Imágenes confocales y de superresolución del tráfico intracelular polarizado y la secreción de proteínas de la membrana basal durante la oogénesis de Drosophila

Resumen

La membrana basal es esencial para la morfogénesis de tejidos y órganos durante el desarrollo. Para comprender mejor los mecanismos que conducen a la colocación adecuada de esta estructura, el protocolo presentado describe métodos para visualizar y caracterizar el tráfico intracelular y la secreción de proteínas de la membrana basal en células epiteliales utilizando microscopía confocal y de superresolución.

Resumen

La membrana basal (BM), una lámina especializada de matriz extracelular presente en el lado basal de las células epiteliales, es crítica para el establecimiento y mantenimiento de la morfología del tejido epitelial y la morfogénesis de los órganos. Además, el BM es esencial para el modelado de tejidos, sirviendo como una plataforma de señalización y proporcionando fuerzas externas para dar forma a los tejidos y órganos. A pesar de los muchos papeles importantes que desempeña el BM durante el desarrollo normal y las condiciones patológicas, las vías biológicas que controlan el tráfico intracelular de vesículas que contienen BM y cómo la secreción basal conduce a la deposición polarizada de las proteínas BM son poco conocidas. El epitelio folicular del ovario de Drosophila es un excelente sistema modelo para estudiar la deposición basal de proteínas de membrana BM, ya que produce y secreta todos los componentes principales del BM. Las imágenes confocales y de superresolución combinadas con el procesamiento de imágenes en tejidos fijos permiten la identificación y caracterización de factores celulares específicamente involucrados en el tráfico intracelular y la deposición de proteínas BM. Este artículo presenta un protocolo detallado para teñir y obtener imágenes de vesículas que contienen BM y BM depositadas utilizando proteínas marcadas endógenamente en el epitelio folicular del ovario de Drosophila . Este protocolo se puede aplicar para abordar cuestiones cualitativas y cuantitativas y fue desarrollado para acomodar el cribado de alto rendimiento, lo que permite la identificación rápida y eficiente de los factores involucrados en el tráfico intracelular polarizado y la secreción de vesículas durante el desarrollo del tejido epitelial.

Introducción

La membrana basal (BM) es una lámina delgada de matriz extracelular adherente a células en capas (ECM) crítica para la estructura epitelial y la morfogénesis¹. Comprende ~ 50 proteínas y se encuentra ubicuamente subyacente a las células epiteliales y endoteliales, y entuba las células esqueléticas, lisas y del músculo cardíaco y los adipocitos ^1,2,3. Los tres componentes principales de la BM en el lado basal de las células epiteliales son el colágeno IV, el perlecano y las lamininas. El BM subyace a las células epiteliales y es responsable de muchas funciones, incluida la separación y barrera tisular, el crecimiento y el soporte, y la polarización celular 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 . Su papel como plataforma de señalización regula la morfología y diferenciación de las células epiteliales y tejidos durante^el desarrollo ^3,13,14. Además, la mala regulación de la BM y/o una brecha en su integridad son las causas primarias de muchas afecciones patológicas, incluida la metástasis tumoral ^2,15,16. A pesar de las funciones esenciales realizadas por el BM durante la morfogénesis de tejidos y órganos, los componentes de la(s) vía(s) biológica(s) dedicada(s) al tráfico intracelular polarizado y la secreción de proteínas BM son vagamente conocidos.

Para estudiar el tráfico intracelular de vesículas que contienen BM y la secreción de proteínas BM por las células epiteliales, el epitelio folicular (FE) del ovario de Drosophila es un poderoso sistema modelo (Figura 1). Un ovario de Drosophila comprende 16-20 estructuras largas, en forma de tubo, llamadas ovarioles (Figura 1A, B)17,18,19. Cada ovariole se puede considerar como una línea de ensamblaje de huevos, con la progresión de edad de las cámaras de huevos (que cada una da lugar a un huevo) que comienza en el extremo anterior y se mueve hacia atrás, hasta que el óvulo maduro sale a través del oviducto. Cada cámara de óvulos está encapsulada por la FE, una monocapa de células foliculares somáticas (FC), que rodea las células de la línea germinal central (GC). La FE está altamente polarizada con una distinta polaridad apical-basal donde el dominio apical se enfrenta a la línea germinal, y las proteínas BM se secretan basalmente^18,19. Los FC secretan activamente todos los componentes principales del BM, incluyendo Colágeno IV, Perlecan y Lamininas^20,21. En las células epiteliales como las FC, los componentes BM se producen y requieren una vía de secreción polarizada especializada para su deposición extracelular. Por ejemplo, en el caso del componente más abundante del BM, el colágeno IV (Coll IV), los detalles que rodean su tráfico intracelular polarizado y su secreción son vagos a pesar de que su producción y deposición son el foco de muchos estudios. Coll IV se traduce en el retículo endoplásmico (RE), que es también donde cada fibrilla, compuesta de tres polipéptidos (dos cadenas α1 y una cadena α2), se ensambla en una triple hélice²². El plegamiento y la función adecuados de Coll IV requieren chaperonas y enzimas ER, incluidas lisil y prolil-hidroxilasas como Plod y PH4αEFB 20,22,23,24,25,26. Estas enzimas posttraduccionales regulan la clasificación ER de Coll IV, ya que la pérdida de cada una hace que Coll IV quede atrapado en el ER basal 20,23,24,25,26. Luego, el Coll IV recién sintetizado sale de la sala de emergencias para el Golgi en vesículas recubiertas de COPII. El receptor de carga Tango1 ayuda a empaquetar colágenos en vesículas de Golgi de gran tamaño que pueden acomodar grandes proteínas multiméricas^20,27. Una vez que Coll IV se empaqueta en vesículas exocíticas intracelulares, se secreta específicamente basalmente de las células epiteliales. Para dirigir la deposición de BM al lado basal, las células epiteliales requieren otro conjunto de factores específicamente dedicados a la secreción de BM polarizada. Utilizando la FE del ovario de Drosophila, se han caracterizado algunos componentes de este novedoso proceso celular, incluidos los factores de intercambio de nucleótidos (GEFs) Crag y Stratum, las GTPasas Rab8 y Rab10, así como los niveles de fosfoinositida PI(4,5)P2, y las proteínas motoras Kinesin 1 y 3 20,28,29,30,31 . Estos componentes son críticos para asegurar la distribución polarizada de las proteínas BM.

