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Resumen

Presentamos un protocolo para detectar compuestos contra el virus de la hepatitis B (VHB) dirigidos a las etapas del ciclo de vida de entrada pre y post-viral, utilizando calorimetría de titulación isotérmica para medir la afinidad de unión (KD) con el polipéptido cotransportador de taurocolato de sodio del huésped. La eficacia antiviral se determinó a través de la supresión de los marcadores del ciclo de vida viral (formación de ADNcc, transcripción y ensamblaje viral).

Resumen

La infección por el virus de la hepatitis B (VHB) se ha considerado un factor de riesgo crucial para el carcinoma hepatocelular. El tratamiento actual solo puede disminuir la carga viral, pero no puede dar lugar a una remisión completa. Un modelo de hepatocitos eficiente para la infección por VHB ofrecería un ciclo de vida viral fiel a la vida que sería crucial para la detección de agentes terapéuticos. La mayoría de los agentes anti-VHB disponibles se dirigen a las etapas del ciclo de vida después de la entrada viral, pero no antes de la entrada viral. Este protocolo detalla la generación de un modelo de hepatocitos competente capaz de detectar agentes terapéuticos dirigidos a las etapas del ciclo de vida de entrada previral y posterior a la entrada viral. Esto incluye la orientación de la unión del polipéptido cotransportador de taurocolato de sodio (NTCP), la formación de cccDNA, la transcripción y el ensamblaje viral basado en imHC o HepaRG como células huésped. Aquí, el ensayo de inhibición de entrada del VHB utilizó curcumina para inhibir las funciones de unión y transporte del VHB a través de NTCP. Los inhibidores se evaluaron para determinar la afinidad de unión (KD) con NTCP utilizando calorimetría de titulación isotérmica (ITC), una herramienta universal para la detección de fármacos contra el VHB basada en parámetros termodinámicos.

Introducción

La infección por el virus de la hepatitis B (VHB) se considera una enfermedad potencialmente mortal en todo el mundo. La infección crónica por VHB está cargada de riesgo de cirrosis hepática y carcinoma hepatocelular1. El tratamiento actual contra el VHB se centra principalmente en la entrada después de la viral utilizando análogos de nucleólidos (NA) e interferón-alfa (IFN-α)2,3. El descubrimiento de un inhibidor de la entrada del VHB, Myrcludex B, ha identificado un nuevo objetivo para los agentes anti-VHB4. La combinación de inhibidores de entrada y NAs en el VHB crónico ha disminuido significativamente la carga viral en comparación con aquellos dirigidos a la replicación viral sola 5,6. Sin embargo, el modelo clásico de hepatocitos para el cribado de los inhibidores de la entrada al VHB está limitado por los bajos niveles de receptores virales (polipéptido cotransportador de taurocolato de sodio, NTCP). La sobreexpresión de hNTCP en células hepatomas (es decir, HepG2 y Huh7) mejora la infectividad del VHB 7,8. Sin embargo, estas líneas celulares expresan bajos niveles de enzimas metabolizadoras de fármacos de fase I y II y exhiben inestabilidad genética9. Los modelos de hepatocitos que pueden ayudar a atacar distintos mecanismos de compuestos candidatos contra el VHB, como la entrada previral, la unión a NTCP y la entrada viral, acelerarían la identificación y el desarrollo de regímenes de combinación eficaces. El estudio de la actividad anti-VHB de la curcumina ha dilucidado la inhibición de la entrada viral como un nuevo mecanismo además de la interrupción posterior a la entrada viral. Este protocolo detalla un modelo de huésped para el cribado de moléculas de entrada anti-VHB10.

El objetivo de este método es explorar compuestos candidatos anti-VHB para la inhibición de la entrada viral, especialmente bloqueando la unión y el transporte de NTCP. Como la expresión de NTCP es un factor crítico para la entrada e infección del VHB, optimizamos el protocolo de maduración de hepatocitos para maximizar los niveles de NTCP11. Además, este protocolo puede diferenciar el efecto inhibitorio sobre la entrada del VHB como inhibición de la unión al VHB versus inhibición de la internalización. El ensayo de captación de ácido taurocólico (TCA) también se modificó utilizando un método basado en ELISA en lugar de un radioisótopo para representar el transporte NTCP12,13. La interacción receptor y ligando fue confirmada por sus estructuras 3D14,15. La inhibición de la función NTCP puede ser evaluada midiendo la actividad de captación de TCA16. Sin embargo, esta técnica no proporcionó evidencia directa de unión de NTCP a los inhibidores candidatos. Por lo tanto, la unión puede investigarse utilizando diversas técnicas, como la resonancia de plasmones de superficie17, ELISA, ensayo de desplazamiento térmico basado en fluorescencia (FTSA)18, FRET 19, AlphaScreen y varios otros métodos20. Entre estas técnicas, el ITC es un estándar objetivo en el análisis de unión porque puede observar la absorción o emisión de calor en casi todas las reacciones21. La afinidad de unión (KD) de NTCP y compuestos candidatos se evaluó directamente mediante ITC; Esos valores de afinidad fueron más precisos que los obtenidos utilizando el modelo de predicción in silico 22.

