Cría masiva y estudios moleculares en insectos plaga tortricidae

Resumen

El presente protocolo describe el método de cría de insectos plaga tortricidas en los laboratorios. Los procedimientos para distinguir el sexo de los insectos y extraer ácidos nucleicos para la secuenciación de alto rendimiento se establecen utilizando dos plagas tortricidas.

Resumen

Tortricidae (Lepidoptera), comúnmente conocidos como polillas tortrix o leafroller, comprende muchas plagas agrícolas y forestales, que causan graves pérdidas agrícolas. Para comprender la biología de tales polillas plaga, las técnicas fundamentales han tenido una gran demanda. Aquí, los métodos para la cría en masa, las observaciones y los estudios moleculares se desarrollan utilizando dos tortrix de té, Homona magnanima y Adoxophyes honmai (Lepidoptera: Tortricidae). Los insectos fueron criados en masa con una dieta artificial en rodajas y mantenidos por endogamia durante más de 100 generaciones teniendo en cuenta sus características biológicas. Los insectos tienen varios dimorfismos sexuales; por lo tanto, es difícil distinguir el sexo durante las etapas de desarrollo, que han impedido los ensayos posteriores. El presente trabajo destacó que el sexo de las larvas de tortricidas podría determinarse mediante la observación de testículos o tinción de orceína láctico-acética para visualizar el cromosoma W específico de la hembra. Además, utilizando los métodos de determinación del sexo, el presente estudio permitió la extracción de ácido nucleico de embriones determinados por sexo y la aplicación hacia la secuenciación de alto rendimiento. Estos consejos son aplicables para otros insectos plaga y facilitarán más estudios morfológicos y genéticos.

Introducción

Los insectos lepidópteros representan más del 10% de todas las especies vivas descritas¹, y ciertas especies de taxones causan graves daños a las plantas y graves pérdidas agrícolas ^2,3. Aunque se han desarrollado estudios moleculares y genéticos utilizando modelos de insectos como el gusano de seda Bombyx mori ^4,5, los insectos plaga siguen sin ser investigados, en parte debido a las dificultades para la cría y manipulación ^6,7. Por lo tanto, los estudios y técnicas fundamentales son necesarios para comprender la biología de tales insectos plaga no modelo.

Los Tortricidae (Lepidoptera), comúnmente conocidos como tortrix o polillas de las hojas, comprenden muchas plagas agrícolas y forestales⁸. De los taxones de insectos, la tortrix oriental del té Homona magnanima Diakonoff y la tortrix de frutas de verano Adoxophyes honmai Yasuda son plagas polífagas graves que se sabe que dañan los árboles de té en el este de Asia⁷. Las dos especies ponen racimos de huevos planos y ovalados (o masas de huevos) que consisten en huevos delgados, blandos y frágiles cubiertos por secreciones maternas. Aunque las etapas de embriogénesis son cruciales para el desarrollo de insectos y las determinaciones del sexo⁹, las estructuras de los huevos impiden que un análisis más detallado comprenda la biología de los insectos. Es importante superar las dificultades para un mayor estudio de las plagas que oviponen una masa de huevos tan compleja.

Aquí, para comprender la biología de los tortricidos, se han desarrollado métodos para la cría en masa, observaciones y estudios moleculares utilizando A. honmai y H. magnanima. En primer lugar, los métodos de cría en masa mantienen a ambos tortricidos más de 100 generaciones por endogámicos. La separación de los huevos de la masa de huevo concatenada similar a una escama facilitó la observación de la embriogénesis de los tortricidos utilizando disolventes alcalinos y orgánicos previamente desarrollados a partir de técnicas utilizadas en moscas¹⁰. Además, el presente estudio estableció la discriminación sexual de embriones pequeños mediante el desarrollo de métodos de tinción de la cromatina sexual de hembras lepidópteras utilizando orceína láctico-acética¹¹. Mediante la combinación de estos métodos, se extrajeron ácidos nucleicos de alta calidad y cantidad de embriones determinados por sexo, lo que de otro modo sería difícil de establecer⁶. El ARN extraído se utilizó para la secuenciación de próxima generación. Colectivamente, los métodos presentados aquí se aplican a otros insectos lepidópteros y otros taxones de insectos.