Para monitorizar la localización intracelular de las proteínas BM en la FE, se pueden utilizar proteínas de membrana basal marcadas endógenamente (trampas proteicas), como Viking-GFP (Vkg-GFP o α2 Coll IV-GFP) y Perlecan-GFP (Pcan-GFP)^32,33. Se ha demostrado que estas líneas trampa de proteínas reflejan con precisión la distribución endógena de las proteínas BM y permiten una detección más sensible del tráfico vesicular^28,30. Los componentes implicados en la deposición polarizada de BM en la FE se caracterizaron por primera vez utilizando líneas trampa de proteínas para Vkg-GFP y Pcan-GFP 20,28,29,30. Las trampas de proteínas se pueden usar en diferentes orígenes genéticos, incluidos mutantes y líneas Gal4 ³⁴. Además, las trampas de proteínas se pueden utilizar en combinación con colorantes fluorescentes y/o inmunotinción de fluorescencia, lo que permite una caracterización precisa de la localización de proteínas BM al comparar condiciones de tipo salvaje y mutante³⁵.

Para evaluar de manera precisa y eficiente la distribución y localización de las vesículas que contienen proteínas BM, la microscopía de barrido láser confocal (CLSM) y las técnicas de imagen de superresolución presentan una ventaja significativa para otros enfoques de imágenes. Estos enfoques combinan imágenes de alta resolución con relativa facilidad de uso. CLSM es una técnica de microscopía que permite una resolución óptica mejorada mediante el escaneo de la muestra con un láser de una manera de escaneo ráster utilizando galvanómetros. La abertura estenopeica es un componente central de un microscopio confocal. Al bloquear las señales desenfocadas que vienen de arriba o por debajo del plano focal, la apertura estenopeica da como resultado una resolución muy superior en el eje z³⁶. Esto también permite obtener una serie de imágenes en el plano z, llamadas z-stack, correspondientes a una serie de secciones ópticas. Posteriormente, las pilas z crean una imagen 3D de la muestra, a través de la reconstrucción 3D, con la ayuda de un software de imágenes. Los microscopios convencionales de epifluorescencia (campo ancho), a diferencia de los microscopios confocales, permiten que la luz desenfocada contribuya a la calidad de la imagen, disminuyendo la resolución de la imagen y el contraste^36,37. Esto hace que la microscopía de epifluorescencia sea un candidato menos atractivo cuando se estudia la localización o colocalización de proteínas.

Aunque CLSM es un enfoque adecuado para diversas aplicaciones, incluidas las imágenes y la caracterización del tráfico intracelular de proteínas BM, todavía presenta un problema cuando se toman imágenes de muestras por debajo del límite de difracción de luz de Abbe (200-250 nm). Al obtener imágenes de tales muestras, la microscopía confocal, especialmente cuando se utiliza un objetivo de aceite, puede dar como resultado una alta resolución. Sin embargo, las técnicas de superresolución superan el límite de la microscopía confocal. Existen varios enfoques para lograr la microscopía de superresolución, cada uno con límites de resolución específicos y cada uno apropiado para diferentes análisis. Estos enfoques incluyen microscopía de localización fotoactivada (PALM) o microscopía de reconstrucción óptica estocástica (STORM), microscopía de agotamiento por emisión estimulada (STED), microscopía de iluminación estructurada (SIM) y microscopía Airyscan (superresolución) ^{38,39,40,41,42,43,44,45,46} . Aunque Airyscan tiene una resolución más gruesa que PALM / STORM, STED y SIM, aún puede lograr una resolución de hasta ~ 120 nm (aproximadamente el doble de la resolución de CLSM). Además, se ha demostrado que este enfoque de microscopía de superresolución tiene una ventaja sobre la SIM y otras técnicas de superresolución al obtener imágenes de muestras gruesas y muestras con una baja relación señal-ruido^47,48.

Airyscan es una tecnología de microscopía confocal de superresolución relativamente nueva⁴⁶. A diferencia de los CLSM tradicionales, que utilizan los detectores estenopeicos y de un solo punto para rechazar la luz desenfocada, este enfoque de superresolución utiliza un detector de área de tubo fotomultiplicador de 32 canales de fosfuro de arseniuro de galio (GaAsP) que recoge toda la luz en cada posición de escaneo⁴⁵. Cada uno de los 32 detectores funciona como un pequeño agujero de alfiler, reduciendo el tamaño del agujero de la unidad aireada (U.A.) tradicional 1.0 a un 0.2 A.U. mejorado, lo que permite una resolución aún mayor y una relación señal-ruido, al tiempo que mantiene la eficiencia de un diámetro⁴⁵ de 1.25 A.U. Además, la deconvolución lineal utilizada por Airyscan da como resultado un aumento de hasta 2 veces en la resolución⁴⁵. Teniendo esto en cuenta, CLSM, y específicamente la microscopía de superresolución, son muy adecuados para estudiar las proteínas BM y las proteínas que regulan la deposición basal de las proteínas BM, ya que pueden producir imágenes de muy alta resolución para estudios de localización y colocalización, proporcionando así nuevos conocimientos sobre los eventos espaciales, temporales y moleculares que controlan estos procesos.