Este protocolo cubre técnicas de maduración de hepatocitos, infección por VHB y detección de inhibidores de la entrada de VHB. Brevemente, se desarrolló un modelo de hepatocitos basado en líneas celulares imHC y HepaRG. Las células cultivadas se diferenciaron en hepatocitos maduros en 2 semanas. La regulación positiva de los niveles de NTCP se detectó mediante PCR en tiempo real, western blot y citometría de flujo11. El virión de la hepatitis B (VHBcc) se produjo y recolectó de HepG2.2.15. El imHC o HepaRG diferenciado (d-imHC, d-HepaRG) fue tratado profilácticamente con los candidatos anti-VHB 2 h antes de la inoculación con virión VHB. El resultado esperado del experimento fue la identificación de los agentes que disminuyen el VHB celular y la infectividad. La actividad anti-NTCP se evaluó mediante el ensayo de captación de TCA. La actividad de NTCP podría ser suprimida por los agentes que se unieron específicamente a NTCP. La técnica ITC fue empleada para investigar la factibilidad de la unión interactiva que podría predecir inhibidores y sus proteínas diana, determinando la afinidad de unión (KD) del ligando para el receptor a través de interacciones no covalentes del complejo biomolecular23,24. Por ejemplo, K D ≥ 1 × 103 mM representa una unión débil, K D ≥ 1 × 106 μM representa una unión moderada y K D ≤ 1 × 109 nM representa una unión fuerte. El ΔG está directamente correlacionado con las interacciones de unión. En particular, una reacción con ΔG negativo es una reacción exergónica, lo que indica que la unión es un proceso espontáneo. Una reacción con un ΔH negativo indica que los procesos de unión dependen del enlace de hidrógeno y de las fuerzas de Van der Waals. Tanto la captación de TCA como los datos del ITC podrían utilizarse para detectar agentes de entrada anti-VHB. Los resultados de estos protocolos pueden proporcionar una base no solo para la detección contra el VHB, sino también para la interacción con NTCP evaluada a través de la afinidad vinculante y la función de transporte. Este documento describe la preparación y caracterización de la célula huésped, el diseño experimental y la evaluación de la entrada anti-VHB junto con la afinidad de unión a NTCP.

Protocolo

NOTA: Los siguientes procedimientos deben realizarse en una campana de flujo de riesgo biológico de Clase II o en una campana de flujo laminar. El manejo del VHB fue aprobado éticamente por el IRB (MURA2020/1545). Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre todas las soluciones, reactivos, equipos y líneas celulares utilizadas en este protocolo.

1. Preparación de células huésped (hepatocitos maduros)

  1. Cultivar hepatocitos (3,75 × 105 células HepaRG o imHC) y mantener en un matraz de cultivo de 75 cm2 con 10 mL de medio DMEM/F12 suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS), 1% de L-glutamina, 100 U/ml de penicilina y 100 μg/ml de estreptomicina. Espere a que las células alcancen el 80% -90% de confluencia (dentro de 1 semana).
  2. Deseche el medio viejo del matraz y lave las células con 4 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS).
  3. Aspirar el PBS y añadir 4 mL de tripsina-EDTA al 0,05%.
  4. Incubar el matraz en la incubadora a 37 °C durante 2-3 min y comprobar las células adherentes con un microscopio invertido con una lente de objetivo 10x. Asegúrese de que la monocapa se haya desprendido de la superficie de cultivo.
  5. Inhibir la tripsina añadiendo 4 ml del medio de cultivo suplementado con FBS al 10% al matraz y resuspender cuidadosamente las células cosechadas. Transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de 15 ml y centrífuga durante 3 min a 300 × g, 25 °C.
  6. Aspirar el sobrenadante del pellet celular y resuspender con 1-2 ml del medio de cultivo precalentado suplementado con 10% de FBS y antibióticos.
  7. Mezclar 10 μL de cada una de las suspensiones celulares y azul de tripano y contar las células con un hemacitómetro. Asegúrese de que la viabilidad celular sea superior al 90% antes de continuar con el siguiente paso.
  8. Sembrar 1 × 10 6 células por 2 ml en cada pocillo de una placa de6 pocillos y mantener en medio completo DME/F12 hasta que las células alcancen el 100% de confluencia.
  9. Para la maduración hepática, prepare un medio de maduración hepática (medio E de Williams suplementado con 10% de FBS, 100 U/ml de penicilina, 100 μg/ml de estreptomicina, 5 μg/ml de insulina, 50 μM de hidrocortisona, 2 mM de L-glutamina y 2% de DMSO).
  10. Reemplace el medio de cultivo 2 veces por semana.
  11. Mantener los hepatocitos en medio de maduración durante 2 semanas para obtener hepatocitos maduros listos para la infección por VHB.