Protocolo

1. Recolección de insectos y cría masiva

1. Recolectar insectos tortricidas de los campos siguiendo las Referencias ^8,12 publicadas anteriormente.
   NOTA: Las larvas de H. magnanima y A. honmai se recogen de hojas de té dañadas (Figura 1A); los adultos son atraídos usando luz UV portátil de 4 W (longitud de onda de 365 nm, ver Tabla de Materiales, Figura 1B).
2. Recoja las larvas recolectadas (Figura 1C, D) individualmente en una pieza de dieta artificial en una taza de 1/2 oz durante 2-3 semanas hasta la eclosión adulta (Figura 1E, F). Confirmar el sexo de pupas y adultos por rasgos morfológicos (Figura 1G,I).
3. Aparea los machos y las hembras en una caja de plástico (30 cm x 20 cm x 5 cm) para ovipositar masas de huevos en un papel de parafina (Figura 1J-L). Coloque una hembra y dos machos en un vaso de plástico de 120 ml con un trozo de papel de parafina para establecer una matrilina.
   NOTA: Es importante hacer pliegues en el papel de parafina. Para H. magnanima, el papel de parafina debe estar en la parte inferior de la caja. Mientras tanto, para A. honmai, coloque un papel en el techo de la caja para recolectar huevos (Figura 1L) ya que la masa de huevo de H. magnanima oviposit en la parte superior de las hojas de té, pero A. honmai pone huevos en la parte inferior de las hojas⁸. Los procedimientos también se verificaron en otras especies de tortricidas, y es mejor colocar documentos en ambos lados si la ecología y el comportamiento de las especies objetivo no están aclarados.
4. Cortar las masas de huevo (aproximadamente 100-200 huevos por masa de huevo¹², Figura 1M) en el papel de parafina con tijeras. Coloque los huevos en una taza de 1/2 oz con papel vertido durante 5-7 días.
   NOTA: El embrión maduro exhibe una cápsula de espinillas (Figura 1N). Los períodos de embriogénesis se atribuyen de manera diversa a las especies de tortricidas, pero generalmente 5 días después de la oviposición (dpo) para H. magnanima y 4 dpo para A. honmai a 25 ° C con 60% de humedad relativa, 16 h de luz / 8 h ciclos de oscuridad⁷.
5. Guarde las masas de huevo que muestran cápsulas de cabeza negra a 4-8 ° C durante 7 días.
6. Cortar ~ 60 g dietas artificiales usando un rallador para la cría en masa. Coloque la masa de huevo llena de embriones maduros en la dieta artificial en rodajas en un recipiente de plástico (23 cm x 16 cm x 8 cm). Coloque papeles de parafina en la masa de huevo con las dietas en rodajas (Figura 10).
   NOTA: Por debajo del 30% de humedad relativa se considera demasiado seco, mientras que más del 70% es demasiado húmedo. Crear agujeros en la tapa del recipiente de plástico es mejor para permitir una mejor ventilación. Llene los agujeros con algodón para evitar los escapes de pequeñas larvas.
7. Para eliminar los contaminantes superficiales de los huevos, remoje la masa de huevo en una solución de formalina al 3% y cloruro de benzalconio al 0,2% durante 5 min, respectivamente¹². Para erradicar las bacterias intestinales o intracelulares, utilice una dieta artificial suplementada con 0.05% (p/p) de clorhidrato de tetraciclina o 0.06% (p/p) de rifampicina en lugar de una dieta artificial normal (ver Tabla de Materiales).
   NOTA: Este paso es opcional. Es importante amasar Silk Mate 2S y 0.05% (p/p) clorhidrato de tetraciclina o 0.06% (p/p) rifampicina de manera equitativa para mayor consistencia.
8. Recoge las pupas del recipiente de plástico y distingue el sexo en función de^{las 12} características morfológicas (Figura 1G-I).
   NOTA: Generalmente, los tortricidos presentan 5-6 instars hasta la pupación¹². Las larvas de H. magnanima y A. honmai tardan 3 semanas y 2 semanas, respectivamente, después de la eclosión hasta la pupación.
9. Coloque 15 machos y 10 hembras en una caja de plástico (30 cm x 20 cm x 5 cm, Figura 1K) para aparearse con 25 ° C, 16 L / 8 D. Recoja los huevos por 5-7 días y repita los pasos 1.4-1.9. para cada generación.
   NOTA: Si es necesario recolectar masas de huevos recién ovipuestas para su posterior análisis, establezca el inicio y el final del período oscuro, por ejemplo, de 9 a.m. a 5 p.m. En esta condición, H. magnanima y A. honami generalmente oviposit huevos después de 5 h (2 PM).