Un enfoque alternativo a la microscopía confocal que se puede utilizar para realizar experimentos de localización es la deconvolución de imágenes. Dado que la microscopía de campo ancho permite que la luz desenfocada llegue a los detectores, se pueden aplicar algoritmos matemáticos y computacionales de deconvolución para eliminar o reasignar la luz desenfocada de las imágenes obtenidas por microscopía de campo ancho, mejorando así la resolución y el contraste de la imagen⁴⁹. Los algoritmos de deconvolución también se pueden aplicar a imágenes confocales para aumentar aún más la resolución y el contraste, produciendo imágenes finales casi comparables a las de la microscopía de superresolución⁵⁰. Airyscan hace uso de la deconvolución basada en el filtro Weiner junto con la reasignación de píxeles de Sheppard, lo que resulta en una resolución espacial altamente mejorada y una relación señal-ruido. En comparación con la microscopía confocal, se observa un aumento de 2x en la resolución en las tres dimensiones espaciales (120 nm en x e y, y 350 nm en z) cuando se utiliza esta técnica de microscopía de superresolución^45,51.

Este manuscrito proporciona protocolos detallados y optimizados para teñir, adquirir y visualizar el tráfico intracelular y la deposición de proteínas BM utilizando la FE del ovario de Drosophila como sistema modelo junto con microscopía confocal y de superresolución. Las líneas de Drosophila que expresan proteínas de membrana basal marcadas endógenamente, por ejemplo, Vkg-GFP y Pcan-GFP, son herramientas eficientes y precisas para visualizar el tráfico y la secreción de proteínas BM. Además, se pueden usar fácilmente en diferentes antecedentes genéticos, incluidas las líneas mutantes y Gal4 / UAS ³⁴. Aunque se recomiendan las proteínas de la membrana basal marcadas endógenamente, el uso de anticuerpos contra proteínas BM específicas también es compatible con los protocolos descritos. Estos protocolos son particularmente útiles para los científicos que están interesados en estudiar el tráfico intracelular y la secreción de proteínas BM en el tejido epitelial intacto utilizando imágenes confocales y de superresolución. Además, la capacidad de combinar el análisis del tejido epitelial con las herramientas expansivas de la genética Drosophila hace que este enfoque sea especialmente poderoso. Finalmente, estos protocolos podrían adaptarse fácilmente para estudiar el tráfico vesicular y la clasificación de otras proteínas de interés.

Protocolo

1. Preparación de moscas para disecciones de ovarios

1. Coloque 10-15 moscas hembra de Drosophila melanogaster (1-2 días de edad) del genotipo deseado en un vial estrecho que contenga ~ 8 ml de mosca mediana de Drosophila rociada con una pequeña cantidad de levadura de panadería granulada 2-3 días antes de la disección a 25 ° C. Agregar algunos machos al vial puede aumentar el rendimiento de la cámara de huevos. Sin embargo, asegúrese de que el número total de moscas no exceda de 20, ya que esto puede afectar negativamente el desarrollo de los ovarios.
   NOTA: La descripción de los hombres y mujeres de Drosophila, y consejos y sugerencias útiles para científicos sin experiencia previa en Drosophila se pueden encontrar en los artículos citados^34,52. Agregar levadura estimulará la producción de óvulos y generará ovarios con diferentes etapas representadas. Además, también engordará los ovarios y los hará más fáciles de extirpar. La levadura húmeda también se puede usar en lugar de la levadura granulada, sin embargo, para las poblaciones más débiles, las moscas pueden atascarse y morir.

2. Disección y fijación de ovarios

NOTA: Para obtener recursos adicionales sobre disección y tinción de ovarios, los lectores son dirigidos a los protocolos citados 53,54,55.

1. El día de la disección, prepare una solución de fijación fresca con una concentración final de paraformaldehído al 4% (PFA) diluyendo la solución madre de PFA en solución salina tampón de fosfato (PBS) 1x.
2. Anestesiar las moscas usando CO_{2 y colocarlas} en una almohadilla para moscas. Mantenga las moscas anestesiadas hasta la disección. Considere las moscas debidamente anestesiadas una vez que sus movimientos han cesado, lo que generalmente toma 10-20 s.
   NOTA: Aunque se recomienda el uso de CO₂ como una opción más segura y rápida, las moscas se pueden anestesiar con hielo.
3. Coloque un portaobjetos cóncavos de vidrio o un plato de tinción con pozos de depresión poco profundos bajo un microscopio de disección y llene los pozos con 1x PBS.
4. Agarra una mosca hembra en la parte inferior del tórax con un par de fórceps. Asegurar el sexo de las moscas por la ausencia de genitales masculinos en el extremo posterior del abdomen y la ausencia de peines sexuales en sus patas delanteras como característica secundaria⁵². Diseccionar moscas individualmente usando otro par de fórceps (paso 2.5) mientras las sumerge en pozos llenos de 1x PBS bajo el microscopio de disección (se recomienda un aumento de 20x).
5. Mientras mira a través del microscopio de disección, use otro par de fórceps para tirar de la parte posterior del abdomen de la mosca, haciendo que los órganos internos (por ejemplo, ovarios, intestino) sean visibles.
6. Apriete suavemente la parte anterior del abdomen de la mosca (como con un tubo de pasta de dientes) para forzar los ovarios a salir del abdomen. Este método debe mantener los ovarios intactos. Separe y retire cuidadosamente otros órganos y restos de moscas.
7. Usando fórceps o agujas de disección, separe los ovarioles del ovario mientras mantiene intacta la estructura general del ovario. El propósito de este paso es romper la vaina muscular que cubre los ovarios y permitir una tinción más eficiente y homogénea.
8. Transfiera rápidamente los ovarios a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml que contenga 1x PBS y mantenga el tubo en hielo hasta que se diseccionen todas las moscas. No mantenga el tubo en hielo si se van a visualizar microtúbulos o microfilamentos (o vesículas traficadas por estos componentes citoesqueléticos), ya que esto puede causar despolimerización.
9. Una vez que todos los ovarios se diseccionan y se transfieren a un tubo de microcentrífuga, permita que se hundan en el fondo del tubo y elimine todos menos ~ 50 μL del PBS. Agregue 1 ml de PFA al 4% y colóquelo en un balancín de plataforma nutating durante 15 min. Es importante verificar si los ovarios se mueven hacia adelante y hacia atrás en la solución de fijación para permitir una fijación adecuada, ya que la fijación incompleta podría provocar problemas de tinción e imágenes.
   NOTA: La velocidad del nutator no es crucial. Mientras que algunos nutators tienen un control de velocidad, otros vienen con una velocidad preestablecida. La velocidad preestablecida es suficiente y, si es ajustable, se establece en 40-50 rpm.
10. Retire la solución de fijación (como en el paso 2.9) y luego realice dos lavados rápidos con 1 ml de 1 pb pb que contenga 0.1% Triton-X 100 (1x PBST), invirtiendo suavemente los tubos de microfuge 5-6 veces. Luego, proceda con cuatro lavados de 10-15 minutos (lavado largo) con 1 ml de 1x PBST (40-60 min en total).
    NOTA: Se recomienda usar 1x PBS + 0.1% Triton-X 100 para lavados, ya que aumentar el porcentaje de detergente podría resultar en la desnaturalización de GFP, lo que lleva a una disminución de la fluorescencia y la detección de proteínas BM marcadas con GFP.
11. Para la tinción de tinte, por ejemplo, tinción de ADN y F-actina, continúe con el paso 3. Para la inmunotinción, continúe con el paso 4. Los ovarios se pueden almacenar en 1x PBST a 4 °C durante un máximo de 24 h antes de continuar.

