Microscopía intravital de fluorescencia de campo ancho de la microcirculación pulmonar en la lesión pulmonar aguda experimental utilizando un sistema de imágenes estabilizado por vacío

Resumen

La microscopía de fluorescencia intravital se puede utilizar para estudiar las interacciones leucocitario-endotelial y la perfusión capilar en tiempo real. Este protocolo describe métodos para obtener imágenes y cuantificar estos parámetros en la microcirculación pulmonar utilizando un sistema de imágenes pulmonares estabilizadas por vacío.

Resumen

Las imágenes intravitales de las interacciones leucocitarios-endoteliales ofrecen información valiosa sobre la enfermedad inmunomediada en animales vivos. El estudio de la lesión pulmonar aguda (ALI) / síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA) y otras patologías respiratorias in vivo es difícil debido a la accesibilidad limitada y los artefactos de movimiento inherentes de los pulmones. No obstante, se han desarrollado varios enfoques para superar estos desafíos. Este protocolo describe un método para la microscopía de fluorescencia intravital para estudiar las interacciones leucocitarios-endoteliales en tiempo real en la microcirculación pulmonar en un modelo experimental de ALI. Se utiliza un sistema de imágenes pulmonares in vivo y una plataforma de microscopía intravital impresa en 3D para asegurar el ratón anestesiado y estabilizar el pulmón al tiempo que minimiza la lesión pulmonar confusa. Después de la preparación, la microscopía de fluorescencia de campo ancho se utiliza para estudiar la adhesión de leucocitos, el laminado de leucocitos y la función capilar. Si bien el protocolo presentado aquí se centra en la obtención de imágenes en un modelo agudo de enfermedad pulmonar inflamatoria, también puede adaptarse para estudiar otros procesos patológicos y fisiológicos en el pulmón.

Introducción

La microscopía intravital (IVM) es una herramienta de imagen útil para visualizar y estudiar diversos procesos biofísicos in vivo. El pulmón es muy difícil de obtener imágenes in vivo debido a su ubicación cerrada, la naturaleza frágil de su tejido y los artefactos de movimiento inducidos por la respiración y los latidos del corazón ^1,2. Se han desarrollado varias configuraciones de microscopía intravital (IVM) para obtener imágenes en tiempo real de las interacciones leucocitarios-endoteliales en la microcirculación pulmonar para superar estos desafíos. Tales enfoques se basan en exponer quirúrgicamente y estabilizar el pulmón para obtener imágenes.

Los animales generalmente se preparan para la IVM pulmonar mediante procedimientos quirúrgicos. En primer lugar, los animales son intubados y ventilados, lo que permite la escisión quirúrgica de una ventana torácica y las intervenciones posteriores para estabilizar el pulmón para la obtención de imágenes. Una técnica consiste en pegar el parénquima en una cubierta de vidrio³, un procedimiento que corre el riesgo de un trauma físico significativo en el tejido fotografiado. Más avanzada es la utilización de un sistema de vacío para estabilizar el pulmón bajo una ventana de vidrio⁴. Esta configuración facilita la adherencia suelta de la superficie pulmonar a la cubierta a través de un vacío reversible extendido sobre una gran área local y expande el pulmón al tiempo que limita el movimiento en las dimensiones x, y y z⁴. El vacío se aplica uniformemente a través de un canal que rodea el área de imagen de la configuración y tira del tejido hacia una región cónica poco profunda frente al cobertor de grado de imagen⁴. A través de esta ventana de visualización, la microcirculación pulmonar se puede estudiar utilizando varias modalidades de imágenes ópticas.

La IVM pulmonar permite la obtención de imágenes cuantitativas de una multitud de parámetros microcirculatorios. Estos incluyen mediciones como la velocidad y longitud^de la pista de leucocitos 5, la velocidad del flujo de glóbulos rojos⁶ y la oxigenación⁷, las metástasis tumorales⁸, la distinción de las subpoblaciones de células inmunes ^9,10,11, la visualización de micropartículas¹², la dinámica alveolar ^13,14, la permeabilidad vascular¹⁵ y la función capilar ¹⁶ . El enfoque aquí está en el reclutamiento de leucocitos y la función capilar. El inicio del reclutamiento de leucocitos en la microcirculación pulmonar implica interacciones transitorias de rodadura e interacciones adhesivas firmes entre leucocitos y células endoteliales, las cuales se incrementan en condiciones inflamatorias^16,17. Típicamente, el laminado se cuantifica por el número de leucocitos que pasan por una línea de referencia definida por el operador, mientras que la adhesión se cuantifica por el número de leucocitos que están inmóviles en el endotelio¹⁶. La función capilar también puede verse afectada en estados inflamatorios, lo que a menudo resulta en una disminución de la perfusión. Esto se puede atribuir a varios factores, incluida una reducción de la deformabilidad de los glóbulos rojos¹⁸ y la expresión abigarrada de la NO sintasa inducible por las células endoteliales que resulta en una derivación patológica¹⁹. Por lo general, la longitud agregada de los capilares perfundidos por área se mide y se informa como densidad capilar funcional (FCD).

