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Resumen

Los cultivos primarios de Müller glia obtenidos a partir de retinas de ratón representan una herramienta muy robusta y fiable para estudiar la conversión glial en células progenitoras de la retina tras el tratamiento con microARN. Las moléculas individuales o combinaciones pueden ser probadas antes de su posterior aplicación de enfoques in vivo .

Resumen

La glía de Müller (MG) es la glía predominante en la retina neural y puede funcionar como una fuente regenerativa para las neuronas retinianas. En vertebrados inferiores como los peces, la regeneración impulsada por MG ocurre naturalmente; en los mamíferos, sin embargo, se requiere estimulación con ciertos factores o manipulación genética/epigenética. Dado que la MG comprende solo el 5% de la población de células de la retina, existe la necesidad de sistemas modelo que permitan el estudio de esta población celular exclusivamente. Uno de estos sistemas modelo son los cultivos primarios de MG que son reproducibles y se pueden utilizar para una variedad de aplicaciones, incluida la detección e identificación de moléculas / factores, pruebas de compuestos o factores, monitoreo celular y / o pruebas funcionales. Este modelo se utiliza para estudiar el potencial de la MG murina para convertirse en neuronas de la retina después de la suplementación o inhibición de microARN (miARN) a través de la transfección de miARN artificiales o sus inhibidores. El uso de ratones reporteros específicos de MG en combinación con el marcado inmunofluorescente y la secuenciación de ARN unicelular (scRNA-seq) confirmó que el 80%-90% de las células encontradas en estos cultivos son MG. Usando este modelo, se descubrió que los miRNAs pueden reprogramar MG en células progenitoras de la retina (RPC), que posteriormente se diferencian en células similares a las neuronales. Las ventajas de esta técnica son que los candidatos a miRNA pueden ser probados por su eficiencia y resultado antes de su uso en aplicaciones in vivo .

Introducción

La glía de Müller (MG) es la glía predominante en la retina neural. Tienen funciones similares en comparación con otras glías en otras partes del sistema nervioso central, como mantener la homeostasis del agua y los iones, nutrir las neuronas y proteger el tejido. Las MG tienen otra característica fascinante: aunque son glía madura, todavía expresan muchos genes expresados en células progenitoras de la retina (RPC) durante el desarrollo tardío 1,2. Se supone que esta semejanza es la razón de la regeneración neuronal natural basada en MG en la retina de los peces después del daño retiniano 3,4. Durante este proceso, la MG vuelve a entrar en el ciclo celular y se desdiferencia en RPC que luego se diferencian en los seis tipos de neuronas retinianas. Aunque este fenómeno ocurre naturalmente en los peces, las MG de mamíferos no se convierten en neuronas 5,6. Sin embargo, pueden reprogramarse. Se ha demostrado que una variedad de factores reprograman la MG en RPC/neuronas; entre estos factores se encuentra el factor de transcripción básico hélice-bucle-hélice (bHLH) homólogo 1 (Ascl1) que interviene en la regeneración de peces 7,8. En ratones, Ascl1 solo se expresa en RPC durante la retinogénesis, pero está ausente en neuronas maduras mg o retinianas9.

La reprogramación de células directamente in vivo no solo es un desafío metodológico, sino que también requiere la aprobación de un comité institucional de cuidado y uso de animales. Para recibir la aprobación, se requieren datos preliminares sobre los factores utilizados o alterados, las concentraciones, los efectos fuera del objetivo, los mecanismos subyacentes, la toxicidad y la eficiencia. Los sistemas de cultivo celular permiten probar estos criterios antes de su uso en modelos in vivo. Además, dado que la MG solo comprende alrededor del 5% de toda la población de células retinianas10, los cultivos de MG permiten estudiar su función11 así como su comportamiento, incluyendo la migración 12,13, la proliferación14, la reacción al estrés ante una lesión/daño 15,16, su interacción con otros tipos celulares como la microglía17 o las células ganglionares de la retina (RGC)18, o su potencial neurogénico 19,20,21. Muchos investigadores utilizan líneas celulares inmortalizadas para sus estudios, ya que tienen un potencial proliferativo ilimitado y pueden mantenerse y transfectarse fácilmente. Las células primarias, sin embargo, son preferibles para ensayos biológicamente relevantes que las células inmortalizadas, ya que tienen verdaderas características celulares (expresión de genes y proteínas) y, lo que es más importante, representan una cierta etapa en el desarrollo y, por lo tanto, tienen una "edad". La edad de un animal (y en consecuencia de las células obtenidas de un animal) es un factor especialmente crucial en la reprogramación celular, ya que la plasticidad celular se reduce con la etapa avanzada de desarrollo22.

Este protocolo describe en detalle cómo reprogramar la MG primaria con miRNAs como un método in vitro actual para estudiar la regeneración. Este modelo de cultivo primario de MG se estableció en 2012 para evaluar las características de proliferación celular de MG en ratones knock-out P53 (ratones trp53-/-)23. Se demostró que la MG cultivada mantiene sus características gliales (es decir, la expresión de las proteínas S100β, Pax6 y Sox2 evaluadas mediante el etiquetado inmunofluorescente), y que se asemejan a la MG in vivo (microarray de MG purificada por FACS)23. Poco después, la expresión de ARNm glial y proteínas fue validada y confirmada en un enfoque diferente utilizando vectores virales20. Unos años más tarde, se confirmó que la gran mayoría de las células encontradas en estos cultivos son MG mediante el uso del Rlbp1 específico de MGCreERT:tdTomatoSTOPfl/fl reporter mouse24. Además, la cuantificación del conjunto de miRNAs tanto en MG purificada por FACS como en MG primaria cultivada mostró que los niveles de mg miRNAs (mGLiomiRs) no varían mucho en MG cultivada durante la fase de crecimiento. Los períodos de cultivo alargados, sin embargo, causan cambios en los niveles de miRNA y, en consecuencia, en los niveles de ARNm y la expresión de proteínas, ya que los miRNAs son reguladores traslacionales25.

En 2013, este modelo de cultivo de MG se utilizó para probar una variedad de factores de transcripción con respecto a su capacidad para reprogramar MG en neuronas retinianas20. Se encontró que Ascl1 era un factor de reprogramación muy robusto y confiable. La sobreexpresión de Ascl1 a través de vectores virales indujo cambios morfológicos, expresión de marcadores neuronales y la adquisición de propiedades electrofisiológicas neuronales. Más importante aún, los conocimientos y resultados obtenidos de estos primeros experimentos in vitro se transfirieron con éxito a aplicaciones in vivo 22,26 demostrando que los cultivos primarios de MG representan una herramienta sólida y confiable para el cribado factorial inicial y la evaluación de las características gliales antes de la implementación in vivo.