2. Cuantificación de NTCP celular

  1. Medición de la expresión de NTCP mediante PCR en tiempo real
    1. Recoger la bolita de hepatocitos maduros mediante tripsinización (ver Pasos 1.2-1.5).
    2. Extraer ARN total del pellet celular utilizando un kit de extracción de ARN con tratamiento con DNasa I.
    3. Sintetice ADNc a partir de 200 ng de ARN total utilizando un cebador oligo-dT y un sistema de transcripción inversa siguiendo las instrucciones del fabricante.
    4. Diluir el ADNc a 50 ng/μL y utilizarlo como plantilla para la reacción de PCR. Mezclar 2 μL del ADNc diluido con los reactivos de la mezcla maestra de PCR que contienen la solución del kit de qRT-PCR verde SYBR con cebadores específicos de NTCP de 5 μM (5'-GGACATGAACCTCAGCATTGTG-3' y 5'-ATCATAGATCCCCCTGGAGTAGAT-3').
    5. Para la normalización, use GAPDH como un gen de limpieza con cebadores específicos (5'-GAAATCCCATCACCATCTTCC-3' y 5'-AAATGAGCCCCAGCCTTCTC-3').
    6. Amplificar las muestras de ADNc utilizando un termociclador en las siguientes condiciones de temperatura: 1 ciclo de 3 min a 95 °C (desnaturalización inicial); 40 ciclos de 30 s a 95 °C (desnaturalización), 30 s a 60 °C a 65 °C (recocido), 30 s a 72 °C (extensión); 1 ciclo de 5 min a 72 °C (extensión final).
    7. Calcule el cambio de pliegue NTCP en hepatocitos maduros sobre células indiferenciadas utilizando GAPDH como gen calibrador basado en el método 2-ΔΔCT .
  2. Cuantificación de NTCP mediante análisis de Western blot
    1. Recolectar los hepatocitos con un raspador celular y centrifugarlos a 300 x g, 25 °C durante 5 min para recoger el pellet celular.
    2. Siga las instrucciones del fabricante del tampón RIPA para extraer la proteína celular con 100 μL de tampón RIPA que contiene 1x inhibidor de la proteasa.
    3. Mida la concentración total de proteína utilizando el método de ácido bicinchonínico (BCA).
    4. Mezclar 12,5 μL de proteína con 2x cargando colorante en una proporción de 1:1 por volumen.
    5. Hervir la mezcla de proteínas y la escalera estándar a 95 °C durante 5 min.
    6. Agregue 1x búfer de funcionamiento a la cámara de electroforesis.
    7. Cargue 5 μL de la escalera estándar de proteínas o 20 μL de la mezcla de proteína hervida en un gel de poliacrilamida al 10% (p/v).
    8. Realizar electroforesis en gel: 50 V durante 30 min seguido de 90 V durante 1 h a temperatura ambiente.
    9. Prepare una membrana de PVDF remojándola en metanol durante 30 s, lávela con agua de doble destilación durante 1-2 minutos y sumérjala junto con dos trozos de papel de filtro en el tampón de transferencia durante 10 minutos o hasta que se use.
    10. Coloque el papel de filtro en la placa del ánodo de una celda de transferencia semiseca; luego, coloque la membrana de PVDF, el gel y el papel de filtro en la parte superior, en ese orden.
    11. Transfiera las proteínas del gel a la membrana de PVDF a 10 V durante 25 min a temperatura ambiente.
    12. Bloquear la membrana con solución bloqueadora WB durante 1 h a temperatura ambiente.
    13. Incubar la membrana con polipéptido cotransportador de taurocolato antisódico (anti-NTCP) (dilución 1:100) a 4 °C durante la noche.
    14. Lave la membrana 3 x 10 min con TBST.
    15. Incubar la membrana con anticuerpo anticonejo de cabra conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) (dilución 1:10.000) durante 1 h a temperatura ambiente.
    16. Lave la membrana 3 x 10 min con TBST y luego 1 x 5 min con TBS.
    17. Detecte NTCP utilizando un sustrato HRP (consulte la Tabla de materiales).
    18. Añadir al menos 0,1 ml de solución de sustrato HRP/cm2 de la membrana e incubar la membrana durante 3-5 min en la oscuridad.
    19. Visualice NTCP utilizando un sistema de documentación de gel en el modo de quimioluminiscencia, seleccione la opción de marcador para la membrana, ajuste el tiempo de exposición con el modo acumulativo cada 1 minuto y tome la foto con varios tiempos de exposición durante 5 minutos.
    20. Extraer y sondear la mancha con el anticuerpo anti-GAPDH de ratón (dilución 1:200.000) y el anticuerpo secundario anti-ratón de cabra conjugado con HRP (dilución 1:10.000).