2. Separación de huevos y larvas de fraato de masas de huevos para fijación, permeabilización y tinción

1. Remoje la masa del huevo en 1.000 μL de solución acuosa de hipoclorito de sodio al 1,2% durante 10 min o en 1.000 μL de solución acuosa de hidróxido de potasio al 5 M durante 30 min para separar los huevos.
2. Lavar los huevos separados en 1.000 μL de PBSt (137 mM NaCl, 8,1 mM Na₂HPO₄, 2,68 mM KCl, 1,47 mM KH₂PO₄, 0,05% de polioxietileno (20) Sorbitan Monolaurate [Tween-20] pH 7,4, ver Tabla de Materiales) siguiendo el informe publicado anteriormente⁷.
3. Remoje los huevos en una mezcla de 500 μL de 100% de heptano y 500 μL de solución de paraformaldehído-PBSt al 4% (p/v). Mezclar durante 10 min a 1.500 rpm con un mezclador de vórtice.
4. Remoje los huevos en una mezcla de 500 μL de 100% de heptano y 500 μL de 100% de metanol. Mezclar durante 10 min a 1.500 rpm.
5. Lave los huevos dos veces con 1.000 μL de metanol al 100% y guárdelos a 4 °C en metanol al 100% hasta nuevos experimentos (Figura 2A).
   NOTA: Los huevos se pueden almacenar durante al menos 1 año a 4 °C.
6. Remoje los huevos secuencialmente en 99%, 70%, 50% de etanol y PBSt durante 5 minutos cada uno para hidrofilización después del informe publicado anteriormente⁷.
7. Lave los huevos con PBSt, sumerja los huevos en 1 μg / ml de solución DAPI durante 5 minutos y luego lave los huevos con 1x PBS dos veces. Remoje los huevos en 20 μL de solución de orceína láctico-acética al 1,25% (p/p) (ver Tabla de Materiales)¹¹ para visualizar la heterocromatina hasta que los núcleos exhiban un color rojo brillante (esto varía de 5-60 min) (Figura 2B,C).
   NOTA: Los períodos de tinción láctico-acético de la orceína dependen de la temperatura y la humedad. Es mejor verificar la tinción adecuada con un microscopio con un aumento de 4x-10x.
8. Transfiera los huevos teñidos con una pipeta a un portaobjetos de vidrio. Encierre los huevos teñidos con reactivo antifade (ver Tabla de Materiales) y una cubierta de vidrio⁷.
9. Extraer las larvas de H. magnanima y A. honmai (4-5 días después de la oviposición (dpo)) de las masas de huevos utilizando fórceps (Figura 2D). Bisectar larvas en un portaobjetos de vidrio (Figura 2E).
10. Fije cualquier tejido (por ejemplo, ganglio suboesofágico, ganglios torácicos, túbulo malpighiano, etc.) con una mezcla de 1:3 (v/v) 99,7% de ácido acético/100% de metanol durante 5 min. Manche aquellos con 1.25% (p/p) solución de orceína láctico-acética¹¹ hasta que los núcleos estén teñidos (esto puede tomar de 5 a 60 min, dependiendo de la temperatura y la humedad).
11. Determinar el sexo de cada espécimen observando la presencia (hembra) o ausencia (macho) de heterocromatina (el cromosoma W, Figura 2F,G) bajo un microscopio.
    NOTA: El sexo se determina visualizando la cromatina sexual. Cada célula representa la cromatina sexual como un punto en las hembras ^11,12, mientras que la porción restante de los tejidos larvales de fraato (no fija) debe sumergirse inmediatamente en tampón de lisis celular¹² (10 mM Tris-HCl, 100 mM EDTA y 1% SDS, pH 8.0) o reactivos de extracción de ARN que contienen fenol para la extracción de ADN o ARN. Antes de las disecciones, dispensar 20 μL de los reactivos en tubos de PCR de 0,2 ml por adelantado (Figura 3A). Sumergir y almacenar las muestras a -80 °C hasta su posterior extracción. Las muestras se pueden almacenar durante al menos 3 meses, pero es mejor continuar con los experimentos posteriores para evitar la degradación de los ácidos nucleicos.