3. Tinción estándar de ADN/F-actina

1. Después de la fijación y el lavado, retire el PBST. Añadir 500 μL de ADN y solución de tinción de F-actina. Para preparar la solución de ADN/F-actina, mezcle Hoechst (tinción de ADN; dilución 1:1000 de solución madre de 1 mg/ml) y faloidina marcada con fluoróforo (tinción de F-actina; dilución 1:500 para Alexa Fluor 546 o dilución 1:100 para Alexa Fluor 647, cada una de 66 μM solución madre) en 500 μL de PBST.
2. Cubra los tubos con papel de aluminio para mantener los ovarios y los tintes en la oscuridad para mantener la fluorescencia para obtener imágenes eficientes e incube en un balancín de plataforma nutating durante 15 minutos.
3. Después de la incubación, retire la solución de ADN/F-actina (como en el paso 2.9). Realice dos lavados rápidos y tres lavados largos (10-15 min) en 1x PBST como se describe en el paso 2.10. Continúe con el montaje como se describe en el paso 5.

4. Inmunotinción por fluorescencia

NOTA: Este es un protocolo de inmunotinción estándar para imágenes fluorescentes y es compatible con la mayoría de los anticuerpos primarios.

1. Bloqueo e inmunotinción primaria de anticuerpos (Día 1)
   1. Después de la fijación y el lavado, retire pbST como se describe en el paso 2.9. Agregue 1 ml de solución de bloqueo (PBS + 5% BSA) y bloquee los ovarios en un balancín de plataforma nutating durante 1 h como mínimo.
      NOTA: Además de BSA, se puede agregar suero fetal bovino (FBS) o suero normal de cabra (NGS) a la solución de bloqueo. Alternativamente, los ovarios se pueden bloquear durante la noche en un balancín de plataforma nutating a 4 ° C.
   2. Retire la solución de bloqueo como en el paso 2.9 y agregue 300 μL de solución de anticuerpo primario que contenga anticuerpos primarios diluidos en sus concentraciones apropiadas (específicas para el anticuerpo utilizado) en la solución de bloqueo. Incubar durante la noche en un balancín de plataforma nutating a 4 °C. Al día siguiente, retire la solución primaria de anticuerpos y proceda a la inmunotinción secundaria de anticuerpos.
      NOTA: Algunos anticuerpos primarios se pueden guardar y reutilizar. En algunos casos, los anticuerpos primarios reutilizados pueden reducir la tinción de fondo, lo que resulta en mejores imágenes. Sin embargo, la reutilización debe probarse para cada anticuerpo para garantizar la eficiencia.
2. Inmunotinción secundaria de anticuerpos (día 2)
   1. Después de retirar la solución primaria de anticuerpos, realice dos lavados rápidos y cuatro lavados largos (10-15 min) como en el paso 2.10. Los lavados repetitivos cuidadosamente realizados con PBST fresco 1x disminuirán el fondo no específico y conducirán a imágenes óptimas.
   2. Retire el PBST como en el paso 2.9 y agregue 500 μL de solución de anticuerpos secundarios que contengan anticuerpos secundarios fluorescentes que detectarán los anticuerpos primarios utilizados. Proteja el tubo de la luz cubriéndolo con papel de aluminio a partir de este punto para una conservación óptima de la fluorescencia, que es fundamental para la adquisición y el análisis de imágenes.
      NOTA: La solución de anticuerpos secundarios debe contener anticuerpos secundarios conjugados con fluoróforos que no se superpongan con proteínas marcadas endógenamente. Por ejemplo, si se usan proteínas marcadas con GFP, se recomienda el uso de anticuerpos secundarios de Alexa Fluor en longitudes de onda rojas o rojas lejanas (por ejemplo, 546, 568 o 647 nm). Los colorantes fluorescentes, como Hoechst y Alexa Fluor 546 o 647 faloidina conjugada, se pueden agregar a la solución secundaria. Estas manchas podrían ser útiles para marcar la estructura celular general (es decir, núcleos y F-actina). Consulte el paso 3.1 para las concentraciones.
   3. Incubar los ovarios en la solución secundaria de anticuerpos en un balancín de plataforma nutating durante 2 h a temperatura ambiente. Realice dos lavados rápidos y cuatro lavados largos (10-15 min) en 1x PBST como en el paso 2.10. Proceda al montaje como en el paso 5.