  3. Medición del nivel de NTCP mediante citometría de flujo
    1. Recoger los gránulos celulares de hepatocitos maduros incubando las células con 8 mM EDTA durante 15 min.
      NOTA: Evite el uso de tripsina u otras proteasas que pueden alterar los receptores de la superficie celular. Como NTCP es una proteína receptora de la superficie celular, el daño debido a la tripsinización puede dar resultados negativos.
    2. Fijar los hepatocitos con 300 μL de paraformaldehído al 3,7% en 1x PBS durante 15 min. Transfiera la suspensión celular a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y centrífuga durante 10 min a 300 × g, 25 °C.
    3. Lavar las celdas 2x con 700 μL de 1x PBS con 1% FBS (v/v), centrifugar durante 10 min a 300 × g, 25 °C, añadir 300 μL de Triton X-100 al 0,05% en PBS al pellet celular, e incubar las células a temperatura ambiente durante 20 min para permeabilizarlas.
    4. Centrifugar durante 10 min a 300 × g, 25 °C, lavar el pellet de la celda 3 x 1 min con 700 μL de PBS que contengan 1% de FBS (v/v). Incubar las células con el anticuerpo primario contra NTCP (dilución 1:100) a 4 °C durante 30 min. Lavar las celdas 3 x 1 min con tampón Perm/Wash y centrifugar durante 10 min a 300 × g, 25 °C.
    5. Teñir las células con el anticuerpo secundario conjugado con Alexa Fluor 488 a 4 °C durante 30 min. Lavar las celdas 3 x 1 min con tampón Perm/Wash y centrifugar durante 10 min a 300 × g, 25 °C. Resuspender el pellet celular con 200 μL de PBS con 1% FBS (v/v).
    6. Encienda el citómetro de flujo, caliente el láser durante 15 minutos y realice una limpieza de rutina.
    7. Seleccione los parámetros de medición, incluida la dispersión directa (FSC), la dispersión lateral (SSC) y el isotiocianato de fluoresceína (FITC) o la ficoeritrina (PE), y establezca el ajuste de compensación automática mediante el software. Incluya las muestras de control de compensación: control no teñido, control teñido con FITC y control teñido con PE.
      NOTA: Los parámetros FSC y SSC se utilizan para determinar el tamaño y la granularidad de las celdas individuales para seleccionar la población celular para el análisis de compuerta. El detector de canales de fluorescencia tiene canales FITC y PE . Para este protocolo, seleccione el canal FITC para detectar Alexa Fluor 488.
    8. Ejecutar la muestra no teñida con caudal fluídico medio (60 μL/min), ajustar el umbral de FSC y SSC hasta que cubran la población celular de interés, marcar la región de la puerta en esta área y aplicar a todos los controles de compensación.
    9. Ajuste el tubo fotomultiplicador de fluorescencia (PMT) utilizando el control sin teñir y ajuste el voltaje PMT de FITC o PE en el cuadrante negativo. Ejecute la muestra teñida positiva y ajuste FITC o PE en la escala del cuadrante positivo. Ejecute los controles sin teñir, teñidos con FITC o teñidos con PE, calcule la compensación y aplíquela a la configuración de la muestra. Ejecute la muestra de hepatocitos para medir el nivel de NTCP.
    10. Analice los hepatocitos teñidos utilizando el software del citómetro de flujo (consulte la Tabla de materiales).
      1. En BD FACSuite windows, haga clic en el tubo de control en la pestaña Fuentes de datos y espere a que aparezcan los datos sin procesar.
      2. En la pestaña Hoja de trabajo en el lado derecho, haga clic en el botón Puerta de elipse , seleccione la población de celdas en SSC y el diagrama de puntos FSC usando el cursor del mouse y espere a que aparezca el círculo P1.
      3. Haga clic en el botón Interval Gate (Puerta de intervalo ) y marque la región en el histograma FIFC, comenzando desde el valor de intensidad de fluorescencia más alto hacia el lado derecho. Observe la línea P2 que aparece.
      4. Haga clic en el tubo de experimento y observe que los datos en la pestaña Hoja de trabajo cambian. Haga clic en el botón Estadísticas y luego en el espacio vacío de la hoja de cálculo. Observe los valores estadísticos de la población NTCP que aparecen.