El estudio del reclutamiento de leucocitos en los pulmones en tiempo real requiere el etiquetado de objetivos biológicos con colorantes fluorescentes o anticuerpos marcados con fluorescentes²⁰. Alternativamente, varias cepas de ratones transgénicos como los ratones de la proteína fluorescente M-green lisozima (LysM-GFP) se pueden utilizar para obtener imágenes de subconjuntos específicos de células inmunes como los neutrófilos^21,22. Los leucocitos marcados con fluorescentes se pueden visualizar utilizando microscopía de fluorescencia de campo amplio, microscopía confocal o microscopía multifotónica. Estas técnicas logran el contraste mediante la utilización de longitudes de onda de excitación específicas y la detección de la fluorescencia emitida, al tiempo que bloquean la detección de la longitud de onda de excitación, destacando así el objeto etiquetado.

La investigación existente sobre la cuantificación del laminado de leucocitos, la adhesión y la densidad capilar funcional en el pulmón murino se ha basado principalmente en el análisis manual de video. Esto es posible gracias al software de código abierto como Fiji ^6,23, el software propietario como CapImage¹² o los sistemas de procesamiento de imágenes personalizados²⁴. Por el contrario, varias plataformas de software propietario (por ejemplo, NIS Element, Imaris, Volocity, MetaMorph) permiten la medición automatizada de una amplia gama de otros parámetros fisiológicos, incluidos muchos de los mencionados anteriormente aquí 5,6,7,8,9,10,11,12,13,15.

Se han realizado observaciones importantes con respecto a la patología de la lesión pulmonar aguda (ALI) y el síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA) utilizando la IVM pulmonar. El SDRA se caracteriza por una serie de procesos fisiopatológicos en el pulmón, incluyendo edema pulmonar y daño alveolar causado por la disfunción del endotelio y la barrera epitelial²⁵. Utilizando un modelo murino, se ha encontrado que la ALI inducida por sepsis se asocia con cambios perjudiciales significativos en el tráfico de células inmunes en el entorno pulmonar²⁶. Se encontró que los neutrófilos reclutados en los capilares de ratones con ALI inducida por sepsis impiden la microcirculación, lo que aumenta la hipoxia en ALI²⁶. Además, la IVM se ha utilizado para obtener información sobre el mecanismo subyacente de reparación después de la aparición del SDRA²⁷. La MIV pulmonar también ha sido una herramienta valiosa para comprender los cambios fisiopatológicos en diversas enfermedades pulmonares obstructivas. Por ejemplo, la visualización del transporte de moco en enfermedades como la fibrosis quística (FQ) y la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) ha facilitado el estudio de tratamientos novedosos y existentes para el aclaramiento mucoso²⁸. También se ha analizado el tráfico de leucocitos en estas condiciones¹⁷.

Este protocolo amplía el enfoque descrito inicialmente por Lamm et ^al.29 para estudiar las interacciones leucocitarios-endoteliales mediante microscopía de fluorescencia convencional. Los procedimientos descritos emplean un sistema de imágenes pulmonares in vivo , que incluye una base metálica de 16,5 cm x 12,7 cm, un micromanipulador y una ventana de imágenes al vacío (Figura 1). El sistema está montado en una plataforma impresa en 3D de 20 cm x 23,5 cm (Archivo suplementario 1) para proporcionar una fijación segura para el tubo del ventilador y la almohadilla térmica. Este método ofrece imágenes reproducibles y cuantificables de la microcirculación pulmonar murina in vivo. Los aspectos importantes de la preparación quirúrgica, así como la utilización adecuada de un sistema de imágenes pulmonares estabilizadas al vacío se explican en detalle. Finalmente, se utiliza un modelo experimental de ALI para proporcionar imágenes representativas y análisis de la alteración del laminado de leucocitos, la adhesión leucocitaria y la perfusión capilar asociada con la inflamación. El uso de este protocolo debería facilitar otras investigaciones importantes sobre los cambios fisiopatológicos en la microcirculación pulmonar durante los estados de enfermedad aguda.