Hace unos años, se demostró que el miRNA miR-124 enriquecido con cerebro, que también está altamente expresado en las neuronas de la retina, puede inducir la expresión de Ascl1 en MG21 cultivado. La expresión de Ascl1 en células vivas se visualizó a través de un ratón reportero Ascl1 (Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl). Un ratón reportero es un ratón genéticamente modificado que tiene un gen reportero insertado en su ADN. Este gen reportero codifica para una proteína reportera, que es en este estudio tdTomato, una proteína fluorescente roja. Esta proteína reportera informa de la expresión de un gen de interés, en este caso, Ascl1. En otras palabras, las células que expresan Ascl1 se volverán rojas. Dado que Ascl1 solo se expresa en RPC9, este ratón Ascl1CreERT: tdTomatoSTOPfl / fl permite el seguimiento de la conversión de MG en RPC que expresan Ascl1, lo que significa que las células convertidoras expresarán la proteína reportera tdTomato fluorescente roja. Este es un etiquetado irreversible ya que el ADN de estas células está alterado. En consecuencia, cualquier diferenciación neuronal posterior se visualizará porque la etiqueta tdTomato permanece en las células diferenciadoras. Si Ascl1 que expresa RPC derivados de MG (con etiqueta tdTomato) se diferencian en neuronas, estas neuronas aún tendrán su etiqueta roja. Este ratón, por lo tanto, permite no solo el etiquetado de RPC derivados de MG para imágenes de células vivas, sino que también permite el mapeo del destino y el rastreo de linaje de estos RPC derivados de MG (rojos). Más recientemente, se identificó el conjunto de miRNAs en RPC y se utilizaron cultivos MG de ratones Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl RPC-reporter para detectar y probar el efecto de estos miRNAs sobre la capacidad de reprogramación y la eficiencia27. Un candidato, el RPC-miRNA miR-25, se encontró capaz de reprogramar la MG cultivada en células que expresan Ascl1 (Ascl1-Tomate+). Estas células reprogramadas adoptan características neuronales a lo largo del tiempo, incluida la morfología neuronal (somatas pequeños y procesos finos cortos o largos), la expresión de transcripciones neuronales medidas a través de scRNA-Seq, así como la expresión de proteínas neuronales validadas mediante el etiquetado inmunofluorescente27.

Aquí, el protocolo detalla cómo cultivar y transfectar MG a partir de ratones P12 adaptados del trabajo anterior 21,24,27. Elegido para este protocolo es el mencionado miRNA miR-25, un miRNA altamente expresado en RPCs, con bajos niveles de expresión en MG o neuronas retinianas. Para sobreexpresar miR-25, se utilizan imitaciones murinas de miR-25, es decir, moléculas artificiales de miRNA. Como control, se eligen imitaciones de un miRNA de Caenorhabditis elegans, que no tienen función en células de mamíferos. La visualización de la conversión de MG en RPC se realizó a través del ratón reportero RPC (Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl), un ratón con fondo mixto (cepas C57BL/6, S129 e ICR). Sin embargo, este cultivo se puede realizar con todas las cepas de ratón, incluidas las cepas de tipo salvaje. En los últimos años, el protocolo original se ha modificado para reducir la duración de la fase de crecimiento y el período de cultivo general y garantizar un estado de células de la glía más robusto y minimizar el grado de degeneración celular, que ocurre en períodos de cultivo prolongados. La ventana de tiempo de transfección regular también se amplió de 3 h a 2 días. Como se mencionó anteriormente, aunque el protocolo actual describe los cultivos de MG como una herramienta para estudios de regeneración, el método no solo es útil para probar factores de reprogramación, sino que también se puede adaptar para otras aplicaciones, incluidos estudios sobre el comportamiento migratorio o proliferativo de MG, paradigmas relacionados con lesiones / daño celular y / o la identificación de mecanismos y vías subyacentes.

Protocolo

Los procedimientos que involucran sujetos animales han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) en SUNY College of Optometry.

NOTA: Este protocolo de cultivo consta de tres fases: crecimiento, transfección y fase de conversión. En la Figura 1 se ofrece un resumen del protocolo general con la línea de tiempo.

1. Preparación de medios y todos los reactivos requeridos

NOTA: Todos los pasos deben llevarse a cabo en un gabinete de bioseguridad A2 o B2 (BSC). Durante la fase de crecimiento, se utiliza un medio de crecimiento de alto contenido sérico que consiste en un medio neuronal basal suplementado con factor de crecimiento epidérmico (EGF). Para la fase de conversión, se utiliza un medio basal neurofisiológico de bajo sero suplementado con suplementos neuronales para garantizar la diferenciación neuronal y la supervivencia.

  1. Preparar el medio de crecimiento (utilizado durante la fase de crecimiento) complementando 200 ml de medio neuronal basal con 20 ml de suero fetal bovino (FBS, 10%), 1 ml de 200 ml de L-glutamina (0,5%), 2 ml de penicilina/ estreptomicina (1%) y 2 ml de suplemento de N2 (1%). Realizar filtración estéril (unidades de filtro con un tamaño de poro de 0,22 μm). Precaliente el medio en un baño de perlas metálicas a 37 °C antes de usarlo.
  2. Preparar el medio neuronal (utilizado durante la fase de conversión) siguiendo las instrucciones del fabricante (ver Tabla de Materiales) complementando 100 mL de medio basal neurofisiológico libre de suero con 2 mL de suplemento neuronal B27 (2%), 1 mL de suplemento N2 (1%), 20 μL de factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) de 100 ng/mL, reconstituir en albúmina sérica bovina (BSA) al 0,1% en solución salina tamponada con fosfato (PBS, concentración final 20 ng/mL), 20 μL de factor neurotrófico derivado de células gliales de 100 ng/mL (GDNF, reconstituir en solución salina equilibrada de Hanks estéril [HBSS], concentración final 20 ng/mL), 500 μL de 100 mg/mL de dibutiril-cAMP (reconstituir en DMSO), 70 μL de ácido ascórbico de 50 ng/mL (reconstituir en PBS estériles) y 1,5 mL de penicilina/estreptomicina. Realizar filtración estéril (unidades de filtro con un tamaño de poro de 0,22 μm). Medio precalentado en baño de perlas metálicas a 37 °C antes de su uso.
    NOTA: Estos medios se pueden almacenar a 4 °C, durante 1 mes.
  3. Reconstituir los reactivos Papain, DNase I y Ovomucoid necesarios para la disociación de la retina siguiendo el protocolo del fabricante. Alícuota 750 μL de papaína en tubos estériles de 1,5 ml, 75 μL de DNasa I en tubos estériles de 0,6 ml y 750 μL de inhibidor de la proteasa ovomucoide en tubos de 2 ml. Congele las alícuotas de papaína y DNasa I a -20 °C y mantenga las alícuotas ovomucoides a 4 °C para evitar la degradación de los reactivos. Descongelar a temperatura ambiente justo antes de su uso.
    NOTA: La papaína, la DNasa I y el ovomucoide se encuentran en un kit llamado Sistema de disociación de papaína (consulte la Tabla de materiales).
  4. Reconstituir poli-L-ornitina (Poly-O) y Laminina para el recubrimiento de la cubierta si se realiza el etiquetado inmunofluorescente siguiendo las instrucciones de la hoja de datos (Poly-O: 0,1 mg/ml en agua estéril; Laminina: diluir 1,2 mg/ml a 1:50 en DMEM). Alícuota Poly-O y Laminina (2,5 mL) y alícuotas congeladas a -20 °C. Descongelar a temperatura ambiente justo antes de su uso.
    NOTA: Paso 1.4. solo se requiere si se realiza el etiquetado inmunofluorescente y la microscopía de escaneo láser.

