Imágenes biomoleculares de la captación celular de nanopartículas mediante microscopía óptica multimodal no lineal

Resumen

Este artículo presenta la integración de un módulo de enfoque espectral y un láser de pulso de doble salida, lo que permite obtener imágenes hiperespectrales rápidas de nanopartículas de oro y células cancerosas. Este trabajo tiene como objetivo demostrar los detalles de las técnicas ópticas no lineales multimodales en un microscopio de escaneo láser estándar.

Resumen

El sondeo de nanopartículas de oro (AuNP) en sistemas vivos es esencial para revelar la interacción entre AuNP y tejidos biológicos. Además, al integrar señales ópticas no lineales como la dispersión Raman estimulada (SRS), la fluorescencia excitada de dos fotones (TPEF) y la absorción transitoria (TA) en una plataforma de imágenes, se puede utilizar para revelar el contraste biomolecular de las estructuras celulares y AuNP de manera multimodal. Este artículo presenta una microscopía óptica no lineal multimodal y la aplica para realizar imágenes químicamente específicas de AuNPs en células cancerosas. Esta plataforma de imágenes proporciona un enfoque novedoso para desarrollar AuNP funcionalizadas más eficientes y determinar si están dentro de las vasculaturas que rodean el tumor, los espacios pericelulares o celulares.

Introducción

Las nanopartículas de oro (AuNP) han demostrado un gran potencial como sondas de imágenes biocompatibles, por ejemplo, como sustratos efectivos de espectroscopía Raman mejorada en superficie (SERS) en diversas aplicaciones biomédicas. Las principales aplicaciones incluyen campos como la biodetección, la bioimagen, las espectroscopias mejoradas por superficie y la terapia fototérmica para el tratamiento del cáncer¹. Además, el sondeo de AuNP en sistemas vivos es crucial para evaluar y comprender la interacción entre AuNP y los sistemas biológicos. Existen varias técnicas analíticas, incluida la espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier (FTIR)², la espectrometría de masas acoplada inductivamente por ablación láser (LA-ICP-MS⁾³ y la resonancia magnética (RM)⁴ que se han utilizado con éxito para investigar la distribución de AuNP en los tejidos. Sin embargo, estos métodos adolecen de varios inconvenientes, como el tiempo y la preparación compleja de muestras³, que requieren largos tiempos de adquisición, o la falta de resolución espacial submicrónica ^2,4.

En comparación con las técnicas de imagen convencionales, la microscopía óptica no lineal ofrece varias ventajas para sondear células vivas y AuNP: La microscopía óptica no lineal logra una profundidad de imagen más profunda y proporciona una capacidad de seccionamiento óptico 3D intrínseca con el uso de láseres ultrarrápidos de infrarrojo cercano. Con la mejora significativa de la velocidad de imagen y la sensibilidad de detección, se ha demostrado que la fluorescencia excitada de dos fotones (TPEF)^5,6,7 y la microscopía de segunda generación armónica (SHG)8,9,10 mejoran aún más las imágenes no invasivas de biomoléculas endógenas en células y tejidos vivos. Además, utilizando nuevas técnicas ópticas no lineales bomba-sonda como la absorción transitoria (TA)11,12,13,14 y la dispersión Raman estimulada (SRS)^15,16,17,18, es posible derivar un contraste bioquímico sin etiquetas de estructuras celulares y AuNPs. La visualización de AuNPs sin el uso de etiquetas extrínsecas es de gran importancia ya que las perturbaciones químicas de las nanopartículas modificarán sus propiedades físicas y, por lo tanto, su absorción en las células.

Este protocolo presenta la implementación de un módulo de Unidad de Recombinación y Sincronización de Enfoque Espectral (SF-TRU) para un láser de pulso de doble longitud de onda, lo que permite obtener imágenes multimodales rápidas de AuNP y células cancerosas. Este trabajo tiene como objetivo demostrar los detalles de las técnicas integradas de TPEF, TA y SRS en un microscopio de escaneo láser.