5. Montaje de ovarios teñidos

NOTA: Este método funciona muy bien si los ovarios están bien desarrollados y abundantes. El montaje cuidadoso de los ovarios en la diapositiva es fundamental para una imagen óptima.

1. Después del último lavado, use una pipeta p1000 para pipetear suavemente los ovarios hacia arriba y hacia abajo en el tubo para separar las cámaras de huevos. Permita que las cámaras de huevos se hundan hasta el fondo manteniendo el tubo en posición vertical durante 5-10 minutos. La separación cuidadosa de las cámaras de huevos individuales es fundamental para lograr una adquisición óptima de la imagen.
2. Retire el PBST con una pipeta Pasteur, dejando ~50 μL. Retire la mayor cantidad posible del PBST restante con una pipeta p200. Agregue dos gotas de medio de montaje, suficientes para extenderse uniformemente en una funda de 22 mm x 22 mm. Los ovarios se pueden almacenar en medio de montaje en tubos de microcentrífuga a 4 °C durante un máximo de 1 mes antes del montaje.
   NOTA: Varios medios de montaje diferentes están disponibles comercialmente; se recomienda el uso de montadores de ajuste duro, como Aqua-Poly/Mount o ProLong Glass Antifade Mountant, para lograr condiciones óptimas de imagen. Se desaconseja el uso de glicerol como medio de montaje, ya que puede conducir a malas condiciones de imagen (por ejemplo, inestabilidad del fluoróforo). Para los medios de montaje que no polimerizan, selle el estuche con un sellador de labios / esmalte de uñas para asegurarlo en su lugar.
3. Etiquete un portaobjetos de vidrio y límpielo con papel suave y libre de polvo para eliminar el polvo y las huellas dactilares. Corte el extremo de la punta de una pipeta p200 para permitir una fácil transferencia del medio de montaje viscoso a la corredera desde el tubo de la microcentrífuga. A continuación, transfiera lentamente todas las cámaras de huevos en el medio de montaje al portaobjetos de vidrio, asegurándose de no crear burbujas.
4. Bajo un microscopio de disección, extienda suavemente el medio de montaje y separe las cámaras de huevos utilizando una nueva punta p200 o fórceps para cubrir un área aproximadamente del tamaño de la cubierta.
5. Usando fórceps, coloque cuidadosamente la funda (limpiada con papel sin polvo) en las cámaras de huevos en ángulo para evitar burbujas.
6. Guarde el portaobjetos a temperatura ambiente en una superficie plana en la oscuridad durante 2 días para polimerizar. Una vez que el medio de montaje se ha curado, la diapositiva se puede almacenar a 4 ° C en la oscuridad durante unas semanas para obtener imágenes.
   NOTA: Es importante que el medio de montaje de ajuste duro polimerice antes de obtener imágenes. Si el medio aún no se ha polimerizado, los ovarios flotarán bajo la cubierta, afectando la adquisición de imágenes. Además, el índice reflectante óptimo de los medios de montaje solo se logra después de que se haya establecido completamente (consulte la información del fabricante para obtener más detalles).
7. Método de montaje alternativo: Este método se recomienda para reducir la pérdida de tejido si los ovarios no son abundantes. En este método (descrito a continuación), separe los ovarioles y las cámaras de huevos en el portaobjetos mientras se montan, en lugar de separarlos en un tubo de microcentrífuga mediante pipeteo como se describe en el paso 5.1.
   1. Después del último lavado, retire todos menos ~ 100 μL de la solución de lavado. Usando una pipeta Pasteur o una pipeta p1000, transfiera los ovarios intactos en PBS a la diapositiva. Usando una pipeta p200, retire cuidadosamente la mayor cantidad posible de PBST de la diapositiva. Use un papel libre de polvo para limpiar el PBST, si es necesario. No toque los ovarios.
   2. Agregue dos gotas de medios de montaje. Separe cuidadosamente los ovarioles y las cámaras de huevos usando fórceps o agujas de disección. Retire y deseche el tejido extraño, y luego extienda las cámaras de huevos y los ovarioles en el medio de montaje. Continúe con los pasos 5.5-5.6.

6. Adquisición de imágenes confocales

NOTA: Esta sección proporciona parámetros clave para lograr una adquisición óptima de imágenes utilizando cualquier microscopio confocal (Figura 2).