2. Extracción de ratones y tejidos

NOTA: Para estos estudios de reprogramación, el ratón Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl se creó cruzando un ratón Ascl1CreERT (Ascl1-CreERT: Jax # 012882) con un ratón tdTomatoSTOPfl/fl (B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J: Jax # 007914). Este ratón tiene un fondo mixto (C57BL/6, S129 y cepa ICR). El genotipo de este ratón se muestra en la Figura 1A. Todas las cepas se pueden utilizar para este protocolo.

  1. Use guantes y desinfecte el espacio de trabajo, incluido el microscopio de disección y todas las herramientas finas (fórceps curvas Dumont # 5 fine y Dumont # 7, tijeras finas y tijeras Vannas) con etanol al 70%. Desinfecte un plato de disección negra recubierto de silicona de 10 cm exponiéndolo a la luz UV durante 20 minutos.
  2. Preparación de platos y platos para la extracción de tejidos
    1. Prepare una placa de 24 pocillos para la recolección de ojos y la separación de muestras (dos ojos por ratón en un pozo, etiquetados con identificaciones de ratón) con ~ 1 ml de HBSS frío (4 ° C) por pozo. Coloque la placa de 24 pocillos sobre hielo.
    2. Llene una placa de Petri estéril de 10 cm (para lavar) y la placa de disección recubierta de silicona desinfectada con varios ml de HBSS frío (4 ° C) para asegurarse de que el tejido esté completamente cubierto con HBSS.
    3. Preparar un tubo estéril de 1,5 ml con 1 ml de etanol al 70%.
    4. Prepare una placa de cultivo de 12 pocillos etiquetando la placa con el número de cultivo, la fecha, la cepa y toda la información requerida.
  3. Sacrificar ratones P12 utilizando cualquier método aprobado.
  4. Extirpación de los ojos
    1. Sostenga suavemente la cabeza del mouse con el pulgar y el dedo índice alrededor del ojo.
    2. Usando pinzas curvas Dumont #7, vaya suavemente detrás del globo ocular y corte el nervio óptico. Saque con cuidado el ojo.
      NOTA: Si se usan ratones adultos, no use fórceps curvos y no tire del ojo. En su lugar, corte cuidadosamente alrededor del globo ocular con tijeras finas; corte el nervio óptico pero no corte el ojo en sí. Use fórceps para quitar cuidadosamente el globo ocular.
  5. Limpieza del globo ocular
    1. Sumerja el globo ocular brevemente en un tubo que contenga etanol para evitar el arrastre de bacterias del animal.
    2. Lave el globo ocular brevemente en la placa de Petri de 10 cm antes de colocarlo en la placa de 24 pocillos sobre hielo.
  6. Repita los pasos 2.4 y 2.5 para los otros ojos. Mantenga la placa del pozo en el hielo durante el proceso. Coloque dos ojos de un animal en el plato de disección colocado bajo un microscopio de disección con una fuente de luz.
  7. Extracción de retina
    1. Fije un globo ocular agarrando el nervio óptico y el tejido conectivo circundante alrededor de la esclerótica con fórceps finos Dumont # 5 y presiónelo cuidadosamente contra el plato de disección (córnea hacia arriba).
    2. Haga un agujero en el centro de la córnea con una aguja de 30 G para permitir un acceso más fácil para las tijeras Vannas.
    3. Diseccionar la córnea alrededor del cuerpo ciliar usando tijeras Vannas y extirpar la córnea, el cristalino, el iris y el cuerpo vítreo con cuidado con las pinzas finas Dumont #5. La figura 2A ilustra una copa del ojo con la retina dentro.
    4. Diseccionar la esclerótica con tijeras Vannas hasta alcanzar el nervio óptico. Recorte el nervio óptico y extraiga cuidadosamente la retina usando fórceps finos Dumont #5.
    5. Use un segundo par de fórceps finos Dumont # 5 para empujar contra la retina y permitir la eliminación completa del cuerpo vítreo. La figura 2B ilustra dos retinas extraídas.
  8. Transferir y lavar
    1. Corte unos 2,5 cm de la punta de una pipeta de transferencia estéril para ampliar el diámetro. Con este consejo, recoja (aspire) retinas enteras sin dañar el tejido.
    2. Transfiera las retinas a una nueva placa de Petri estéril con HBSS frío (4 °C) y balancee la placa (hacia adelante y hacia atrás, izquierda y derecha).
    3. Usando la punta de la pipeta de transferencia, empuje cuidadosamente las retinas para lavar las células epiteliales pigmentarias de la retina (EPR).
      NOTA: Alternativamente, toda la retina con lente y cuerpo vítreo se puede extraer de la copa del ojo. Luego, el cristalino y el cuerpo vítreo se pueden extraer de la retina extraída. Si la retina está rasgada, asegúrese de recoger todas las piezas para su disociación; de lo contrario, habrá cantidades insuficientes de tejido para hacer crecer capas celulares confluentes.
  9. Coloque inmediatamente la retina aislada en un pozo nuevo y limpio de la placa de 24 pocillos llena de 1 ml de HBSS. Mantenga la placa de 24 pocillos en el hielo durante el proceso de disección.
  10. Repita los pasos 2.7-2.9 para aislar la segunda retina.

3. Disociación de la retina

NOTA: Todos los pasos siguientes (hasta la recolección celular) deben llevarse a cabo en un gabinete de bioseguridad A2 o B2 (BSC).

  1. Prepare la mezcla de disociación Papaína/DNasa I de la siguiente manera.
    1. Para seis retinas, añadir 75 μL de DNasa I en el tubo que contiene 750 μL de papaína (a partir del paso 1.3) y mezclar con cuidado (mezcla de disociación).
    2. Para la preparación de muestras individuales que se requieren para este protocolo, divida el volumen total de 825 μL en tres alícuotas: 275 μL de la mezcla en un tubo de 1,5 ml por ratón (dos retinas). Calcule las cantidades requeridas de DNasa I y Papaína en consecuencia.
      NOTA: Se pueden disociar hasta seis retinas en un tubo de mezcla de papaína/DNasa I. Sin embargo, la preparación de muestras individuales da como resultado menos grupos y un mejor crecimiento celular que en muestras combinadas.
  2. Transfiera dos retinas a la mezcla de disociación Papaína/DNasa I. Use una pipeta de transferencia con un diámetro de punta agrandado (paso 2.8.1), recoja las retinas, espere hasta que las retinas se asienten en la parte inferior de la punta y luego libere las retinas sin exceso de HBSS en el tubo que contiene la mezcla de papaína / DNasa I.
  3. Colocar en un nutator e incubarlo durante 10 min en una incubadora de cultivo celular (37 °C, 5% CO2).
  4. Disociar las células canalizando cuidadosamente hacia arriba y hacia abajo (aproximadamente 20-30 veces) con una pipeta de 1 ml. Después de que las células se disocien (es decir, que resulten en una solución homogénea sin trozos), agregue 275 μL de inhibidor de la proteasa ovomucoide del kit de disociación de papaína para neutralizar la papaína. Mezclar suavemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo.
    NOTA: Si se disociaron seis retinas en 825 μL de mezcla de papaína/DNasa I, se requieren 825 μL de ovomucoide.
  5. Centrifugar la mezcla a 300 x g durante 10 min a 4 °C.
  6. Añadir el factor de crecimiento epidérmico (EGF, 1 μL por 1 mL del medio de crecimiento, reconstituido a 200 μg/mL en PBS) al volumen calculado del medio de crecimiento (1 mL por ratón) precalentado a 37 °C.
    NOTA: Dependiendo del diseño experimental, el marcador de proliferación 5-etinil-2'-desoxiuridina (EdU), así como el 4-hidroxitamoxifeno (4-OHT) u otros factores requeridos se pueden agregar al comienzo del período de cultivo.
  7. Retire los tubos con cuidado de la centrífuga. No toque el pellet en la parte inferior del tubo.
  8. Retire el sobrenadante con cuidado y por completo. Resuspend el pellet celular con 500 μL de medio de crecimiento suplementado con EGF.
  9. Transfiera la suspensión celular a un pocillo de la placa de 12 pocillos etiquetada (Figura 2C). Enjuague el tubo con otros 500 μL del medio de crecimiento suplementado con EGF y agréguelo al pozo (volumen total de 1 ml por pozo).
  10. Repita los pasos 3.8 y 3.9 con todas las demás muestras.
  11. Balancee la placa del pozo tres veces con cuidado (hacia adelante y hacia atrás; izquierda y derecha). Coloque la placa en la incubadora (37 °C, CO2).
    NOTA: Si se utilizan ratones transgénicos, realice el genotipado para cada animal (Figura 2D). Identifique los ratones Cre recombinas positivos y negativos y etiquete la placa en consecuencia. Para este protocolo, solo se utilizaron células de ratones reporteros positivos de Cre recombinasa para los siguientes pasos. Las células de muestras de Cre negativo se congelan y se utilizan para otras aplicaciones.