3. Producción de partículas de VHB derivadas del cultivo celular (HBVcc)

  1. Cultivo HepG2.2.15 en medio completo (DMEM suplementado con FBS al 10%, penicilina 100 U/ml y estreptomicina 100 μg/ml) en una placa de Petri de 10 cm durante 24 h.
  2. Sustituir el medio completo suplementado con 380 μg/ml de genética (G418) cuando la HepG2.2.15 alcance la confluencia del 60%-70%. Cosechar el medio acondicionado cada 2 días; conservar el medio que contiene el VHB a 4 °C.
  3. Eliminar los restos celulares centrifugando el sobrenadante a 5.000 × g, 4 °C durante 20 min. Recoja el medio acondicionado con una jeringa de 20 ml y fílvelo a través de un filtro de baja unión a proteínas de 0,45 μm para eliminar los restos celulares.
  4. Para concentrar el VHB, diluir 1 volumen de concentrador con 3 volúmenes del sobrenadante filtrado del Paso 3.3 en un tubo de centrífuga cónico y mezclar cuidadosamente la solución por inversión de tubo. Colocar la mezcla a 4 °C durante 1 h. Centrifugar la solución durante 1 h a 1.500 × g, 4 °C y asegurarse de que se vea un pellet blanquecino.
    NOTA: Por cada 30 ml de sobrenadante filtrado del paso 3.3, agregue 10 ml del concentrador para alcanzar 40 ml de volumen total.
  5. Evaluar el título de VHB (equivalente al genoma) con el replicón WT de VHB 1,3 mer como una curva estándar que varía de 1 × 102 a 1 × 1010 utilizando PCR absoluta en tiempo real, como se describió anteriormente11.
  6. Reconstituir suavemente el pellet en FBS y almacenar hasta 1 año a −80 °C en alícuotas de un solo uso.

4. Ensayo de entrada anti-VHB

  1. Mantener imHC o HepaRG 100% confluente en placas de 6 pocillos en medio de maduración (DMSO al 2% en medio E de Williams, FBS al 10%, penicilina de 100 U/ml, estreptomicina de 100 μg/ml, insulina de 5 μg/ml, hidrocortisona de 50 μM y L-glutamina de 2 mM) durante 2 semanas y cambiar el medio 2 veces por semana.
  2. Aspirar el medio, luego agregar la curcumina (10-30 μM) o 4 μM ciclosporina A (CsA) diluida con medio E de William durante 2 h. Aspirar el candidato inhibidor de entrada del VHB y reemplazarlo con 1 ml de medio E de William que contenga 4% de polietilenglicol.
  3. Añadir partículas de VHB al medio de cultivo a una multiplicidad de infección (MOI) de 100 por pocillo e incubar a 37 °C durante 18 h. Deseche el sobrenadante, agregue 2 ml de PBS frío y agite suavemente para enjuagar el medio viejo con VHB no unido.
  4. Agregue 2 ml de medio E completo de William y cultive durante 7 días. Aspirar el medio, lavar las células con 1x PBS y fijar las células con paraformaldehído al 3,7% en PBS durante 15 min a temperatura ambiente. Permeabilizar y bloquear las células infectadas con solución bloqueadora de FI (0,2% Triton X-100 y 3% de albúmina sérica bovina en PBS) e incubarlas durante 60 min a temperatura ambiente.
  5. Añadir el anticuerpo primario (antígeno central anti-VHB) con una dilución de 1:200 en la solución de bloqueo e incubar durante la noche a 4 °C. Lave las celdas 3 x 1 min con solución de lavado (0.5% Tween 20 en PBS).
  6. Añadir anticuerpo secundario (dilución 1:500) a la solución bloqueadora de FI, incubar durante 1 h a temperatura ambiente y lavar las células 3 x 1 min con solución de lavado.
  7. Monte la muestra con medio de montaje antidecoloración con 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) y cubra con un cubreobjetos de vidrio. Detectar la señal de fluorescencia utilizando un microscopio de fluorescencia equipado con un filtro DAPI (Ex 352-402 nM y Em 417-477) y un filtro de PE (Ex 542-582 y Em 604-644), junto con una lente objetivo 20x, y determinar la actividad de entrada anti-VHB de los compuestos candidatos.