1. Configure el microscopio y localice la muestra como se describe a continuación.
   1. Antes de obtener imágenes, es crucial localizar la región de interés (ROI) utilizando el ocular del microscopio de fluorescencia. Utilice un objetivo de aumento bajo (20x) o el objetivo que se utilizará para la adquisición de imágenes (es decir, 40x o 63x). Seleccione una cámara de huevos para obtener una imagen.
      NOTA: Para la adquisición de imágenes, se recomienda utilizar objetivos de gran aumento, como 40x o 63x (ver 6.2.1).
   2. Una vez seleccionado el ROI, proceda a la adquisición de imágenes; continúe con el paso 6.2 para imágenes confocales y el paso 7 para imágenes de superresolución.
2. Seleccione los parámetros clave para la adquisición óptima de imágenes como se describe a continuación (en la Tabla 1 se dan ejemplos de parámetros clave para las imágenes representativas).
   1. Selección de un objetivo: Para la adquisición de imágenes confocales del tráfico intracelular y la secreción de proteínas BM en la FE, utilice un objetivo 40x o 63x.
      NOTA: Para lograr la mejor resolución posible, se recomienda encarecidamente el uso de objetivos Plan-Apochromat, con alta apertura numérica (NA) que proporcionen la mayor corrección acromática.
   2. Selección de láseres para cada canal/pista: Para GFP, utilice láser de 488 nm; para DAPI u Hoechst, utilice láser de 405 nm; para Alexa Fluor 546 o 568, use láser de 561 nm; y para Alexa Fluor 647, use láser 640 nm.
      NOTA: Cada selección láser dará como resultado una formación de canal / pista diferente. Aquí, el término canal se refiere a la imagen formada por la distribución de intensidad registrada para fluoróforos excitados para el ROI seleccionado en la longitud de onda específica de cada canal.
   3. Ajuste estenopeico: Para reducir la luz desenfocada durante la adquisición de la imagen, ajuste el agujero de alfiler para cada canal en 1 UA.
   4. Intensidad del láser y ajustes de ganancia del detector: Para ajustar la sensibilidad de la imagen, utilice tanto la ganancia maestra del detector como la potencia del láser. Para establecer correctamente la sensibilidad de la imagen, se recomienda un indicador de rango. Configure tanto la ganancia maestra como la potencia del láser para que tengan una sensibilidad adecuada donde las estructuras de interés (por ejemplo, vesículas que contienen BM) sean claramente visibles, evitando al mismo tiempo la saturación del detector.
      NOTA: Para evitar el fotoblanqueo, utilice la potencia láser mínima necesaria. Se recomienda aumentar primero la ganancia del detector mientras se utiliza la potencia láser más baja posible. Si un aumento de la ganancia del detector no puede alcanzar la intensidad deseada, aumente la potencia del láser. Se recomienda una intensidad de potencia del láser entre 0.5% -1.2%.
   5. Tamaño de fotograma: se recomienda utilizar el tamaño de imagen óptimo determinado por el software de adquisición. Para la mayoría de las aplicaciones, utilice una resolución máxima de 1024 x 1024. Una mayor resolución aumentará significativamente el tiempo de adquisición.
   6. Velocidad de escaneo: Use una velocidad de escaneo entre 6-9, que es segura para la mayoría de las muestras. Si la muestra es ruidosa, utilice una velocidad de escaneo más lenta para mejorar las relaciones señal-ruido. Sin embargo, las bajas velocidades de escaneo aumentan el fotoblanqueo y el tiempo de adquisición.
   7. Promedio de intensidad media: Para mejorar la calidad de la imagen, utilice el promedio de intensidad media a través de escaneos sucesivos con configuraciones idénticas. Para la mayoría de los casos, use un promedio de dos para mejorar las relaciones señal-ruido sin fotoblanquear la muestra.
   8. Zoom: Ajuste el área de escaneo usando la función de zoom. Utilice un zoom entre 2x-4x con objetivos de 40x y 63x como el valor más efectivo para visualizar claramente las vesículas que contienen BM en el FE. Seleccione cuidadosamente el ROI mínimo para reducir el tiempo de adquisición.
3. Para adquirir una pila z con el software Zeiss Zen, utilice los siguientes parámetros de sección Z y configúrelos como se describe a continuación.
   NOTA: Las vesículas y otras estructuras intracelulares que contienen proteínas BM son estructuras tridimensionales (3D). La adquisición de una pila z a través del FE mejorará significativamente la calidad y la resolución de la imagen. Por lo general, un rango que abarca el grosor / profundidad del tejido es suficiente para visualizar eficientemente la localización intracelular. Para una reconstrucción 3D óptima, se recomienda utilizar el intervalo óptimo que determina el software. Para objetivos de 40x y 63x, evite intervalos superiores a 0,5 μm entre cada sección z para permitir una reconstrucción 3D óptima.
   1. Haga clic en la casilla de verificación z-Stack en el área principal debajo de la pestaña Adquisición . Seleccione el modo de escaneo Todas las pistas por segmento para la pila z. Esto dará como resultado un cambio en las pistas de canal para cada segmento de posición z.
   2. Seleccione el canal deseado para observar la muestra y haga clic en Live para iniciar un escaneo en vivo. Se recomienda el uso del canal necesario para detectar la proteína BM marcada con GFP.
   3. Establezca un rango para la pila z como se describe. Usando la perilla de ajuste fino en el microscopio, busque la ubicación z para un extremo de la muestra y haga clic en Establecer primero. Del mismo modo, busque la ubicación z para el otro extremo de la muestra y haga clic en Establecer último.
   4. Para cada ubicación en la pila z, haga clic en cada canal por separado con el indicador de rango seleccionado y ajuste la intensidad del láser y la ganancia maestra según sea necesario, como se describe en el paso 6.2.4.
   5. Establezca el intervalo para que la pila z asigne el tamaño del paso como se recomienda en la NOTA a continuación del paso 6.3. Haga clic en Iniciar experimento para comenzar la adquisición de z-stack.