4. Fase de crecimiento

NOTA: La fase de crecimiento tiene una duración de aproximadamente 4-5 días (Figura 1B). Para agregar líquidos a los pozos que contienen células, la pipeta debe apuntar a la pared del pozo y el líquido debe liberarse lentamente para evitar el desprendimiento de la célula. No pipetee directamente sobre las células.

  1. Un día después de la disociación, retire el medio y agregue 1 ml de medio de crecimiento fresco suplementado con EGF.
  2. El día 3, retire el medio y agregue 1 ml de HBSS (temperatura ambiente) para eliminar los desechos celulares. Balancea suavemente hacia adelante y hacia atrás de izquierda a derecha. Retire el HBSS, repita el paso de lavado y agregue 1 ml de medio de crecimiento suplementado con EGF precalentado.
  3. Monitoree las células todos los días y evalúe su estado de crecimiento hasta que las células alcancen una confluencia del 90% al 100%. La Figura 3 muestra un ejemplo de buen crecimiento de MG a lo largo del tiempo. Comprobar si hay una posible contaminación o muerte celular (Figura suplementaria 1). Deseche los cultivos contaminados.
    NOTA: Para monitorear y registrar el estado de la célula, tome imágenes a varios aumentos usando un microscopio de luz con una cámara conectada y objetivos 4x, 10x o 20x. En este estudio, se utiliza un microscopio de fluorescencia.

5. Preparación de fundas con poli-L-ornitina (Poly-O) y capa de laminina

NOTA: Este paso solo es necesario si se realiza el etiquetado inmunofluorescente y la microscopía de barrido láser confocal. Se requieren cubiertas redondas de vidrio (12 mm de diámetro) para obtener imágenes adecuadas. El protocolo de recubrimiento también se puede encontrar en la hoja de datos del medio neuronal (consulte la Tabla de materiales).

  1. Coloque las fundas estériles cuidadosamente en el centro de cada pozo de una placa de 24 pocillos con pinzas #2AP Estériles Dumont.
    NOTA: Coloque los cubrehojas en el centro del pozo. Colocar cubiertas cerca de la pared de un pozo causará problemas de tensión superficial para los siguientes pasos.
  2. Descongele una alícuota poly-O de 2,5 ml a temperatura ambiente y coloque 100 μL de ella en el centro de cada funda.
  3. Incubar la placa del pozo durante 30 min en una incubadora de 37 °C.
  4. Retire Poly-O y lave el pozo con la funda tres veces con ~ 1 ml de agua estéril.
  5. Deje que la placa del pozo se seque durante la noche en el BSC. Descongelar 2,5 ml de laminina a 4 °C durante la noche.
  6. A la mañana siguiente, agregue 100 μL de Laminina en el centro de cada funda e incube durante 4 h en una incubadora de 37 ° C.
  7. Retire la laminina con cuidado y por completo.
  8. Mantenga la placa a 4 °C si no se puede realizar el pasaje inmediatamente.
    NOTA: Los recubiertos de las placas preparadas se pueden mantener durante unos días a 4 °C.

6. Paso celular para eliminar sobrevivientes neuronales

NOTA: El paso celular es necesario para eliminar las células neuronales, no para aumentar la población celular. La glía se divide solo unas pocas veces y no crecerá más después del paso. No diluya las suspensiones celulares. Las células de un pozo confluente de una placa de 12 pocillos se pueden distribuir en un pozo de una placa de 12 pocillos o dos pocillos de una placa de 24 pocillos. Cuando se utilizan fundas recubiertas, solo alrededor de un tercio de la cubierta está recubierta. Por lo tanto, se pueden obtener seis hojas de cubierta en una placa de 24 pocillos, con células confluentes (~ 80% -90%) de un pozo de células confluentes de una placa de 12 pocillos. También se pueden elegir otras proporciones para aumentar o disminuir la densidad celular. Para este protocolo, se utiliza un ratón reportero Cre+ [un experimento, dos tratamientos: miR-25 o control-miR; réplicas técnicas n = 3 (tres coverslips por tratamiento), replicación biológica n = 1]. El número de réplicas técnicas y biológicas se puede definir de manera diferente dependiendo del diseño experimental.