5. Ensayo de unión a células HBV

  1. Mantener imHC o HepaRG 100% confluente en placas de 6 pocillos en medio de maduración (DMSO al 2% en medio E de Williams, FBS al 10%, penicilina de 100 U/ml, estreptomicina de 100 μg/ml, insulina de 5 μg/ml, hidrocortisona de 50 μM y L-glutamina de 2 mM) durante 2 semanas y cambiar el medio 2 veces por semana.
  2. Aspirar el medio, luego agregar curcumina (10-30 μM) o ciclosporina A (4 μM) diluida en medio E de William durante 2 h. Aspirar el inhibidor de entrada del VHB y reemplazarlo con 1 ml de medio E de William que contenga 4% de polietilenglicol.
  3. Añadir partículas de VHB al medio de cultivo a un MOI de 100 por pocillo e incubar a 4 °C durante 2 h para permitir la unión del VHB a los hepatocitos. Deseche el medio que contiene VHB no unido, agregue 2 ml de PBS frío y agite suavemente para eliminar los restos del medio gastado.
  4. Recolecte las células infectadas usando un raspador celular e interrumpa las células con tampón de lisis. Transfiera el lisado a un tubo de recolección y extraiga el ADN total para evaluar el ADN del VHB utilizando PCR en tiempo real con cebadores específicos para el VHB (cebador directo: 5'- GTT GCC CGT TTG TCC TCT AATTC-3', y cebador inverso: 5'- GGA GGG ATA CAT AGA GGT TCC TTG A-3') utilizando PRNP (cebador delantero: 5'- GACCAATTTATGCCTACAGC-3', cebador inverso: 5'- TTTATGCCTACAGCCTCCTA-3') como control interno.
  5. Amplificar los productos de PCR en un termociclador utilizando las condiciones de temperatura descritas en el paso 2.1.
  6. Calcular los niveles relativos de ADN del VHB/1 × 106 células en tratamiento versus control utilizando PRNP como gen calibrador basado en el método 2-ΔΔCT .

6. Ensayo de captación de ácido taurocólico (TCA)

  1. Mantener células imHC y HepaRG 100% confluentes en medio de maduración durante 14 días.
  2. Aspirar el medio y lavar los hepatocitos con 1x PBS. Añadir curcumina o ciclosporina A (10-50 μM) diluida en medio E de William durante 2 h. Reemplace el medio con la solución de ácido taurocólico sódico (hidrato de taurocolato de sodio 0,5 M en 1x HEPES) e incubar durante 15 min a temperatura ambiente.
  3. Aspirar la solución de ácido taurocólico sódico y lavar 3 veces con 1x HEPES frío. Agregue 300-500 μL de HEPES frío 1x y coseche las células con raspadores de células en hielo.
  4. Homogeneizar las células por ultrasonido a una frecuencia de 20 kHz durante 20 s e incubar en hielo durante 5 min. Centrifugar los lisados a 10.000 × g durante 20 minutos para precipitar los restos celulares. Recoja el sobrenadante y evalúe la concentración intracelular de ácido taurocólico utilizando un kit de ensayo ELISA TCA (consulte la Tabla de materiales).

7. Determinación de las interacciones proteína-ligando mediante calorimetría de titulación isotérmica

NOTA: Este sistema de ensayo fue desarrollado en base al software MicroCal PEAQ-ITC (ITC).

  1. Preparar el tampón (tampón Tris-HCl de 50 mM, pH 7,0).
  2. Prepare 15 μM de NTCP en el tampón.
  3. Preparar 150 μM de soluciones candidatas de inhibidores de la entrada del VHB en el tampón.
  4. Lave la celda de muestra, la celda de referencia y la jeringa en el instrumento ITC utilizando el tampón (Paso 7.1.).
    1. Inicie el software ITC haciendo doble clic en el icono del software en los sistemas Windows. En la pestaña Ejecutar resaltado del experimento, seleccione microCal Method for 19 Injection.itcm y haga clic en abrir. Cuando se abra una nueva ventana, haga clic en la pestaña limpiar y, en la ventana Método de limpieza, seleccione el botón Lavar para Método de limpieza celular y el botón Enjuagar para Método de limpieza de jeringas. Haga clic en Siguiente y siga las instrucciones en pantalla.
      NOTA: El paso de lavado puede tardar 1,4 h en completarse.
  5. Cargue la muestra en el ITC; en la pestaña Ejecutar experimento , haga clic en el botón Cargar y lea las instrucciones en pantalla. Haga clic en siguiente y siga las instrucciones del video hasta que se complete este paso de carga.
    1. Llene la celda de referencia con tampón de solución con una jeringa. Llene la celda de muestra con NTCP de 15 μM en tampón con una jeringa y retire el exceso de solución de NTCP sobre la celda de muestra. Llene la jeringa con una solución de 150 μM de la curcumina (ligando), evitando burbujas de aire en la jeringa.
  6. Ejecute el ejemplo y, en la pestaña Ejecutar experimento , haga clic en el botón Ejecutar . Observe las ventanas en el lado izquierdo que muestran información experimental y configuración experimental. Introduzca las concentraciones de ligando y proteína como 150 μM en [ Syr], 15 μM en [Cell] y 25 °C en temperatura.
  7. En el software, haga clic en iniciar para realizar el proceso de inyección y espere 1,4 h para que se complete la interacción proteína-ligando.
    NOTA: El botón de análisis desvanecido aparece debajo de las ventanas del software.
  8. Observe que el botón de análisis se ilumina después de completar la inyección. Haga clic en el botón de análisis en el software de control para analizar los datos sin procesar utilizando el software de análisis . Haga clic en vista general para mostrar los datos sin procesar y elija el modelo de ajuste como Un conjunto de sitio de enlace.
  9. Asegúrese de que el estado de enlace muestra los datos experimentales (enlace, sin enlace, control o comprobación de datos) y que los valores del experimento (KD, ΔG, ΔH, TΔS y N) se presentan en el panel de software.
  10. Exporte los parámetros termodinámicos que predicen la unión de interacción, incluidos el enlace de hidrógeno, el enlace de van der Waals y la interacción hidrofóbica en formato tif o jpeg.
  11. Una vez finalizado el experimento, lave la celda de muestra siguiendo el paso 7.4.