Protocolo

1. Encendido del sistema láser

1. Encienda el sistema de enclavamiento y seleccione el láser de brazo antes de iniciar el sistema.
2. Encienda la PC con el software para controlar el láser de femtosegundo de doble salida.
3. Cargue el software para el láser de femtosegundo de doble salida; Este software permite encender y apagar el láser y controla directamente la longitud de onda del haz de la bomba.
4. Encienda la emisión láser manteniendo presionado el icono de encendido para contar hasta 3.
5. Espere hasta que el láser se haya calentado y la luz lista para el láser se encienda en verde en el software.
6. La longitud de onda del haz de la bomba se controla directamente a través del software; Esto puede variar de 680-1.300 nm. Para obtener imágenes celulares en la región vibratoria Raman C-H, seleccione 802 nm.
7. Abra las persianas del haz de la bomba sintonizable y del haz Stokes de 1.045 nm manteniendo presionadas las imágenes de apertura durante 3 s.
   PRECAUCIÓN: Guía de seguridad láser el láser de femtosegundo de doble salida es un láser pulsado infrarrojo de clase IV y puede causar daños permanentes a la vista. Por lo tanto, se deben seguir todas las reglas locales de seguridad láser al llevar a cabo este procedimiento: (i) Solo los usuarios autorizados que hayan recibido capacitación en seguridad láser pueden llevar a cabo el procedimiento. (ii) La entrada al laboratorio se realiza a través del acceso con tarjeta magnética con un enclavamiento en la puerta de la habitación. (iii) Durante la mayor parte de la operación, los rayos láser están completamente cerrados. (iv) Cuando el rayo láser está expuesto, se deben usar gafas de seguridad láser (use las gafas de seguridad láser LG9, que proporcionan un bloqueo OD 7+ tanto de la bomba como de los haces Stokes).

2. Encendido de la unidad de sincronización y recombinación de enfoque espectral (SF-TRU)

1. Cargue el software ATM en el mismo PC con el software láser, que controla las etapas de retardo y los atenuadores láser en la unidad SF-TRU.
   NOTA: Esta unidad es responsable de asegurarse de que la bomba y las vigas de Stokes estén superpuestas espacialmente, controlar la dispersión en la bomba y las vigas de Stokes, y controlar el retardo de tiempo entre la bomba y las vigas de Stokes. La polarización de los haces de bomba y Stokes es vertical. Tenga en cuenta que cada haz está equipado con una placa de media onda para controlar independientemente las polarizaciones antes de salir del SF-TRU.
2. Asegúrese de que tanto la bomba como los láseres Stokes estén atenuados al <10% (bomba) y al <15% (haces Stokes). Si los haces no se atenúan, la potencia del láser puede causar daños al sistema y quemar muestras biológicas.
3. Para imágenes celulares, establezca los ajustes óptimos del láser en 6% (bomba) y 10% (Stokes), correspondientes a 12 mW y 30 mW en la muestra.
4. El SF-TRU tiene dos configuraciones: modo de femtosegundo (fs) y modo de picosegundo (ps).
5. Para el modo fs, empuje las perillas a ambos lados de la caja (esto elimina las rejillas de dispersión de la trayectoria del haz).
6. Para el modo ps, extraiga las perillas a ambos lados de la caja (esto coloca las rejillas de dispersión en la trayectoria del haz).
7. Para imágenes hiperespectrales, seleccione el modo ps.
8. Asegúrese de que la etapa de retardo esté en la posición correcta para que la bomba y los haces de Stokes se superpongan temporalmente para obtener imágenes C-H en este sistema.
9. Asegúrese de que los ajustes de dispersión de la bomba y el haz de Stokes sean correctos; para una bomba de 802 nm, esto es 5 mm para la viga de la bomba y 30 mm para la viga de Stokes.

3. Modulación del haz de Stokes para imágenes SRS

1. Para la detección SRS, module la intensidad del haz de Stokes.
2. Encienda el generador de señales para la modulación del haz.
3. Recuerde la configuración anterior, que es la siguiente:
   SALIDA 1: Onda cuadrada: Frecuencia = 19.5 MHz, Amplitud = 1.4 V.
   SALIDA 2: Onda cuadrada: Frecuencia = 19.5 MHz, Amplitud = 300 mV.
4. Encienda las salidas 1 y 2.
5. Conecte la salida 1 a un amplificador para la EOM en la caja SF-TRU a través de un cable BNC.
6. Conecte la salida 2 al amplificador de bloqueo utilizado para la detección SRS a través de un cable BNC.
7. Encienda la fuente de alimentación del amplificador del pórtico.