7. Adquisición de imágenes de superresolución

1. Seleccione un objetivo compatible con Airyscan. Para visualizar la localización intracelular de la proteína BM, el uso de un objetivo de aceite 63x es óptimo (Figura 3). Ajuste el objetivo a 63x y coloque suavemente una gota de aceite de inmersión en su lente. Coloque la diapositiva en el objetivo con el deslizamiento hacia el objetivo para localizar la muestra.
2. Seleccione una configuración con los ajustes adecuados para que el fluoróforo se muestre como se describe a continuación.
   1. Haga clic en el botón Configuración inteligente en la pestaña Adquisición para configurar un nuevo experimento. Seleccione Airyscan (superresolución); cuando se selecciona, se requerirá una selección adicional entre Resolución (Airyscan SR), SNR/sensibilidad (Airyscan Confocal) y Velocidad (Multiplex SR-2Y). Para el tejido fijo, seleccione Resolución , ya que eso dará como resultado la mejor adquisición.
   2. Haga clic en + en el cuadro Configurar su experimento para agregar pistas / canales. Seleccione las pistas para tintes específicos de la base de datos de tintes. Para un experimento multicanal, agregue cada pista según sea necesario seleccionando los tintes apropiados.
   3. Después de agregar todas las pistas, seleccione una de las propuestas de experimento proporcionadas por el software. Para este experimento, use Best Signal, ya que aunque la velocidad será un poco más lenta en comparación con la propuesta Smartest (Line), creará la mejor configuración de hardware para cada tinte, lo que resultará en la máxima ganancia de señal y la diafonía de emisión mínima. Una vez que el experimento se haya configurado y cargado, aparecerá en la ventana Configuración de imágenes en la pestaña Adquisición.
   4. Una vez que se selecciona una configuración inteligente, se seleccionará automáticamente el rango de longitudes de onda para el detector GaAsP-PMT. Ajuste el rango moviendo la barra de desplazamiento en la parte inferior para aumentar o disminuir el rango o mover completamente el rango a otra región según sea necesario. Use esto para asegurarse de que los rangos de dos canales diferentes no se superpongan para evitar la diafonía. Guarde la configuración para reutilizarla en el futuro.
3. Una vez establecida la configuración, proceda a ajustar el zoom y el área de escaneo como en el paso 6.2.8. Optimice el área de escaneo para centrarse en la región de interés para reducir el tiempo de escaneo y el espacio de almacenamiento. Proceda a adquirir imágenes.
4. Para cada canal individual, seleccione una pista en Canal y haga clic en En vivo. Ajuste la ganancia maestra y la potencia del láser utilizando la herramienta indicadora de rango como se describe en el paso 6.2.4 y siga todas las pautas descritas para evitar píxeles saturados. Confirme que la vista del detector hexagonal está centrada y alineada haciendo clic en el botón Vista del detector Airyscan . En la mayoría de los casos, la vista del detector hexagonal se centra y alinea automáticamente. Repita para canales adicionales.
5. En la ventana de alternancia Modo de adquisición, en Tamaño de imagen, haga clic en SR (recuento de píxeles de súper resolución limitada) para maximizar las capacidades del detector. Esto ajustará el tamaño del marco automáticamente.
6. Mantenga el promedio a Ninguno , ya que generalmente no es necesario, y esto disminuirá el tiempo de escaneo. En algunos casos, un promedio de 2x puede mejorar la relación señal-ruido.
7. Recopile datos sin procesar con profundidades de datos de 8 bits. Haga clic en Ajustar para adquirir una imagen. Para adquirir una pila z, siga el paso 6.3.
8. Realice el procesamiento de imágenes como se describe a continuación. Esto producirá una imagen de 16 bits.
   1. Una vez obtenida la imagen o la pila z, haga clic en el Método de > de procesamiento y seleccione Procesamiento Airyscan.
   2. Realice el filtro automático para comenzar y realice un procesamiento manual adicional cambiando el valor SR para obtener los mejores resultados para la muestra. Una vez que se haya determinado el valor SR óptimo, haga clic en Aplicar para generar una imagen procesada. En el caso de las imágenes z-stack, procese como un z-slice (Imagen actual [2D]) o como toda la z-stack haciendo clic en el cuadro Procesamiento 3D .

8. Procesamiento de imágenes y análisis de datos (proyección ortogonal, reconstrucción 3D y perfil de intensidad)

NOTA: Para este método, los pasos utilizados para generar proyecciones ortogonales, reconstrucciones 3D y perfiles de intensidad se describen para el software Zen (consulte la Tabla de materiales). También se pueden realizar análisis de datos similares con el software ImageJ⁵⁶.

1. Realizar proyección ortogonal como se describe a continuación (Figura 4).
   1. Una vez que se ha obtenido una pila z utilizando microscopía confocal o de superresolución, genere una proyección ortogonal para ver las vesículas en el eje z de la célula en una vista 2D (en comparación con la reconstrucción 3D). Para hacer esto, haga clic en el Método de procesamiento > y seleccione Proyección ortogonal.
   2. En Parámetros, seleccione el plano de proyección requerido. Para una proyección del eje z (pila z), seleccione el plano Frontal (XY ). En Método, seleccione Máximo para obtener la proyección de la más alta calidad.
   3. A continuación, determine el grosor de la proyección seleccionando la posición inicial (corte z inicial) y determine el grosor (número total de cortes z) en la proyección. Es ideal seleccionar el grosor igual al de una celda en el eje z.
   4. Una vez establecidos los parámetros, haga clic en Aplicar para crear la proyección de la pila z de forma plana XY.
      NOTA: Al crear proyecciones ortogonales de múltiples pilas z para comparar la cantidad de un objeto particular de interés, es imperativo mantener el grosor de la proyección igual (o lo más cerca posible) para la precisión de los datos.
2. Realice la reconstrucción 3D como se describe a continuación (Figura 5).
   1. Cree reconstrucciones 3D de pilas z para observar la localización y la forma de las estructuras. Haga esto para las pilas z adquiridas utilizando enfoques confocales y de superresolución. Procese primero las pilas z de superresolución utilizando el procesamiento 3D como en el paso 7.8 para la reconstrucción 3D.
   2. Para generar una imagen 3D, haga clic en el icono 3D en la ventana de vista previa. Una vez hecho clic, aparecerá una pestaña 3D en la sección de control de pantalla en la mitad inferior de la pantalla. Las vistas 3D, como Transparencia, Volumen, Máximo, Superficie y Mixto, serán visibles. Utilice las vistas Superficie o Mixta al ver la estructura de las vesículas (preferible).
   3. Para obtener la imagen de la más alta calidad, seleccione la configuración Precisa , ya que la configuración más rápida será menos precisa y dará lugar a una representación 3D deficiente.
   4. Una vez generada la imagen, manipularla girando y haciendo zoom para enfocar en una ubicación preferida para ver los objetos de interés. Manipule la imagen 3D en la pestaña Apariencia .
   5. Una vez que se haya obtenido una vista satisfactoria, en la pestaña 3D, seleccione Resolución mostrada y luego haga clic en Crear imagen. Esto creará una instantánea de la imagen en la misma orientación en la que se vio y se puede guardar y exportar en varios formatos de archivo.
3. Genere un perfil de intensidad como se describe a continuación (Figura 7).
   NOTA: Los perfiles de distribución e intensidad de los píxeles asociados a las diferentes señales fluorescentes se pueden ver como una imagen superpuesta para determinar su colocalización.
   1. Una vez que se ha adquirido una imagen óptima a través de imágenes confocales o de superresolución, en el panel Ver de la ventana Vista previa , haga clic en Perfil. En la ventana de vista previa, aparecerá un histograma que muestra el perfil de intensidad en función de la distancia, así como una tabla que muestra las distancias y los valores de intensidad.
   2. En el área de controles de visualización en la parte inferior de la pantalla, haga clic en la herramienta de flecha en la pestaña Definición de perfil . Dibuje una flecha a lo largo de la longitud del objeto para la cual se debe evaluar el perfil de intensidad de los diferentes píxeles. Para dibujar la flecha, amplíe la imagen.
   3. El perfil de intensidad aparecerá a la izquierda de la vista previa de la imagen, donde se mostrará la distancia y los picos correspondientes a lo largo de la trayectoria de la flecha. Para eliminar el histograma que se muestra en la propia imagen, desactive la casilla Mostrar perfil en gráficos .
   4. En la ficha Dimensiones del área de control de visualización, anule la selección de los canales que no vayan a incluirse en el perfil de intensidad.
   5. En la pestaña Gráficos , haga doble clic en Perfil que se muestra debajo del cuadro Anotaciones/Medidas para abrir el cuadro emergente Formato de elementos gráficos . Utilice esta opción para cambiar el color de la flecha, así como su estilo y grosor de trazo. Cierre el cuadro después de seleccionar la configuración deseada.
   6. Haga clic en la pestaña Vista de perfil . En la sección nueva imagen, haga clic en Vista actual y luego en Guardar como para guardar el archivo. Se recomienda guardar el archivo como un archivo .tif para evitar la compresión y pérdida de datos.