  1. Compruebe si las células son 90%-100% confluentes (también en el margen del pozo; Figura 3E,F).
  2. Retire el medio y agregue 1 ml de HBSS (temperatura ambiente) para lavar. Mece suavemente el plato (hacia adelante y hacia atrás, izquierda y derecha). Elimine HBSS por completo.
  3. Agregue 500 μL de una solución que contenga tripsina precalentada (precalentada a 37 °C en un baño de perlas de metal) para separar las células del pozo. Balancee suavemente (hacia adelante y hacia atrás, de izquierda a derecha) e incube durante 2 min en una incubadora de 37 °C.
  4. Mueva la placa de la incubadora al BSC. Mientras se inclina, aspire la solución que contiene tripsina y disperse con cuidado y lentamente sobre el pozo varias veces hasta que las células se desprendan por completo. Sostenga la placa contra la luz y asegúrese de que no queden células en la parte inferior.
  5. Transfiera esta suspensión celular a un tubo estéril de 1,5 ml. Centrifugar a 300 x g durante 8 min a 4 °C.
  6. Retire el sobrenadante y resuspenda cuidadosamente el pellet celular agregando 600 μL (100 μL por pocillo para 6 pocillos / fundas) de medio de crecimiento precalentado (complementado con EGF; 1: 1000). y pipetear hacia arriba y hacia abajo ~ 30-40 veces.
    NOTA: Las células se pueden congelar en este momento a -80 °C o en nitrógeno líquido y descongelar siguiendo los protocolos estándar para descongelar líneas celulares. Si las células se congelan, no se resuspendirán en medio suplementado con EGF (medio de crecimiento). Se resuspendirán en medio básico (sin EGF) y solución de congelación (relación 1/1). Los pasos 6.1.1 a 6.6.2 describen los pasos para congelar las células. Si no hay celdas congeladas, continúe con el paso 6.7.
    1. Preparar la solución de congelación mezclando 100 μL de DMSO y 400 μL de FBS (volumen total de 500 μL por pocillo/muestra).
    2. Resuspend el pellet celular en 500 μL de medio de crecimiento precalentado. Añadir la suspensión celular a 500 μL de solución de congelación DMSO/FBS (volumen total de 1 ml). Mantenga los tubos en hielo hasta que se procesen todas las muestras. Congelar las células a -20 °C durante 1 h y, a continuación, conservar a -80 °C.
  7. Células de semilla colocando 100 μL de la suspensión de células/medios de 600 μL (paso 6.6) en el centro de seis fundas recubiertas (ver paso 5) de la placa de 24 pocillos. Coloque la placa con cuidado en la incubadora y deje que las células se asienten.
    NOTA: 100 μL de la suspensión celular de 600 μL (cosechada de un pocillo de una placa de 12 pocillos) dará como resultado una confluencia celular del 90%-100%, que se requiere para la transfección.
  8. Compruebe las celdas después de 3 h para ver si se han asentado en el cubrehojas. Añadir 400 μL de medio de crecimiento suplementado con EGF.
    NOTA: Las células generalmente están listas para la transfección al día siguiente (Figura 3G). Si no son confluentes (90%-100%), déjalos para otro día. Si aún no son confluentes, no los use para la transfección. Si se realizan otras aplicaciones aguas abajo, como el perfil de miRNA, RNA-Seq, RT-qPCR o western blot, las células deben pasarse a placas de 12 pocillos (proporción 1: 1; no se requiere tratamiento de placas) y cosecharse para la extracción de ARN / proteína.

7. Transfección

NOTA: La fase de transfección consiste en una fase de 3 h solo en medio de transfección (los procedimientos de transfección se describen en el manual de transfección que viene con el reactivo de transfección) y una fase alargada en la que el reactivo de transfección y los miRNAs todavía están presentes, pero se agrega un medio neuronal con los suplementos requeridos (la duración total es de 2 días; Figura 1B). En este protocolo se transfectarán seis pozos: tres pozos recibirán el miRNA miR-25 de reprogramación y tres pozos recibirán el miRNA de control.

  1. Compruebe si las células alcanzaron el 90% de confluencia y registre/obtenga una imagen de las células antes de la transfección.
  2. Retire el medio de crecimiento y agregue 500 μL de HBSS (temperatura ambiente) para lavar las células.
  3. Retire el HBSS y agregue 400 μL de medio sérico reducido utilizado para las transfecciones. Vuelva a colocar la placa en una incubadora de 37 °C.
  4. Prepare la mezcla de transfección siguiendo las instrucciones del protocolo de reactivo de transfección del fabricante. Haga dos mezclas: mezcla de reactivos de transfección y mezcla de miRNA (ver Figura 1B para ilustración).
    1. Preparar la mezcla de reactivos de transfección: Para una placa de 24 pocillos, se requieren 49 μL de medio sérico reducido y 1 μL de reactivo de transfección para un pocillo (50 μL en total). Para seis pocillos, 294 μL de medio sérico reducido y 6 μL de reactivo de transfección se combinan y mezclan bien mediante el pipeteo suave hacia arriba y hacia abajo.
    2. Preparar la mezcla mímica de miRNA: Para una placa de 24 pocillos, se requiere un volumen total de 50 μL de la mezcla mímica para un pozo. Tres pozos recibirán el miRNA de control y los otros tres pozos serán tratados con miR-25. Para este protocolo, se utiliza una concentración final de 200 nM.
      1. Para el tratamiento con miR-25 (tres pocillos), se combinan y mezclan bien 150 μL de medio sérico reducido y 3 μL de imitadores de miR-25 (solución madre de 100 μM) y se mezclan bien mediante el pipeteo suave hacia arriba y hacia abajo. Incubar durante 5 min.
        Para el tratamiento de imitadores de control (tres pocillos), 150 μL de medio sérico reducido y 3 μL de imitadores de miARN de control (solución madre de 100 μM) se combinan y mezclan bien canalizando suavemente hacia arriba y hacia abajo. Incubar durante 5 min.
        NOTA: El volumen de imitadores de miRNA depende del factor de dilución y la concentración necesaria (20-500 nM). También se pueden usar inhibidores de miRNA (antagomiRs) u otras moléculas, incluidos los plásmidos. Además, las combinaciones de moléculas son posibles de ser transfectadas.
  5. Combine la mezcla imitadora de miRNA y la mezcla de reactivos de transfección. Mezclar con cuidado pipeteando lenta y completamente mediante el pipeteo suave hacia arriba y hacia abajo. Incubar durante 20 min a temperatura ambiente (según las instrucciones del fabricante).
  6. Agregue la mezcla de transfección anterior gota a gota y lentamente sobre las células, cerca de la superficie del medio en el pozo utilizando una pipeta de 20 μL. Balancee el plato suavemente (hacia adelante y hacia atrás, de izquierda a derecha).
  7. Incubar en una incubadora de 37 °C durante 3 h.
  8. Después de 3 h, agregue medio neuronal a los pocillos (500 μL por pozo) suplementado con 4-hidroxitamoxifeno (stock de 5 mM reconstituido con 2,58 mL de etanol, concentración final de 250 nM) para activar la recombinasa cre y 5-etinil-2'-desoxiuridina (EdU, solución madre de 10 mM reconstituida con 2 ml de DMSO, concentración final de 1 μM) para rastrear la proliferación celular.
    PRECAUCIÓN: Se sabe que el 4-hidroxitamoxifeno y la EdU son carcinógenos humanos, teratógenos y mutágenos. Lea la hoja de datos de seguridad del material antes de usar y use guantes, gafas y bata de laboratorio. Reconstituya ambos reactivos de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. No inhale la sustancia/mezcla. Cierre hermético después de su uso. El material de desecho debe eliminarse siguiendo las regulaciones nacionales y locales. Lávese las manos y la cara después de trabajar con la sustancia.
  9. Incubar en una incubadora de 37 °C durante 2 días (Figura 1B).

8. Conversión de celdas

NOTA: La fase de conversión celular tiene una duración de aproximadamente 5-6 días (Figura 1B), pero son posibles períodos más largos.

  1. Revise las células diariamente para detectar la inducción exitosa de la expresión de tdTomato, la posible muerte celular y / o la contaminación. La densidad celular no cambia (Figura 4). Las primeras células rojas marcadas con fluorescentes débiles se pueden observar 1 día después del tratamiento con 4-hidroxitamoxifeno. Se requiere un microscopio fluorescente para monitorear y obtener imágenes de las células.
    NOTA: En este estudio, se utiliza un microscopio de fluorescencia para imágenes en vivo. Las imágenes se toman con objetivos de 4x, 10x o 20x.
  2. Dos días después de la transfección, retire el medio y agregue 500 μL de medio neuronal precalentado suplementado con 4-hidroxitamoxifeno y EdU en cada pozo.
  3. Reemplace el medio con un medio fresco cada dos días hasta que se recolecten las células.
  4. Tome imágenes en vivo para la evaluación y evaluación del número de células fluorescentes rojas (que expresan Ascl1) y sus cambios morfológicos (Figura 4 y Figura 5A-C).