8. Análisis estadístico

  1. Realizar todos los experimentos en tres réplicas independientes (n = 3).
  2. Presentar datos experimentales como medios ± SD, y realizar análisis estadísticos utilizando el software de análisis estadístico deseado.
  3. Utilice una prueba t de Student no pareada de dos colas para comparar entre dos valores medios o aplique el análisis unidireccional de varianza (ANOVA) con Dunnett para comparaciones múltiples entre múltiples valores a un valor de control. Establezca el nivel de significancia en p ≤ 0,05.

Resultados

Se observaron características de maduración hepática, incluyendo células binucleadas y morfología de forma poligonal (Figura 1), especialmente en la etapa diferenciada de imHC (Figura 1A). Se midió un gran aumento en la expresión de NTCP en d-HepaRG y d-imHC a 7 veces y 40 veces, respectivamente (Figura 1B). La forma altamente glicosilada de NTCP, postulada para conferir susceptibilidad a la entrada de VHB, se detectó más e...

Discusión

La infección por VHB se inicia a través de la unión de baja afinidad a proteoglicanos de heparán sulfato (HSPG) en los hepatocitos25, seguida de la unión a NTCP con posterior internalización a través de endocitosis26. Como el NTCP es un receptor crucial para la entrada del VHB, la entrada dirigida al VHB puede traducirse clínicamente para disminuir la infección de novo , la transmisión maternoinfantil (MTCT) y la recurrencia después del trasplante de hí...

Divulgaciones

Los autores declaran que la investigación se llevó a cabo en ausencia de cualquier relación comercial o financiera que pudiera interpretarse como un posible conflicto de intereses.