Protocolo

Todos los procedimientos descritos aquí se realizaron con la aprobación previa del Comité de Animales de Laboratorio de la Universidad de Dalhousie (UCLA).

1. Preparación

1. Sistema de imágenes pulmonares: Para preparar la ventana, administre una capa delgada de grasa al vacío en la parte superior del anillo exterior mientras evita la contaminación del canal de vacío. Coloque una cubierta de vidrio limpia de 8 mm en la ventana y presione suavemente hacia abajo para crear un sello.
2. Microscopio de fluorescencia de campo ancho: realice imágenes con un microscopio de fluorescencia de campo ancho convencional equipado con un objetivo de larga distancia de trabajo de 20x / 0.40 y una cámara de dispositivo de carga acoplada (CCD) en blanco y negro con una velocidad de fotogramas de 25 FPS. Aplique un filtro de excitación de paso de banda de 530-550 nm para excitar rhodamine-6G y un filtro de paso de banda de 460-490 nm para excitar el isotiocianato de fluoresceína (FITC).
3. Sistema de vacío: Conecte la ventana de imagen a una bomba de vacío equipada con un manómetro digital capaz de proporcionar una succión constante de 50-60 mmHg, como se muestra en la Figura Suplementaria 1. En resumen, conecte la ventana de imagen a la bomba a través de tubos de polietileno I.D. de 1,0 mm, tubos de polietileno I.D. de 1,0 cm, un matraz de vacío y un filtro en línea de 0,2 μm.
4. Ventilador: Configure un ventilador de roedor pequeño para proporcionar ventilación controlada por presión a una velocidad y volumen calculados en función del peso del ratón. Proporcione una presión positiva al final de la espiración (PEEP) a 5 cmH₂O durante la duración del experimento y establezca la presión objetivo en 20 cmH₂O.
5. Anestésico: Utilizando un sistema de administración de anestesia de bajo flujo, prepare una jeringa de 5.0 ml con 99.9% de isoflurano. Use un sistema de eliminación de gases residuales para minimizar el riesgo de inhalación por parte del cirujano.

2. Anestesia

1. Coloque un ratón macho C57Bl/6 de 20-25 g de 12 semanas de edad en la cámara de inducción de anestesia. Con la cámara bien cerrada, comience la inducción con gas isoflurano a una concentración del 3% y un caudal de 500 ml/min.
2. Una vez que el ratón esté anestesiado (visualizado por la frecuencia respiratoria lenta), transfiéralo al soporte de intubación y asegure los incisivos superiores a la sutura colgante.
3. Apriete la sutura para asegurar el hocico dentro del cono de la nariz. Comience el flujo de gas a través del cono de la nariz a una concentración del 2,5%.
4. Confirme la profundidad adecuada de la anestesia mediante pellizco del dedo del pie antes de pasar al siguiente paso.

3. Intubación

1. Gire el soporte de tal manera que la parte posterior del soporte y el lado dorsal del ratón miren hacia el cirujano.
2. Pasar la punta de un cable de fibra óptica de 20 cm de longitud a través de una cánula endotraqueal de 20 G y sumergir la punta en Lidocaína HCl (1%) para facilitar el paso del cable a través de la laringe.
3. Usando fórceps contundentes, levante la mandíbula inferior y desplace la lengua para proporcionar un paso claro hacia el tracto respiratorio.
4. Inserte un otoscopio modificado (~ 60 ° de circunferencia del espéculo eliminado) de modo que los incisivos superiores quepan dentro del espacio en el espéculo. Ajuste el endoscopio y la posición de la lengua hasta que la epiglotis y las cuerdas vocales sean claramente visibles.
5. Inserte el cable de fibra óptica cargado con la cánula endotraqueal a través del espacio en el espéculo y en la laringe. Usando pequeños movimientos circulares, pase el cable a través de las cuerdas vocales y hacia la tráquea.
6. Empuje la cánula a lo largo del cable de fibra óptica, pasando entre las cuerdas vocales y hacia la tráquea.