9. Cosecha celular: fijación para el etiquetado inmunofluorescente

NOTA: Las células se pueden cosechar para otras aplicaciones posteriores, incluidas las de carga masiva o scRNA-Seq, RT-qPCR o western blot.

  1. Retire el medio y agregue 500 μL de HBSS frío (4 °C) por pozo y balancee la placa suavemente (hacia adelante y hacia atrás, de izquierda a derecha). Elimine el HBSS.
  2. Fije las células agregando 500 μL de paraformaldehído al 2% (PFA) e incube durante 20 minutos a temperatura ambiente.
  3. Realizar el etiquetado inmunofluorescente según los protocolos establecidos.

Resultados

Este protocolo describe cómo cultivar MG a partir de retinas de ratón P12 y cómo reprogramar estas células con miR-25 en neuronas retinianas utilizando el ratón reportero Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl RPC. Este método fue utilizado en trabajos previos reportando en detalle otros miRNAs adecuados (imitadores o inhibidores, como moléculas individuales o en combinación) para reprogramar MG en RPC que luego adoptan características celulares neuronales27. Este m?...

Discusión

Este protocolo describe cómo cultivar MG a partir de retinas de ratón disociadas para estudios de reprogramación utilizando miRNAs. Como se muestra y confirma en una variedad de estudios previos, la gran mayoría (80%-90%) de las células encontradas en estos cultivos son MG 20,23,24. Este método es una técnica muy robusta y fiable y los resultados se pueden reproducir fácilmente si se sigue correctamente el protocolo

Divulgaciones

La Universidad de Washington ha solicitado una patente que incluye algunos de los hallazgos de este informe con los inventores Nikolas Jorstad, Stefanie G. Wohl y Thomas A. Reh. La patente se titula "Métodos y composiciones para estimular la regeneración de la retina.

Agradecimientos

Los autores agradecen a la Dra. Ann Beaton y a todos los miembros del laboratorio por su aporte sobre el manuscrito. Tom Reh, Julia Pollak y Russ Taylor por presentar los cultivos primarios de MG como una herramienta de detección a S.G.W. durante la capacitación postdoctoral en la Universidad de Washington en Seattle. El estudio fue financiado por la subvención del Programa de Innovación Empire (EIP) a S.G.W. y fondos de puesta en marcha de SUNY Optometry a S.G.W., así como el premio R01EY032532 del National Eye Institute (NEI) a S.G.W.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Animals
Ascl1-CreERT mouse Ascl1tm1.1(Cre/ERT2)Jejo/JJax laboratories#012882Ascl1-CreERT mice were crossed with tdTomato mice
tdTomato-STOPfl/fl mouse  B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/JJax laboratories#007914Genotyping is requried to identify Ascl1CreER positive mice
Reagents
(Z)-4-Hydroxytamoxifen, ≥98% Z isomerSigma-AldrichH7904-5MGreconstituted in ethanol, frozen aliquots
16 % Paraformaldehyde (PFA) aqueous solutionVWR100504-7822% PFA made with Phosphate-buffered saline (PBS), frozen aliquots
Alexa Fluor 488 - AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch Laboratories711-546-152dilution 1:500
Alexa Fluor 647 - AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Goat IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch Laboratories705-606-147dilution 1:500
Anti-human Otx2 Antibody, R&D SystemsFisher ScientificAF1979dilution 1:500
Anti-rabbit MAP2 antibodySigma-AldrichM9942-200ULdilution 1:250
Anti-Red Fluorescent Protein (RFP) antibodyAntibodies-OnlineABIN334653dilution 1:500
Ascorbic AcidSTEMCELL Technologies72132reconstituted in PBS, frozen aliquots
B-27 SupplementFisher Scientific17-504-044frozen aliquots
Brain Phys Neuronal MediumSTEMCELL Technologies05790used as neuronal medium in section 1.2, store at 4 °C (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831.
1643231638-1407032920.163831
5521&_gac=1.124727416.1643
231640.Cj0KCQiA_8OPBhDtAR
IsAKQu0gbfxhGZMTOU9mHFY
dHNsuLirnQzunvMEuS9wA08uY
-26yfSbGvNhHEaArodEALw_wcB)
Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging KitFisher ScientificC10340reconstitute following manual, 4°C
Dibutyryl-cAMPSTEMCELL Technologies73886reconstituted in Dimethyl sulfoxide (DMSO), frozen aliquots
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)Fisher ScientificMT-25950CQC
Fetal Bovine Serum (FBS)Fisher ScientificMT35010CVfrozen aliquots
Gibco Opti-MEM Reduced Serum Medium, GlutaMAX SupplementFisher Scientific51-985-034store at 4 °C
Gibco TrypLE Express Enzyme (1X), phenol redFisher Scientific12-605-028used as solution containing trypsin, store at 4 °C
HBSSFisher Scientific14-025-134store at 4 °C
Laminin mouse protein, naturalFisher Scientific23-017-015

frozen aliquots, (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831.
1643231638-1407032920.163831
5521&_gac=1.124727416.164323
1640.Cj0KCQiA_8OPBhDtARIsA
KQu0gbfxhGZMTOU9mHFYdHN
suLirnQzunvMEuS9wA08uY-
26yfSbGvNhHEaArodEALw_wcB)