3. Extracciones de ADN y ARN de larvas de fraato determinadas por sexo

1. Agrupar 12 larvas de fraato macho o hembra determinadas por sexo (embrión de 5 dpo) y agregar tampón de lisis celular o reactivos de extracción de ARN (ver paso 2.11 y Tabla de materiales) en un tubo de 1.5 ml.
   NOTA: Siga los pasos 3.2-3.7 para la extracción de ADN y los pasos 3.8-3.11 para la extracción de ARN.
2. Homogeneizar los tejidos en 600 μL del tampón de lisis celular (10 mM Tris-HCl, 100 mM EDTA y 1% SDS, pH 8.0), y centrifugar las muestras a 10.000 x g durante 5 min a 4 °C.
3. Recoger el sobrenadante (500 μL) con una pipeta e incubar a 50 °C con 1,5 μL de Proteinasa K (20 mg/ml, ver Tabla de Materiales) durante 5 h en un bloque térmico.
4. Tratar las muestras con 1,0 μL de 10 mg/ml de solución de RNasa (ver Tabla de Materiales) a 37 °C durante 30 min.
5. Añadir 200 μL de solución de precipitación de proteínas (ver Tabla de Materiales) a los tubos⁷, seguido de una centrífuga a 17.000 x g durante 10 min a 4 °C.
6. Mezclar el sobrenadante (500 μL) con 500 μL de isopropanol al 100%, y luego centrifugar a 20.400 x g durante 10 min a 4 °C.
7. Lave el ADN peletizado dos veces con 1.000 μL de etanol al 70%. Luego, seque al aire (5-10 min a temperatura ambiente), disuelva el ADN en 30 μL de tampón Tris-Cl de 10 mM (pH 8.5).
8. Homogeneizar los tejidos en 600 μL de reactivos de extracción de ARN y añadir 240 μL de agua destilada ultrapura al tubo. Centrifugar los tubos a 12.000 x g durante 15 min a 4 °C.
9. Mezclar el sobrenadante (600 μL) con 600 μL de isopropanol al 100% y transferir la mezcla a una columna de espín de sílice (ver Tabla de Materiales). Centrifugar los tubos a 17.900 x g durante 1 min a 4 °C.
10. Lavar la columna con 750 μL de etanol al 70% y centrifugar la columna dos veces a 17.900 x g durante 1 min cada una a 4 °C.
11. Cargue 15 μL de agua destilada ultrapura a la columna. Centrifugar los tubos a 17.900 x g durante 1 min a 4 °C para eludir el ARN.
12. Calcule y verifique la calidad y cantidad de ADN y ARN utilizando un espectrofotómetro basado en UV. Evaluar la pureza de los ácidos nucleicos utilizando las proporciones A260/A280 (ácidos nucleicos/proteína) y A260/A230 (ácidos nucleicos/sales y otros contaminantes)¹³.
    NOTA: Para la extracción de ARN, se siguió el procedimiento¹² previamente publicado, que resultó en contaminación por fenol (Tabla 1). El ADN y el ARN extraídos de un solo embrión o larvas de fraato producen muestras de baja cantidad y baja calidad. Típicamente, la extracción de ADN de 12 larvas de fraato produce 100-600 ng, mientras que la extracción de ARN utilizando el método actual genera 900-1,500 ng, como se muestra en la Tabla 1.
    NOTA: Los pasos 3.13-3.15 son opcionales para ensayos adicionales de secuenciaciones de alto rendimiento.
13. Calcule las cantidades de ADN y ARN utilizando un espectrofotómetro basado en fluorescencia.
    NOTA: Se calculó la relación entre las cantidades de ARN (concentración basada en UV (ng/μL)/concentración basada en fluorescencia (ng/μL)) para evaluar la calidad para su posterior aplicación experimental. Por ejemplo, cuando las concentraciones basadas en UV y fluorescencia son de 80 ng/uL y 60 ng/uL, respectivamente, la relación será de 1,5 (80/60). Por lo general, las proporciones inferiores a 1,5 indican una pureza suficiente para aplicaciones posteriores que utilizan secuenciación de alto rendimiento¹³.
14. Analizar la calidad del ARN mediante electroforesis de microchip¹⁴.
15. Utilice los ARN calificados para preparar la biblioteca de ARN utilizando un kit de preparación de la biblioteca de ARN (consulte la Tabla de materiales). Secuenciar las bibliotecas utilizando una plataforma adecuada para las bibliotecas preparadas.