4. Ventilación

1. Recupere el ratón del soporte de intubación y colóquelo en una almohadilla térmica en la posición de decúbito lateral derecho.
2. Conecte la cánula a los tubos del ventilador y encienda el ventilador. Reduzca la concentración de anestésico al 1,5% y controle la profundidad mediante la prueba del reflejo del pedal. Si el reflejo persiste, aumente la concentración incrementalmente hasta un 2%.
3. Coloque gel lagrimal en los ojos del ratón para evitar que se seque.
4. Con cinta adhesiva médica, asegure la cánula al hocico. Usando cinta de etiquetado, asegure la pata delantera derecha a la almohadilla térmica en, aproximadamente, la posición de las 9 en punto. Extienda la pata trasera izquierda caudalmente y asegure en, aproximadamente, la posición de las 6 en punto.
5. Usando una cinta de tela, estire ligeramente la pata delantera izquierda hasta la posición de las 12 en punto y asegure el otro extremo de la cinta hasta la parte superior de la plataforma IVM como se muestra en la Figura 2A (mantener una ligera tensión aquí facilita la toracotomía posterior).
6. Inserte una sonda de temperatura rectal y asegure la sonda pegándola con cinta adhesiva a la almohadilla térmica. Coloque un oxímetro de pulso en la pata trasera derecha y asegúrelo a la almohadilla térmica, teniendo cuidado de no interrumpir la circulación.
7. Una vez que la temperatura esté estable a 37.0 °C ± 0.1 °C, proceda a realizar la toracotomía.

5. Toracotomía

1. Esteriliza el tórax y el abdomen con una toallita con alcohol al 70%. Aplique una capa ligera de aceite mineral para humedecer el cabello en el lado izquierdo del ratón, desde el esternón hasta la columna vertebral y desde el hombro hasta la parte inferior de la caja torácica.
2. Con pinzas romas y tijeras rectas, haga una pequeña incisión longitudinal cerca de la parte inferior de la caja torácica para exponer la capa muscular subyacente.
3. Moviéndose ventralmente, use la disección contundente para separar el tejido epitelial y adiposo de la capa muscular. Cauterizar los vasos sanguíneos expuestos. Una vez mitigado el riesgo de pérdida de sangre, extienda la incisión original ventralmente hasta el proceso xifoide.
4. Repita este proceso dorsalmente hasta ~5 mm lateral a la columna vertebral.
5. Moviéndose cranealmente, use disección contundente para exponer la caja torácica. Cauterizar cualquier vaso sanguíneo expuesto para preservar la estabilidad hemodinámica.
6. Una vez mitigado el riesgo de pérdida de sangre, extienda la incisión desde el proceso xifoide hasta la axila.
7. Repita este proceso en el lado dorsal de la incisión hasta ~ 1 cm inferior a la oreja izquierda.
8. Usando fórceps hemostáticos, agarre el tejido epitelial y adiposo diseccionado y colóquelo fuera del área quirúrgica (Figura 2B).
9. Inyectar una solución de Rhodamine-6G (0,5 mg/mL; 1,5 mL/kg) para la visualización de leucocitos y FITC-albúmina bovina (50 mg/mL; 1 mL/kg) para la visualización de la perfusión capilar a través de la vena de la cola.
10. Usando pinzas dentadas, agarre la costilla inmediatamente inferior a la posición de la base del pulmón en la inspiración final y retraiga ligeramente para alejar la costilla del pulmón. Corte la costilla para inducir un neumotórax.
11. Extienda la incisión lateralmente a lo largo del músculo intercostal en ambas direcciones, teniendo cuidado de no tocar la superficie pulmonar expuesta.
12. Usando fórceps contundentes, agarre la siguiente costilla más alta y retraiga ligeramente para permitir que el pulmón se caiga lejos de la pared torácica. Si el pulmón no se desprende, presione la pared torácica ligeramente contra el pulmón para hacer que el pulmón se adhiera a la pleura subyacente y, por lo tanto, se caiga más fácilmente.
13. Continúe la incisión original ventralmente hasta el esternón y cranealmente hasta que el ápice del pulmón esté expuesto. Use aplicadores de algodón y gasas para atenuar cualquier sangrado que surja.
14. Levante la caja torácica para exponer los vasos sanguíneos intercostales en el aspecto dorsal de la cavidad torácica. Teniendo cuidado de no dañar el pulmón, cauterice el vaso intercostal más inferior cerca de la columna vertebral y luego corte la costilla. Moviéndose craneal y ventralmente, repita hasta que se extirpe una porción de aproximadamente 1 cm x 1,5 cm de la caja torácica (Figura 2C).
15. Elimine cualquier exceso de acumulación de líquido en la cavidad torácica a través de la acción capilar utilizando pequeñas tiras de gasa.
16. Mientras se procede a la microscopía, permita ~ 5 minutos para que el líquido intrapleural se disipe para una interfaz más segura entre el pulmón y la ventana de imágenes.