L-GlutamineFisher Scientific25-030-081frozen aliquots
miRIDIAN microRNA Mimic Negative ControlHorizonCN-001000-01-50reconstituted in RNase free water (200 µM), frozen aliquots
miRIDIAN microRNA Mouse mmu-miR-25-3p mimicHorizonC-310564-05-0050reconstituted in RNase free water (200 µM), frozen aliquots
N-2 SupplementFisher Scientific17-502-048frozen aliquots
Neurobasal MediumFisher Scientific21-103-049used for growth medium in section 1.1, store at 4 °C
Papain Dissociation SystemWorthington BiochemicalLK003153reconstituted in Earle's Balanced Salt Solution, frozen aliquots
Penicillin StreptomycinFisher Scientific15-140-122frozen aliquots
Phosphate-buffered saline (PBS)Fisher Scientific20-012-043
Poly-L-ornithine hydrobromideSigma-AldrichP4538-50MGreconstituted in steriled water, frozen aliquots
Recombinant Human BDNF ProteinR&D Systems248-BDB-050/CFreconstituted in steriled PBS and FBS, frozen aliquots
Recombinant Mouse EGF ProteinFisher Scientific2028EG200reconstituted in steriled PBS, frozen aliquots
Recombinant Rat GDNF ProteinFisher Scientific512GF010reconstituted in steriled PBS, frozen aliquots
Rhodamine Red 570 - AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rat IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch Laboratories712-296-150dilution 1:1,000
Slide Mounting MediumFisher ScientificOB100-01
Transfection Reagent (Lipofectamine 3000)Fisher ScientificL3000015store at 4 °C
plasticware/supplies
0.6 mL microcentrifuge tubeFisher Scientific50-408-120
1.5 mL microcentrifuge tubeFisher Scientific50-408-129
10 µL TIP  sterile filter  Pipette TipsFisher Scientific02-707-439
100 µL TIP  sterile filter Pipette TipsFisher Scientific02-707-431
1000 µL TIP sterile filter Pipette TipsFisher Scientific02-707-404
2.0 mL microcentrifuge tubeFisher Scientific50-408-138
20 µL TIP  sterile filter Pipette TipsFisher Scientific02-707-432
Adjustable-Volume Pipettes (2.5, 10, 20, 100, 200, & 1000 µL)Eppendorf2231300008
Disposable Transfer PipetsFisher Scientific13-669-12
Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, No. of Wells=12Fisher Scientific08-772-29
Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, No. of Wells=24Fisher Scientific08-772-1
PIPET  sterile filter 10ML Disposable Serological PipetsFisher Scientific13-676-10J
PIPET  sterile filter 50ML Disposable Serological PipetsFisher Scientific13-676-10Q
PIPET  sterile filter 5ML Disposable Serological PipetsFisher Scientific13-676-10H
Powder-Free Nitrile Exam GlovesFisher Scientific19-130-1597B
Round coverslips (12 mm diameter, 0.17 - 0.25 mm thickness)Fisher Scientific22293232
Vacuum Filter, Pore Size=0.22 µmFisher Scientific09-761-106
equipment
1300 B2 Biosafety cabinetThermo Scientific1310
All-in-one Fluorescence Microscope Keyence BZ-X 810Keyence9011800000
Binocular Zoom Stereo MicroscopeVision ScientificVS-1EZ-IFR07
Disposable Petri Dishes (100 mm diameter)VWR25384-088
Dumont #5 Forceps - Biologie/TitaniumFine Science Tools11252-40
Dumont #55 Forceps - Biologie/InoxFine Science Tools11255-20
Dumont #7 curved Forceps - Biologie/TitaniumFine Science Tools11272-40
Eppendorf Centrifuge 5430 REppendorf2231000508
Fine Scissors-sharpFine Science Tools14058-11
McPherson-Vannas Scissors, 8 cmWorld Precision Instruments14124
Metal bead bathLab Armor74309-714
Nutating Mixer, Electrical=115V, 60Hz, Speed=24 rpmVWR82007-202
Silicone coated dissection Petri Dish (90 mm diameter)Living Systems InstrumentationDD-ECON-90-BLK-5PK
Tweezers, economy #5World Precision Instruments501979
Water Jacketed CO2 IncubatorVWR10810-744