Resultados

Establecimiento de líneas de acogida y su mantenimiento
La viabilidad de las larvas recolectadas en el campo se atribuye de manera diferente a la ubicación del campo, las estaciones y las condiciones de cría (por ejemplo, el 90% de la viabilidad en Taiwán, Taoyuan, como se muestra en Arai et ^al.12). Aproximadamente el 30%-50% de los pares generarán la próxima generación como de costumbre. Para H. magnanima y A. honmai, las matrilinas se han mantenido me...

Discusión

Tortricid comprende varias plagas agrícolas y forestales; el presente estudio presentó métodos para criar tortrix a lo largo de generaciones, observar la embriogénesis y el sexo de los insectos, y realizar análisis moleculares utilizando embriones maduros.

Uno de los obstáculos para el estudio de insectos plaga es establecer métodos de cría. Especialmente, la endogamia a veces afecta negativamente la aptitud de la especie. La reducción de la aptitud física por la consanguínea, llama...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1/2 ounce cup	FP CHUPA	CP070009	insect rearing; https://www.askul.co.jp/p/6010417/
1/2 ounce cup lid	FP CHUPA	CP070011	insect rearing; https://www.askul.co.jp/p/6010434/?int_id=recom_DtTogether
99.7% acetic acid	FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan	36289	fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01ALF036289.html
Agilent 2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies	not shown	Nucleic acids quantification; https://www.agilent.com/en/product/automated-electrophoresis/bioanalyzer-systems/bioanalyzer-instrument
Agilent RNA6000 nano kit	Agilent Technologies	5067-1511	Nucleic acids quantification; https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2938-90034_RNA6000Nano_KG .pdf
benzalkonium chloride solution	Nihon Pharmaceutical Co., Ltd	No.4987123116046	Sterilization; https://www.nihon-pharm.co.jp/consumer/products/disinfection.html
Cotton	AOUME	8-1611-02	insect rearing; https://item.rakuten.co.jp/athlete-med/10006937/?scid=af_pc_etc&sc2id=af_113_0_1
DAPI solution	Dojindo, Tokyo, Japan	340-07971	stainings; https://www.dojindo.co.jp/products/D523/
Disodium Hydrogenphosphate	FUJIFILM Wako Chemicals Co.	4.98748E+12	Na2HPO4; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0286.html
dsDNA HS quantification kit	Invitrogen	Q33231	Nucleic acids quantification; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33230?SID=srch-srp-Q33230
Econospin RNA II column	Epoch Life Science Inc.	EP-11201	RNA extraction; http://www.epochlifescience.com/Product/SpinColumn/minispin.aspx
Ethanol	FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan	4.98748E+12	fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0105-0045.html
Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic Acid Tetrasodium Salt Tetrahydrate (4NA)	FUJIFILM Wako Chemicals Co.	4.98748E+12	Cell lysis buffer (EDTA); https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01T02N003.html
Glassine paper	HEIKO	2100010	insect rearing; https://www.monotaro.com/p/8927/0964/?utm_id=g_pla& utm_medium=cpc&utm_source= Adw
heat block WSC-2620 PowerBLOCK	ATTO, Tokyo, Japan	4002620	incubation; https://www.attoeng.site/
heptane	FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan	4.98748E+12	fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0108-0015.html
INSECTA LF	Nosan Co., Ltd	not shown	Artificial diet; https://www.nosan.co.jp/business/fodder/ist.htm
ISOGENII	Nippon Gene	311-07361	RNA extraction; https://www.nippongene.com/siyaku/product/extraction/isogen2/isogen2.html
isopropanol	FUJIFILM Wako Chemicals Co.	4.98748E+12	nucleic acids extraction; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0232-0004.html
Lactic acid	FUJIFILM Wako Chemicals Co.	4.98748E+12	Stainings; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0112-0005.html