6. Microscopía

1. Encienda la bomba de vacío y ajuste la presión a ~50–60 mmHg.
2. Transfiera la plataforma IVM a la etapa de microscopio. Coloque el poste de metal y el micromanipulador de modo que la ventana de imágenes esté directamente sobre el pulmón expuesto y el brazo de la ventana se acerque al pulmón desde, aproximadamente, la posición de las 3 en punto.
3. Usando el micromanipulador, baje cuidadosamente la ventana de imágenes hasta que se adhiera y estabilice la superficie pulmonar (Figura 3A).
4. Utilizando el objetivo 20x y el filtro de excitación de paso de banda de 460-490 nm, identifique una vénula pulmonar basada en el patrón convergente del flujo sanguíneo. Centra el buque en el campo de visión y graba 30 s de vídeo.
   1. Cambie al filtro de excitación de paso de banda de 530-550 nm y grabe 30 s de video en el mismo campo de visión.
   2. Repita el paso anterior hasta que se hayan tomado imágenes de cinco vénulas pulmonares.
5. Utilizando el filtro de excitación de paso de banda de 460-490 nm, identifique una arteriola pulmonar basada en el patrón divergente del flujo sanguíneo. Centra el buque en el campo de visión y graba 30 s de vídeo.
   1. Cambie al filtro de excitación de paso de banda de 530-550 nm y grabe 30 s de video en el mismo campo de visión.
   2. Repita el paso anterior hasta que se hayan tomado imágenes de cinco arteriolas pulmonares.
6. Usando el filtro de excitación de paso de banda de 460-490 nm, localice una región de alvéolos y capilares no intersectados por vasos más grandes y grabe 30 s de video.
   1. Cambie al filtro de excitación de paso de banda de 530-550 nm y grabe 30 s de video en el mismo campo de visión.
   2. Repita el paso anterior hasta que se hayan tomado imágenes de cinco regiones capilares.

7. Eutanasia y protocolo de limpieza

1. Retire la plataforma IVM de la etapa de microscopio y ajuste la administración de isoflurano al 5% durante 5 minutos para sacrificar al ratón.
2. Mientras espera, deseche el vidrio de la cubierta y desconecte la ventana de imágenes de la plataforma. Limpie la ventana de imágenes con un cepillo pequeño y use una jeringa de 30 G insertada en el canal para enjuagarla varias veces con agua destilada. Luego, enjuague con etanol al 95% usando la bomba de vacío.
3. Después de que hayan transcurrido 5 minutos, detenga el ventilador y asegure la eutanasia completa a través de la dislocación cervical.

Resultados

Para ilustrar los resultados alcanzables a través de este protocolo, la lesión pulmonar aguda (ALI) se indujo 6 h antes de la obtención de imágenes utilizando un modelo de instilación de lipopolisacáridos bacterianos intranasales (LPS). Brevemente, los ratones (n = 3) fueron anestesiados con isoflurano, y pequeñas gotas de LPS de Pseudomonas aeruginosa en solución salina estéril (10 mg/ml) se pipetearon en el naris izquierdo a una dosis de 5 mg/kg. Esto se comparó con ratones ingenuos (n = 3; sin admin...