Referencias

  1. Jadhav, A. P., Roesch, K., Cepko, C. L. Development and neurogenic potential of Müller glial cells in the vertebrate retina. Progress in Retinal and Eye Research. 28 (4), 249-262 (2009).
  2. Roesch, K., et al. The transcriptome of retinal Müller glial cells. The Journal of Comparative Neurology. 509 (2), 225-238 (2008).
  3. Goldman, D. Müller glial cell reprogramming and retina regeneration. Nature Reviews. Neuroscience. 15 (7), 431-442 (2014).
  4. Konar, G. J., Ferguson, C., Flickinger, Z., Kent, M. R., Patton, J. G. miRNAs and Muller Glia Reprogramming During Retina Regeneration. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 632632 (2020).
  5. Karl, M. O., Reh, T. A. Regenerative medicine for retinal diseases: activating endogenous repair mechanisms. Trends in Molecular Medicine. 16 (4), 193-202 (2010).
  6. Wilken, M. S., Reh, T. A. Retinal regeneration in birds and mice. Current Opinion in Genetics and Development. 40, 57-64 (2016).
  7. Fausett, B. V., Gumerson, J. D., Goldman, D. The proneural basic helix-loop-helix gene ascl1a is required for retina regeneration. The Journal of Neuroscience. 28 (5), 1109-1117 (2008).
  8. Ramachandran, R., Fausett, B. V., Goldman, D. Ascl1a regulates Müller glia dedifferentiation and retinal regeneration through a Lin-28-dependent, let-7 microRNA signalling pathway. Nature Cell Biology. 12 (11), 1101-1107 (2010).
  9. Brzezinski, J. A. t., Kim, E. J., Johnson, J. E., Reh, T. A. Ascl1 expression defines a subpopulation of lineage-restricted progenitors in the mammalian retina. Development. 138 (16), 3519-3531 (2011).
  10. Jeon, C. J., Strettoi, E., Masland, R. H. The major cell populations of the mouse retina. The Journal of Neuroscience. 18 (21), 8936-8946 (1998).
  11. Del Rio, P., et al. GDNF-induced osteopontin from Muller glial cells promotes photoreceptor survival in the Pde6brd1 mouse model of retinal degeneration. Glia. 59 (5), 821-832 (2011).
  12. Pena, J., et al. Controlled microenvironments to evaluate chemotactic properties of cultured Muller glia. Experimental Eye Research. 173, 129-137 (2018).
  13. Pena, J. S., Vazquez, M. VEGF Upregulates EGFR expression to stimulate chemotactic behaviors in the rMC-1 model of Muller glia. Brain Sciences. 10 (6), 330 (2020).
  14. Ueki, Y., Reh, T. A. EGF stimulates Müller glial proliferation via a BMP-dependent mechanism. Glia. 61 (5), 778-789 (2013).
  15. Zhang, X., Feng, Z., Li, C., Zheng, Y. Morphological and migratory alterations in retinal Muller cells during early stages of hypoxia and oxidative stress. Neural Regeneration Research. 7 (1), 31-35 (2012).
  16. Sheline, C. T., Zhou, Y., Bai, S. Light-induced photoreceptor and RPE degeneration involve zinc toxicity and are attenuated by pyruvate, nicotinamide, or cyclic light. Molecular Vision. 16, 2639-2652 (2010).
  17. Wang, M., Ma, W., Zhao, L., Fariss, R. N., Wong, W. T. Adaptive Muller cell responses to microglial activation mediate neuroprotection and coordinate inflammation in the retina. Journal of Neuroinflammation. 8, 173 (2011).
  18. Pereiro, X., Miltner, A. M., La Torre, A., Vecino, E. Effects of adult muller cells and their conditioned media on the survival of stem cell-derived retinal ganglion cells. Cells. 9 (8), 1759 (2020).
  19. Xia, X., Teotia, P., Patel, H., Van Hook, M. J., Ahmad, I. Chemical induction of neurogenic properties in mammalian Muller glia. Stem Cells. 39 (8), 1081-1090 (2021).
  20. Pollak, J., et al. ASCL1 reprograms mouse Müller glia into neurogenic retinal progenitors. Development. 140 (12), 2619-2631 (2013).
  21. Wohl, S. G., Reh, T. A. miR-124-9-9* potentiates Ascl1-induced reprogramming of cultured Muller glia. Glia. 64 (5), 743-762 (2016).
  22. Ueki, Y., et al. Transgenic expression of the proneural transcription factor Ascl1 in Müller glia stimulates retinal regeneration in young mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (44), 13717-13722 (2015).
  23. Ueki, Y., et al. P53 is required for the developmental restriction in Müller glial proliferation in mouse retina. Glia. 60 (10), 1579-1589 (2012).
  24. Wohl, S. G., Reh, T. A. The microRNA expression profile of mouse Muller glia in vivo and in vitro. Scientific Reports. 6, 35423 (2016).
  25. Zuzic, M., Rojo Arias, J. E., Wohl, S. G., Busskamp, V. Retinal miRNA functions in health and disease. Genes (Basel). 10 (5), 377 (2019).
  26. Jorstad, N. L., et al. Stimulation of functional neuronal regeneration from Muller glia in adult mice. Nature. 548 (7665), 103-107 (2017).
  27. Wohl, S. G., Hooper, M. J., Reh, T. A. MicroRNAs miR-25, let-7 and miR-124 regulate the neurogenic potential of Muller glia in mice. Development. 146 (17), 179556 (2019).
  28. Hauck, S. M., Suppmann, S., Ueffing, M. Proteomic profiling of primary retinal Muller glia cells reveals a shift in expression patterns upon adaptation to in vitro conditions. Glia. 44 (3), 251-263 (2003).
  29. Merl, J., Ueffing, M., Hauck, S. M., von Toerne, C. Direct comparison of MS-based label-free and SILAC quantitative proteome profiling strategies in primary retinal Muller cells. Proteomics. 12 (12), 1902-1911 (2012).
  30. Buchsbaum, I. Y., et al. ECE2 regulates neurogenesis and neuronal migration during human cortical development. EMBO Reports. 21 (5), 48204 (2020).
  31. Eliscovich, C., Shenoy, S. M., Singer, R. H. Imaging mRNA and protein interactions within neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (10), 1875-1884 (2017).
  32. Wohl, S. G., Jorstad, N. L., Levine, E. M., Reh, T. A. Muller glial microRNAs are required for the maintenance of glial homeostasis and retinal architecture. Nature Communications. 8 (1), 1603 (2017).
  33. Yamamoto, H., Kon, T., Omori, Y., Furukawa, T. Functional and evolutionary diversification of Otx2 and Crx in vertebrate retinal photoreceptor and bipolar cell development. Cell Reports. 30 (3), 658-671 (2020).
  34. Kaufman, M. L., et al. Initiation of Otx2 expression in the developing mouse retina requires a unique enhancer and either Ascl1 or Neurog2 activity. Development. 148 (12), (2021).
  35. Emerson, M. M., Cepko, C. L. Identification of a retina-specific Otx2 enhancer element active in immature developing photoreceptors. Developmental Biology. 360 (1), 241-255 (2011).
  36. Ghinia Tegla, M. G., et al. OTX2 represses sister cell fate choices in the developing retina to promote photoreceptor specification. eLife. 9, 54279 (2020).
  37. Brzezinski, J. A. t., Lamba, D. A., Reh, T. A. Blimp1 controls photoreceptor versus bipolar cell fate choice during retinal development. Development. 137 (4), 619-629 (2010).
  38. Brzezinski, J. A. t., Uoon Park, K., Reh, T. A. Blimp1 (Prdm1) prevents re-specification of photoreceptors into retinal bipolar cells by restricting competence. Developmental Biology. 384 (2), 194-204 (2013).
  39. Kim, H. T., et al. Mitochondrial protection by exogenous Otx2 in mouse retinal neurons. Cell Reports. 13 (5), 990-1002 (2015).
  40. Nishida, A., et al. Otx2 homeobox gene controls retinal photoreceptor cell fate and pineal gland development. Nature Neuroscience. 6 (12), 1255-1263 (2003).
  41. Nelson, B. R., et al. Genome-wide analysis of Muller glial differentiation reveals a requirement for Notch signaling in postmitotic cells to maintain the glial fate. PLoS One. 6 (8), 22817 (2011).
  42. VandenBosch, L. S., et al. Developmental changes in the accessible chromatin, transcriptome and Ascl1-binding correlate with the loss in Muller Glial regenerative potential. Scientific Reports. 10 (1), 13615 (2020).
  43. Clark, B. S., et al. Single-cell RNA-seq analysis of retinal development identifies NFI factors as regulating mitotic exit and late-born cell specification. Neuron. 102 (6), 1111-1126 (2019).
  44. Lewis, G. P., Fisher, S. K. Up-regulation of glial fibrillary acidic protein in response to retinal injury: its potential role in glial remodeling and a comparison to vimentin expression. International Review of Cytology. 230, 263-290 (2003).
  45. Luna, G., Lewis, G. P., Banna, C. D., Skalli, O., Fisher, S. K. Expression profiles of nestin and synemin in reactive astrocytes and Muller cells following retinal injury: a comparison with glial fibrillar acidic protein and vimentin. Molecular Vision. 16, 2511-2523 (2010).
  46. Pogue, A. I., et al. Micro RNA-125b (miRNA-125b) function in astrogliosis and glial cell proliferation. Neuroscience Letters. 476 (1), 18-22 (2010).
  47. Wohl, S. G., Schmeer, C. W., Friese, T., Witte, O. W., Isenmann, S. In situ dividing and phagocytosing retinal microglia express nestin, vimentin, and NG2 in vivo. PLoS One. 6 (8), 22408 (2011).
  48. Takamori, Y., et al. Nestin-positive microglia in adult rat cerebral cortex. Brain Research. 1270, 10-18 (2009).
  49. Alliot, F., Rutin, J., Leenen, P. J., Pessac, B. Pericytes and periendothelial cells of brain parenchyma vessels co-express aminopeptidase N, aminopeptidase A, and nestin. Journal of Neuroscience Research. 58 (3), 367-378 (1999).
  50. Dore-Duffy, P., Katychev, A., Wang, X., Van Buren, E. CNS microvascular pericytes exhibit multipotential stem cell activity. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 26 (5), 613-624 (2006).
  51. Mokry, J., et al. Expression of intermediate filament nestin in blood vessels of neural and non-neural tissues. Acta Medica (Hradec Kralove). 51 (3), 173-179 (2008).
  52. Suzuki, S., Namiki, J., Shibata, S., Mastuzaki, Y., Okano, H. The neural stem/progenitor cell marker nestin is expressed in proliferative endothelial cells, but not in mature vasculature. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 58 (8), 721-730 (2010).
  53. Wohl, S. G., Schmeer, C. W., Isenmann, S. Neurogenic potential of stem/progenitor-like cells in the adult mammalian eye. Progress in Retinal and Eye Research. 31 (3), 213-242 (2012).
  54. Eberhardt, C., Amann, B., Stangassinger, M., Hauck, S. M., Deeg, C. A. Isolation, characterization and establishment of an equine retinal glial cell line: a prerequisite to investigate the physiological function of Muller cells in the retina. Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition (Berlin). 96 (2), 260-269 (2012).
  55. Löffler, K., Schäfer, P., Völkner, M., Holdt, T., Karl, M. O. Age-dependent Müller glia neurogenic competence in the mouse retina). Glia. 63 (10), 1809-1824 (2015).
  56. Schafer, P., Karl, M. O. Prospective purification and characterization of Muller glia in the mouse retina regeneration assay. Glia. 65 (5), 828-847 (2017).

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