Agradecimientos

Este proyecto de investigación cuenta con el apoyo de la Universidad de Mahidol y la Investigación e Innovación Científica de Tailandia (TSRI) otorgados por separado a A. Wongkajornsilp y K. Sa-ngiamsuntorn. Este trabajo fue apoyado financieramente por la Oficina del Consejo Nacional de Políticas de Investigación e Innovación en Ciencias de la Educación Superior a través de la Unidad de Gestión de Programas para la Competitividad (número de subvención C10F630093). A. Wongkajornsilp recibió una beca Chalermprakiat de la Facultad de Medicina del Hospital Siriraj de la Universidad de Mahidol. Los autores desean agradecer a la señorita Sawinee Seemakhan (Excellent Center for Drug Discovery, Facultad de Ciencias, Universidad de Mahidol) por su ayuda con la técnica ITC.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Cell lines
HepaRG Cells, CryopreservedThermo Fisher ScientificHPRGC10
Hep-G2/2.2.15 Human Hepatoblastoma Cell LineMerckSCC249
Reagents
4% Paraformadehyde Phosphate Buffer SolutionFUJIFLIM Wako chemical163-20145
BD Perm/Wash bufferBD Biosciences554723Perm/Wash buffer
Cyclosporin Aabcam59865-13-3
EDTAInvitrogen15575-0388 mM
G 418 disulfate saltMerck108321-42-2
Halt Protease Inhibitor Cocktail  EDTA-free (100x)Thermo Scientific78425
HEPESMerck7365-45-9
illustraTM RNAspin Mini RNA isolation kitsGE Healthcare25-0500-71
illustra RNAspin Mini RNA Isolation KitGE Healthcare25-0500-71
ImProm-II Reverse Transcription SystemPromegaA3800
KAPA SYBR FAST qPCR KitKapa BiosystemsKK4600
Lenti-X ConcentratorTakara bioPT4421-2concentrator
Luminata crescendo Western HRP substrateMerckWBLUR0100
Master Mix (2x) UniversalKapa BiosystemsKK4600
Nucleospin DNA extraction kitmacherey-nagel1806/003
Phosphate buffered salineMerckP3813
Polyethylene glycol 8000Merck25322-68-3
ProLong Gold Antifade MountantThermo scientificP36930
Recombinant NTCPCloud-CloneRPE421Hu02
RIPA Lysis Buffer (10x)Merck20-188
TCASigma345909-26-4
TCA Elisa kitMybiosourceMB2033685
Triton X-100Merck9036-19-5
Trypsin-EDTAGibco25200072Dilute to 0.125%
Antibodies
    Anti-NTCP1 antibodyAbcamab1310841:100 dilution
    Anti-GAPDH antibodyThermo Fisher ScientificAM43001:200,000 dilution
   HRP-conjugated goat anti-rabbit antibodyAbcamab2057181:10,000 dilution
   HRP goat anti-mouse secondary antibodyAbcamab970231:10,000 dilution
   Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488InvitrogenA-110081:500 dilution
Reagent composition
1° Antibody dilution buffer
     1x TBST
     3% BSASigmaA7906-100GWorking concentration: 3%
     Sodium azideSigma199931Working concentration: 0.05%
Hepatocyte Growth Medium
      DME/F12Gibco12400-024
      10% FBSSigma AldrichF7524
      1% Pen/StrepHyClonSV30010
      1% GlutaMAXGibco35050-061
Hepatic maturation medium
      Williams’ E mediumSigma AldrichW4125-1L
      10% FBSSigma AldrichF7524
      1% Pen/StrepHyClonSV30010
      1% GlutaMAXGibco35050-061
      5 µg/mL  InsulinSigma Aldrich91077C-100MG
      50 µM hydrocotisoneSigma AldrichH0888-1g
     2% DMSOPanReac AppliChemA3672-250ml
IF Blocking solution
     1x PBSGibco21300-058
     3% BSASigmaA7906-100GWorking concentration: 3%
     0.2% Triton X-100SigmaT8787Working concentration: 0.2%
RIPA Lysis Buffer SolutionMerck20-188Final concentration: 1X
     Protease Inhibitor CocktailThermo Scientific78425Final concentration: 1X
       Na3VO4Final concentration: 1 mM
       PMSFFinal concentration: 1 mM
       NaFFinal concentration: 10 mM
Western blot reagent
     10x Tris-buffered saline (TBS)Bio-Rad170-6435Final concentration: 1X
     Tween 20Merck9005-64-5
     1x TBST0.1% Tween 20
     1x PBSGibco21300-058
     Pierce BCA Protein Assay KitThermo Fisher ScientificA53225
     Polyacrylamide gelBio-Rad161-0183
     Ammonium Persulfate (APS)Bio-Rad161-0700Final concentration: 0.05%
    TEMEDBio-Rad161-0800Stacker gel: 0.1%, Resolver gel: 0.05%
    2x Laemmli Sample BufferBio-Rad161-0737Final concentration: 1X
    Precision Plus Protein Dual Color StandardsBio-Rad161-0374
WB Blocking solution/ 2° Antibody dilution buffer
     1x TBST
     5% Skim milk (nonfat dry milk)Bio-Rad170-6404Working concentration: 5%
1x Running buffer 1 L
      10x Tris-buffered saline (TBS)Bio-Rad170-6435Final concentration: 1X
     GlycineSigmaG889814.4 g
     SDSMerck7910Working concentration: 0.1%
Blot transfer buffer 500 mL
      10x Tris-buffered saline (TBS)Bio-Rad170-6435Final concentration: 1X
     GlycineSigmaG88987.2 g
     MethanolMerck106009100 mL
Mild stripping solution 1 LAdjust pH to 2.2
    GlycineSigmaG889815 g
     SDSMerck79101 g
     Tween 20Merck9005-64-510 mL
Equipments
15 mL centrifuge tubeCorning430052
50 mL centrifuge tubeCorning430291
Airstream Class IIEsco2010621Biological safety cabinet
CelCulture CO2 IncubatorEsco2170002Humidified tissue culture incubator
CFX96 Touch Real-Time PCR DetectorBio-Rad1855196
FACSVerse Flow CytometerBD Biosciences651154
Graduated pipettes (10 mL)Jet BiofilGSP010010
Graduated pipettes (5 mL)Jet BiofilGSP010005
MicroCal PEAQ-ITCMalvernIsothermal titration calorimeters
Mini PROTEAN Tetra CellBio-Rad1658004Electrophoresis chamber
Mini Trans-blot absorbent filter paperBio-Rad1703932
Omega Lum G Imaging SystemAplegen8418-10-0005
Pipette controllerEppendorf4430000.018Easypet 3
PowerPac HCBio-Rad1645052Power supply
PVDF membraneMerckIPVH00010
T-75 cell culture flaskCorning431464U
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer CellBio-Rad1703940Semi-dry transfer cell
Ultrasonic processor (Vibra-Cell VCX 130)Sonics & Materials
Versati Tabletop Refrigerated CentrifugeEscoT1000RCentrifuge with swinging bucket rotar

Referencias

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