4. Encendido del amplificador de bloqueo

1. Para imágenes SRS, utilice el módulo de detección SRS que comprende un fotodiodo de área grande y un amplificador de bloqueo especialmente diseñado.
2. Encienda la fuente de alimentación del amplificador de bloqueo en el pórtico.
3. Cargue el software para el amplificador de bloqueo "SRS detection Module" en el PC.
4. En el software, elija los siguientes ajustes: Fase = 0°, Desplazamiento = -80 mW, Ganancia = 58 dB.
5. Seleccione la constante de tiempo de integración del amplificador de bloqueo en el software: para imágenes celulares, la constante de tiempo de 2 μs proporciona imágenes de buena calidad.

5. Funcionamiento del microscopio de barrido láser

1. Encienda los enchufes de todos los equipos excepto la caja de control remoto. Espere hasta que se encienda el modo de espera en la caja de control ubicada en la parte superior del pórtico.
2. Encienda la caja de control remoto en el pórtico y encienda la parte posterior de la caja. Espere hasta que la luz del control remoto se vuelva azul (en el cuadro de control) y presione Iniciar operación.
3. Encienda el PC del microscopio de escaneo láser.
4. Ejecute el software del microscopio confocal.
5. Compruebe la trayectoria de la luz del microscopio a través del software informático.
   NOTA: Se han realizado algunas modificaciones al microscopio para que sea adecuado para imágenes SRS: (i) En la trayectoria del haz, se ha agregado una pasada corta de 775 nm a la rueda del filtro donde los rayos láser ingresan a la unidad de escaneo, esto se puede seleccionar en la pestaña Lightpath en el software de la computadora. (ii) En lugar de utilizar los PMT incorporados al microscopio confocal para la detección, se ha agregado un detector a medida a la trayectoria de la luz transmitida, que permite la detección tanto SRS como CARS. (iii) Las salidas de estos detectores están conectadas a la caja analógica en el pórtico. La señal CARS del PMT se conecta a través de un cable BNC a CD1 y la señal SRS del amplificador de bloqueo se conecta a través de un cable BNC a CD2.
6. Controle el enfoque a través de la pantalla táctil o las perillas de control remoto o el software de la computadora.
7. Seleccione la configuración de imagen deseada en el software; Esto incluye el zoom, el tamaño de la imagen en píxeles y el tiempo de permanencia de los píxeles.
8. Asegúrese de que la velocidad de imagen (tiempo de permanencia en píxeles) sea mayor que el tiempo de integración establecido en el software del amplificador de bloqueo.
   NOTA: Se utilizó un objetivo de inmersión en agua NA 1.2 para la obtención de imágenes.

6. Montaje de una muestra en la etapa de microscopio

1. Prepare las muestras de células para obtener imágenes de la siguiente manera.
   1. Cultivo de células de carcinoma mamario de ratón 4T1 en RPMI-1640 suplementadas con suplementación con suero fetal bovino (FBS) al 10%. Cambiar el medio cada 2 días y pasar las células al 70%-80% de confluencia.
      NOTA: Los pasajes 8–10 se usaron a lo largo del curso de los experimentos descritos aquí.
   2. Para experimentos de imagen, incubar 1 x 10 5 células en cubreobjetos cuadrados durante 24 h a 37 °C,⁵ % de_CO2. Luego, lavar las células con solución salina tamponada con fosfato (PBS) precalentada e incubar con nanopartículas de oro (dilución 1:100 en medio de cultivo celular, concentración madre: 2.3 x 10 10 partículas/ml, diámetro:⁶⁰ nm) durante 4 h.
   3. Antes de la obtención de imágenes, lave las celdas con PBS helado y fíjelas con paraformaldehído al 4% en PBS durante 15 minutos a temperatura ambiente (RT). Lave las celdas con PBS 3x y luego móntelas entre dos cubreobjetos para obtener imágenes.
2. Coloque una gota de agua destilada encima del objetivo de inmersión en agua que enfoca los rayos láser en la muestra entre el objetivo y la muestra. Luego, coloque la muestra en la etapa del microscopio.
3. Un condensador con NA 1.4 recoge la luz propagada hacia adelante. Aplique una gota de agua entre el condensador y la muestra para obtener imágenes. Ajuste la altura del condensador a aproximadamente 1 mm por encima de la muestra para recoger la máxima cantidad de luz.
4. El detector SRS está en un soporte móvil, lo que le permite deslizarse hacia adentro y hacia afuera de la vía óptica de recolección. Para enfocar la muestra con luz blanca, mueva el detector SRS fuera de la trayectoria del haz.
5. Vuelva a colocar el detector en la trayectoria del haz, listo para obtener imágenes SRS.