Discusión

El protocolo presentado aquí requiere práctica y atención a algunos pasos críticos. Primero, es importante preparar la ventana de imágenes antes de iniciar la intubación y la cirugía. Use una cantidad mínima de grasa al vacío para recubrir el anillo exterior de la ventana de imágenes, aplique el vidrio de la cubierta y pruebe la succión con una gota de agua destilada. Preparar esto con anticipación evitará que el pulmón expuesto se seque durante la configuración, de lo contrario. Si bien es posible enjuaga...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL BD Luer Slip Tip Syringe sterile, single use	Becton, Dickinson and Company	309659	1 mL syringe
ADSON Dressing Forceps, Tip width 0.6 mm, teeth length 11.5 mm, 12 cm	RWD Life Science Co.	F12002-12	Blunt forceps
Albumin-Fluorescein Isothiocyanate	Sigma-Aldrich	A9771-1G	FITC-albumin
Alcohol Swab Isopropyl Alcohol 70% v/v	Canadian Custom Packaging Company	80002455	Alcohol wipe
AVDC110 Advanced Digital Video Converter	Canopus	00631069602029	Digital video converter
B/W - CCD - Camera	Horn Imaging	BC-71	Camera
Bovie Deluxe High Temperature Cautery Kit	Fine Science Tools	18010-00	Cauterizer
C57BL/6 Mice	Charles River Laboratories International	C57BL/6NCrl	C57BL/6 Mice
Cotton Tipped Applicators	Puritan	806-WC	Cotton applicator
CS-8R 8mm Round Glass Coverslip	Warner Instruments	64-0701	Glass coverslip
Digital Pressure Gauge	ITM Instruments Inc.	DG2551L0NAM02L0IM&V	Digital Pressure Gauge
Dr Mom Slimline Stainless LED Otoscope	Dr. Mom Otoscopes	1001	Otoscope
Ethyl Alchohol 95% Vol	Commercial Alcohols	P016EA95	95% ethanol
Fine Scissors - Martensitic Stainless Steel	Fine Science Tools	14094-11	Scissors
Fisherbrand Colored Labeling Tape	Fisher Scientific	1590110	Labeling tape
Gast DOA-P704-AA High-Capacity Vacuum Pump	Cole-Parmer Canada Company	ZA-07061-40	Vacuum pump
Hartman Hemostats	Fine Science Tools	13003-10	Hemostatic forceps
High Vacuum Grease	Dow Corning	DC976VF	Vacuum grease
Isoflurane USP	Fresenius Kabi	CP0406V2	Isoflurane
LIDOcaine HCl Injection 1% 50 mg/5 mL	Teligent Canada	0121AD01	Lidocaine HCl 1%
Lung SurgiBoard	Luxidea, Inc.	IMCH-0001	Designed for intravital microscopy of the lung
Mineral Oil	Teva Canada	00485802	Mineral oil
Mouse Endotracheal Intubation Kit	Kent Scientific Corporation	ETI-MSE	Intubation stand, anesthesia mask, 20 G endotracheal cannula, fibre optic cable
MST49 Fluorescence Microscope	Leica Microsystems	10 450 022	Fluorescence Microscope
N Plan L 20x/0.40 Long Working Distance Microscope Objective	Leica Microsystems	566035	20x objective
Non-Woven Sponges 2" x 2"	AMD-Ritmed	A2101-CH	Gauze
Optixcare Eye Lube Plus	Aventix	5914322	Tear gel
Original Prusa i3 MK3S+ 3D Printer	Prusa Research	PRI-MK3S-KIT-ORG-PEI	3D printer
Oxygen, Compressed	Linde Canada Inc.		Oxygen
PrecisionGlide Needle 30 G x 1/2 (0.3 mm x 13 mm)	Becton, Dickinson and Company	305106	30 G needle
Pyrex 5340-2L 5340 Filtering Flasks, 2000 mL	Cole-Parmer Canada Company	5340-2L	Vacuum flask
Rhodamine 6 G	Sigma-Aldrich	252433	Rhodamine 6G
Secure Soft Cloth Medical Tape - 3"	Primed	PM5-630709	Cloth tape
Silastic Medical Grade Tubing .040 in. ID x .085 in. OD	Dow Corning	602-205	1.0 mm I.D. polyethylene tubing
Somnosuite Low-Flow Anesthesia System	Kent Scientific Corporation	SS-01, SS-04-module	Small rodent ventilator, Low-flow anesthesia system, Heating pad, Rectal temperature probe, Pulse oximeter
Tissue Forceps, 12.5cm long, Curved, 1 x 2 Teeth	World Precision Instruments	501216	Toothed forceps
Transpore Medical Tape, 1527-1, 1 in x 10 yd (2.5 cm x 9.1 m)	3M	7000002795	Medical tape
Tubing,Clear,3/8 in Inside Dia.	Grainger Canada	USSZUSA-HT3314	1.0 cm I.D. polyethylene tubing
Whatman 6720-5002 50 mm In-Line Filters, PTFE, 0.2 µm	Cole-Parmer Canada Company	6720-5002	Inline 0.2µm filter