuentos de carga. Seleccione el archivo comprimido correspondiente.

6. Análisis de datos¹⁷

1. Haga clic en Registros en el Centro de control de DSP. Para ver los análisis de la cola, seleccione Agregar análisis seleccionados a la cola | Mi cola de análisis. Seleccione Nuevo estudio en Cola después de pasar el cursor sobre la opción Análisis de datos en el Centro de control.
2. Seleccione Control de calidad en Opciones de la barra de tareas. Continúe con los valores predeterminados o ajuste si lo desea. Seleccione Ejecutar control de calidad y revise la cuadrícula de resultados. Haga clic en Ejecutar control de calidad para continuar y crear un nuevo conjunto de datos, normalizando los valores a los controles de hibridación positiva.
3. Importe las nuevas etiquetas en un archivo XLSX. Seleccione Administrar anotaciones en el panel Análisis y, a continuación, descargue una plantilla, inserte las etiquetas e importe el archivo.
4. OPCIONAL: Después de ejecutar QC, ajuste los datos aún más utilizando otras opciones de la barra de herramientas. Utilice las herramientas del panel Visualizaciones para trazar los datos transformados.
5. Navegue por el cuadro desplegable gris de parámetros para componer cada gráfico en el panel Visualizaciones . Seleccione una región concreta dentro de un gráfico para visualizar los segmentos resaltados correspondientes en el panel Análisis y haga clic con el botón derecho para generar etiquetas o grupos. En Resumen del conjunto de datos, revise los gráficos de Normalización, Escalado y otras opciones para su análisis y visualización.
6. Guarde una visualización seleccionando el icono para Guardar; revise las visualizaciones ya guardadas en Resumen. Seleccione el botón Exportar (.svg) para exportar una visualización en formato .svg. Exporte los datos en los que se basa una visualización haciendo clic en el botón Exportar (.xlsx). Exporte todos los datos contenidos en un conjunto de datos específico colocando el cursor sobre el nombre del conjunto de datos en el segundo panel y haciendo clic en el icono de exportación.

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Resultados

La Figura 4 muestra los resultados representativos de un experimento DSP realizado en muestras de glioblastoma. Se presenta un mapa de calor, que ilustra uno de los métodos para capturar datos visualmente utilizando el software DSP. Las filas representan objetivos de proteínas, y cada columna corresponde a una región de interés. Una gama de colores de azul a rojo denota una expresión baja a alta, respectivamente. La variabilidad del color dentro de una fila refleja la heterogeneidad reg...

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Discusión

Dada la diversidad de proteínas que podrían influir potencialmente en la agresividad de los gliomas y la noción de que varias de estas proteínas permanecen sin descubrir, un método de cuantificación de proteínas de alto rendimiento es un enfoque tecnológico ideal. Además, dado que los datos espaciales en muestras oncológicas a menudo se correlacionan con la expresión diferencial¹⁸, la incorporación del perfil espacial en el enfoque de cuantificación de proteínas permite un análisis ...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
BOND Research Detection System	Leica Biosystems, Wetzlar, Germany	DS9455	Open detection system containing open containers in a reagent tray
BOND Wash	Leica Biosystems, Wetzlar, Germany	AR950	10X concentrated buffer solution for washing fixed tissue
Buffer W	NanoString, Seattle, WA	contact company	Blocking reagent
Cy3 conjugation kit	Abcam, Cambridge, UK	AB188287	Cy3 fluorescent antibody conjugation kit
GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP)	NanoString, Seattle, WA	contact company	System for imaging and characterizing protein and RNA targets
GeoMx DSP Instrument BufferKit	NanoString, Seattle, WA	100471	Buffer kit for GeoMX DSP (including buffers for sample processing and preparation)
GeoMx Hyb Code Pack_Protein	NanoString, Seattle, WA	121300401	Controls for running GeoMX DSP experiemtns
GeoMx Immune Cell Panel (Imm Cell Pro_Hs)	NanoString, Seattle, WA	121300101	Protein module with targets for human immune cells and immuno-oncologic targets
GeoMx Pan-Tumor Panel (Pan-Tumor_Hs)	NanoString, Seattle, WA	121300105	Protein module with targets for multiple human tumor types and for markers of epithelial-mesenchymal transition
GeoMx Protein Slide Prep FFPE	NanoString, Seattle, WA	121300308	Sample preparation reagents for GeoMX DSP protein analysis
LEICA Bond RX	Leica Biosystems, Wetzlar, Germany	contact company	Fully automated IHC stainer
Master Kit--12 reactions	NanoString, Seattle, WA	100052	Materials and reagents for use with the nCounter Analysis system
nCounter Analysis System	NanoString, Seattle, WA	contact company	Automated system for multiplex target expression quantification (to be used with GeoMx DSP)
TMA Master II	3DHistech Ltd., Budapest, Hungary		To create the tissue microarray block