7. Cambiar el cambio Raman y recopilar una pila de datos hiperespectrales

NOTA: El cambio Raman en el que se produce la obtención de imágenes depende de la posición de la etapa de retardo en la caja SF-TRU y de la longitud de onda del haz de la bomba del sistema láser.

1. Para grandes cambios en el cambio Raman, cambie la longitud de onda del láser. Por ejemplo, para obtener imágenes de vibraciones CH entre 2.800–3.100 cm-1, seleccione 802 nm, mientras que, para obtener imágenes de alrededor de 1.600 ^cm-1 para el pico de amida I, seleccione el haz de la bomba a 898 nm. Ajuste esto a través del software.
2. Para lograr pequeños ajustes en el cambio Raman, escanee la etapa de retardo en la unidad SF-TRU.
3. El SF-TRU proporciona posiciones de etapa de retardo en milímetros (mm). Para convertir la posición de la etapa de retardo de mm a ^cm-1, realice el escaneo hiperespectral de calibración utilizando una muestra de perlas de poliestireno y compare las posiciones de pico encontradas en el escaneo de calibración con las tomadas en una configuración Raman espontánea. Esto proporcionará una ecuación lineal, que convierte la posición de la etapa de retardo en mm al cambio Raman en ^cm-1.
4. Para generar un escaneo hiperespectral, tome una serie temporal de imágenes en diferentes posiciones de etapa de retardo.
5. Para sincronizar la adquisición de imágenes y el movimiento de la etapa de retardo, utilice la unidad analógica para enviar y recibir señales TTL hacia y desde el sistema SF-TRU.
   NOTA: Para hacer esto, la caja analógica tiene las siguientes conexiones: (i) TRIG OUT VD1: se conecta al SF-TRU a través de un BNC y envía una señal TTL para indicar a la etapa de retardo que mueva el incremento +1. (ii) TRIG In 1: aquí, se recibe una señal a través de BNC cuando la etapa de retardo ha terminado su movimiento, y esto se usa para activar la siguiente imagen en la serie temporal.
6. Para el conjunto de datos hiperespectrales, seleccione los siguientes ajustes en el software del microscopio confocal:
   1. En la pestaña Desencadenador, seleccione Iniciar por desencadenador TTL (activado) y Desencadenador (cada fotograma).
   2. En la pestaña Serie, establezca la serie temporal ON y la serie z OFF.
   3. Establezca el número de fotogramas en la serie temporal para que coincida con el número de pasos en el software ATM (aquí se utilizan 101 pasos).
7. En el software ATM, vaya a la pestaña Ejecutar .
   1. Establezca las posiciones de la etapa de retardo en milímetros para el inicio y la parada del escaneo hiperespectral. Para la región CH de alto número de onda, utilice la posición inicial = 90,25 mm y la posición de parada = 92,25 mm.
   2. Asegúrese de que el número de pasos coincida con el número de fotogramas en el software del microscopio confocal.
8. Después de verificar la configuración correcta, inicie primero la pila hiperespectral en el software del microscopio confocal. Vaya a Adquirir y haga clic en Iniciar escaneo. Luego, en el software del cajero automático, haga clic en Inicio. Esto inicia la recopilación de una serie de imágenes, con aumentos incrementales en la posición de la etapa de retardo entre las posiciones de inicio y parada seleccionadas.
9. Exporte la serie de imágenes hiperespectrales como un archivo de .tif multicuadro y utilice un paquete de software adecuado para llevar a cabo la calibración.
10. Una vez completada la calibración, utilice la ecuación de calibración lineal para convertir la posición de la etapa de retardo a los desplazamientos Raman.
11. Para cambiar entre imágenes en la región vibratoria CH (2.800–3.100 cm-1) a la región vibracional amida I 1.500–1.700 ^cm-1), haga lo siguiente.
    1. Cambie la longitud de onda de la bomba en el software láser de 802 nm a 898 nm.
    2. Cambie la configuración de dispersión de Stokes en el software ATM de 30 mm a 5 mm.
    3. Haga un pequeño ajuste en el espejo en la vía de dispersión del haz de la bomba dentro de la caja SF-TRU. Esto se hace ajustando la perilla inferior en el soporte del espejo, lo que cambia el ángulo del espejo en una cantidad incremental.
    4. Al realizar un escaneo hiperespectral sobre la región de amida I, establezca las posiciones de inicio y parada en el software ATM en 89 y 91 mm, respectivamente.
       PRECAUCIÓN: Se deben usar gafas de seguridad láser para este paso, ya que el rayo láser estará expuesto.