methanol	FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan	4.98748E+12	fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0113-0182.html
MSV-3500 vortex	Biosan	BS-010210-TAK	Voltex mixer; https://biosan.lv/products/-msv-3500-multi-speed-vortex/
Nano Photometer NP 80	Implen	not shown	Nucleic acids quantification; https://www.implen.de/product-page/implen-nanophotometer-np80-microvolume-cuvette-spectrophotometer/tech-specs/
Natural pack wide	Inomata chemical	1859	insect rearing; https://www.monotaro.com/g/03035766/?t.q=%E3%83%8A%E3%83%81%E3%83%A5%E3% 83%A9%E3%83%AB%E3%83%91% E3%83%83%E3%82%AF%E3%83% AF%E3%82%A4%E3%83%89
NEBNext Ultra II RNA Library Prep Kit for Illumina	New England BioLabs	E7770S	Library preparation; https://www.nebj.jp/products/detail/2039
orcein	FUJIFILM Wako Chemicals Co.	4.98748E+12	Stainings; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0115-0094.html
Paraformaldehyde	FUJIFILM Wako Chemicals Co.	160-16061	fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-1606.html
Polyoxyethylene(20) Sorbitan Monolaurate	FUJIFILM Wako Chemicals Co.	4.98748E+12	Tween-20; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-2121.html
Portable UV Black Light (4W, 365nm wavelength)	Southwalker Co., Ltd., Kanagawa, Japan	not shown	Insect collection; http://www.southwalker.com/shopping/?pid=1364614057-467328
Potassium Chloride	FUJIFILM Wako Chemicals Co.	4.98748E+12	KCl; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-0354.html
Potassium Dihydrogen Phosphate	FUJIFILM Wako Chemicals Co.	4.98748E+12	KH2PO4; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-0424.html
ProLong Diamond Antifade Mountant	Invitrogen, MA, USA	P36965	antifade; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/P36965
Proteinase K Solution	Merck	71049-4CN	DNA extraction; https://www.merckmillipore.com/JP/ja/product/Proteinase-K-Solution-600-mAU-ml,EMD_BIO-71049
protein precipitation solution	Qiagen	158912	DNA extraction; https://www.qiagen.com/us/products/discovery-and-translational-research/lab-essentials/buffers-reagents/puregene-accessories/?cmpid=PC_DA_NON_ BIOCOMPARE_ProductListing_ 0121_RD_MarketPlace_ProductC
Qubit V4	Invitrogen	Q33238	Nucleic acids quantification; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33238
rifampicin	FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan	4.98748E+12	Sterilization; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0118-0100.html
RNA HS quantification kit	Invitrogen	Q32855	Nucleic acids quantification; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q32852
RNase solution	Nippon Gene	313-01461	RNA extraction; https://www.nippongene.com/siyaku/product/modifying-enzymes/rnase-a/rnase-s.html
Silk Mate 2S	Nosan Co., Ltd	not shown	Artificial diet; https://www.nosan.co.jp/business/fodder/ist.htm
Sodium Chloride	FUJIFILM Wako Chemicals Co.	4.98748E+12	NaCl; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0166.html
Sodium Dodecyl Sulfate	FUJIFILM Wako Chemicals Co.	4.98748E+12	Cell lysis buffer (SDS); https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-1398.html
sodium hypochlorite aqueous solution	FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan	4.98748E+12	egg separation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0220.html
Tetracycline Hydrochloride	FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan	4.98748E+12	Sterilization; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0120-1656.html
Tris-HCl	FUJIFILM Wako Chemicals Co.	4.98748E+12	Cell lysis buffer; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0120-1536.html
ultra-pure distilled water	Invitrogen	10977023	RNA extraction; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10977015