Resultados

Los métodos descritos en este documento se pueden utilizar para obtener imágenes y caracterizar de manera eficiente y precisa el tráfico intracelular y la secreción de proteínas BM en células epiteliales polarizadas, como la FE del ovario de Drosophila . A continuación, proporcionamos resultados anticipados obtenidos utilizando los métodos descritos, así como consejos útiles y posibles dificultades. Para ello, se utiliza Vkg-GFP, un Vkg etiquetado endógenamente (Drosophila Col IV). Sin embarg...

Discusión

El BM es crítico para la morfogénesis embrionaria y de órganos, y las funciones fisiológicas adultas. Además, el BM actúa como plataforma de señalización para el establecimiento y mantenimiento de la polaridad epitelial y proporciona soporte a los tejidos². Sin embargo, los mecanismos que regulan la colocación adecuada de las proteínas BM son poco conocidos. Una mejor comprensión de las vías biológicas dedicadas al tráfico intracelular y la secreción polarizada de las proteínas BM ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 546 phalloidin	Invitrogen	A22283	F-Actin Stain (1/500 of 66µM)
Alexa Fluor 647 phalloidin	Invitrogen	A22287	F-Actin Stain (1/100 of 66µM))
Anti-GM130 Antibody	abcam	ab30637	For Golgi Stain (colocalization); use as concentration of 7µg/uL
Aqua-Polymount	Polysciences, Inc.	1860620	Mounting Medium
Bakers Yeast (Active Dry Yeast)	Genesee Scientific	62-103	To fatten the overies for dissection
Bovine Serum Albumin (30% solution)	Sigma-Aldrich	A7284	For blocking solution
Depression wells	Electron Microscopy Sciences	7156101	For dissection (glass concavity slide can be used instead)
Dissecting needle	Fisher scientifc	13-820-024
Drosophila Incubator	Genesee Scientific/Invictus
Fly Stock: Perlecan-GFP Drosophila line (ZCL1700)			Morin et al., 2001
Fly Stock: UAS-Crag RNAi line (TRIP line HMS00241)	Bloomington Drosophila Stock Center	33594	RNAi against Crag
Fly Stock: Viking-GFP Drosophila line (CC00791)			Buszczak et al., 2007
Fly Stock: Vkg-GFP, tj-Gal4			Devergne et al., 2017. Drive the expression of Crag RNAi in the FE
Forceps (Dumont 5)	Fine Science Tools	11251-30	For dissection
Glass Concavity Slide	Electron Microscopy Sciences	7187804	For dissection (depression wells can be used instead)
Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 568	Invitrogen	A11036	Secondary antibody (GM130 antibody) (5 µg/mL)
Hoechst (Hoechst 33342)	Invitrogen	H3570	DNA Stain (1 ug/mL)
Kimwipes	Kimtech	Fisher Scientific: 06-666	Delicate task wipers
Leica Fluorescent Stereo Microscope  M165 FC	Leica		For ovary imaging
Microscope Slides	Corning	294875X25	Microscope Slides
Nutating platform rocker	Corning Life Sciences	6720	For ovary fixation and staining
Nutri-Fly BF	Genesee Scientific	66-121	Fly Food
Paraformaldehyde 20% Solution	Electron Microscopy Sciences	Fisher Scientific: 15713	For PFA 4%
Phosphate Buffered Saline Tablets	Fisher scientific	BP2944100	For PBS solution
ProLong Glass Antifade Mountant	Invitrogen	P36980	Mounting Medium
Square Cover Glass	Corning	285022	Cover glass for microscope slides
Triton x-100	Sigma-Aldrich	9036-19-5	For PBST
Zeiss LSM 900 with Airyscan 2	Zeiss		Confocal and super-resolution Microscope
Zeiss Stemi 305 Stereo Microscope	Zeiss		Dissecting microscope
Zeiss Zen Software version 3.3 (Blue Edition)	Zeiss		Image acquisition and processing