Resultados

El módulo Spectral Focusing Timing and Recombination Unit (SF-TRU) se introduce entre el láser de femtosegundo de doble salida y el microscopio de barrido láser modificado. El sistema láser ultrarrápido sintonizable utilizado en este estudio tiene dos puertos de salida que entregan un haz a una longitud de onda fija de 1.045 nm y el otro haz sintonizable en el rango de 680-1.300 nm. En la Figura 1 se muestra un esquema detallado del módulo SF-TRU y la plataforma de imágenes multimodal...

Discusión

En este estudio se ha presentado la combinación del módulo SF-TRU y el sistema láser ultrarrápido de doble salida que demuestra sus aplicaciones para la microespectroscopia multimodal. Con su capacidad para investigar la absorción de nanopartículas de oro (AuNP) por las células cancerosas, la plataforma de imágenes multimodales puede visualizar las respuestas celulares a los tratamientos hipertérmicos contra el cáncer cuando los rayos láser son absorbidos por AuNP.

Además, se logra...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
APE SRS Detection Unit	APE (Angewandte Physik & Elektronik GmbH)	APE Lock-in Module	Combined system containing a large area Si photo-diode for detecting the pump beam along with a Lock-In amplifier for detecting the beam modulations
Confocal Scanning Unit	Olympus	FV 3000	Confocal scanning unit used for imaging
CML Latex Beads, 4% w/v, 1.0 µm	Invitrogen	C37483	Polystyrene microspheres
Coverslips	Thorlabs	CG15CH2	22 mm x 22 mm coverslips for seeding cells
FBS	Gibco	10500-064	Foetal Bovine Serum (Heat Inactivated)
Flouview	Olympus	FV31S-SW	Laser scanning microscope control software
Function Generator	BX precision	40543	Used to generate square wave function which is fed to EOM in SF-TRU to produce modulations in the stokes beam
Gold Nanoparticles	Nanopartz	A11-60	Spherical gold nanoparticles, 60 nm diameter
Input Output Interface	Olympus	FV30 ANALOG	This unit allows voltage readouts from PMT and LockIn to be fed into the confocal scanning software and allows timing pulses to be sent between the olympus microscope and the SF-TRU unit.
InSight X3	Newport	Spectra-Physics	Dual-output femtosecond pulsed laser. Tunable (680–1300 nm) and fixed (1045 nm) laser outputs with the repetition rate of 80 MHz.
Microscope Frame	Olympus	IX83	Inverted microscope
Mouse 4T1 cells	ATCC	CRL-2539	Mouse breast cancer cells
NA 1.2 Water Immersion Objective	Olympus	UPLSAPO60XW/IR	The multiphoton 60x Objective has a 0.28 mm working distance. Other similar objectives can be used.
NA 1.4 Condenser	Nikon	CSC1003	Other condensers with NA higher than the excitation objective can also be used.
PMT	Hamamatsu	R3896	PMT used for detecting anti-stokes photos for CARS micrsocopy
PMT Connector	Hamamatsu	C13654-01-Y002	Connector for PMT
Power Supply	RS	RSPD-3303 C	Programmable power supply which is used for providing the correct voltage to the PMT
RPMI-1640	Gibco	A10491-01	Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium has since been found suitable for a variety of mammalian cells.
SF-TRU	Newport Spectra Physics	SF-TRU	System designed for controlling the time delay and dispersion of the 2 laser outputs and for performing the beam modulations required for SRS