Generación de esferoides de tejido a través de un dispositivo similar a un sello impreso en 3D

Resumen

El presente protocolo describe una técnica para producir esferoides tisulares a gran escala de forma rentable utilizando un dispositivo similar a un sello impreso en 3D.

Resumen

Los avances en el cultivo celular 3D han desarrollado modelos in vitro más relevantes fisiológicamente , como los esferoides de tejidos. Las células cultivadas como esferoides tienen respuestas biológicas más realistas que se asemejan al entorno in vivo . Debido a sus ventajas, los esferoides tisulares representan una tendencia emergente hacia modelos de estudio superiores, más fiables y más predictivos con una amplia gama de aplicabilidad biotecnológica. Sin embargo, las plataformas reproducibles que pueden lograr la producción a gran escala de esferoides tisulares se han convertido en una necesidad insatisfecha para explorar y aumentar completamente su potencial. En este trabajo, se informa de la producción a gran escala de esferoides tisulares homogéneos utilizando una metodología de bajo costo y eficaz en el tiempo. Se desarrolla un dispositivo similar a un sello impreso en 3D para generar hasta 4.716 esferoides por placa de 6 pocillos. El dispositivo se fabrica mediante el método de estereolitografía utilizando una resina fotocurable. El dispositivo final está compuesto por micropines cilíndricos, con una altura de 1,3 mm y un ancho de 650 μm. Este enfoque permite la generación rápida de esferoides homogéneos y esferoides cocultivados con forma y tamaño uniformes y una viabilidad celular del >95%. Además, el dispositivo similar a un sello es ajustable para diferentes tamaños de placas de pocillos y placas de Petri. Se esteriliza fácilmente y se puede reutilizar durante largos períodos. La producción eficiente a gran escala de esferoides de tejidos homogéneos es esencial para aprovechar su traducción en múltiples áreas de la industria, como la ingeniería de tejidos, el desarrollo de fármacos, el modelado de enfermedades y la medicina personalizada bajo demanda.

Introducción

Los esferoides tisulares son microtejidos 3D formados por suspensiones celulares que se autoensamblan sin fuerzas externas¹. Estos esferoides han sido ampliamente utilizados en protocolos de biofabricación debido a su semejanza con características clave del sistema fisiológico humano ^2,3. Los esferoides tisulares proporcionan un metabolismo, una dinámica del citoesqueleto, una viabilidad celular y una actividad metabólica y de secreción más similares que^{el cultivo celular} monocapa tradicional. Debido a su capacidad de fusión, también se pueden utilizar como bloques de construcción (por ejemplo, protocolos de bioimpresión) para formar construcciones complejas de ingeniería tisular con mayor relevancia biológica ^4,5.

Debido a su relevancia biológica, los esferoides de tejidos se han utilizado como herramienta biotecnológica para protocolos que abarcan la ingeniería de tejidos, el desarrollo de fármacos, el modelado de enfermedades y la evaluación nanotoxicológica, reduciendo el tiempo, los costos de espacio y las pruebas en animales 3,6,7,8. No obstante, para explorar y aprovechar plenamente el potencial de los esferoides tisulares, son muy necesarios métodos fiables y reproducibles destinados a su producción a gran escala, que siguen siendo un reto constante.

Varias metodologías producen esferoides, como la gota colgante, los pozos de fondo recubiertos en forma de U, la microfluídica y el uso de una matriz polimérica ^9,10. Aunque estas metodologías allanaron el camino dentro del mercado de producción de esferoides, siguen siendo complejas, lentas, laboriosas o costosas¹⁰.

El presente protocolo informa de la producción a gran escala de esferoides tisulares homogéneos utilizando una metodología de bajo costo y eficaz en el tiempo. Hemos desarrollado un dispositivo similar a un sello impreso en 3D para generar hasta 4.716 esferoides por placa de 6 pocillos. Además, el dispositivo similar a un sello se puede adaptar para producir más esferoides por pocillo, adecuado para diferentes placas de cultivo celular. Es fácilmente esterilizable y se puede reutilizar durante largos períodos. La producción eficiente a gran escala de esferoides tisulares homogéneos es esencial para trasladar su uso a las clínicas, contribuyendo a múltiples áreas de la industria, como la ingeniería de tejidos, el desarrollo de fármacos, el modelado de enfermedades y la medicina personalizada bajo demanda.

Protocolo

Para el presente estudio se utilizó la línea celular L929, fibroblastos de ratón. El biodispositivo impreso en 3D con forma de sello se obtuvo de una fuente comercial (consulte la tabla de materiales). Se siguieron las buenas prácticas de cultivo celular y las técnicas estériles durante todo el protocolo. El dispositivo fabricado se esterilizó limpiándolo con alcohol al 70% y exponiéndolo a la luz ultravioleta durante 15 minutos. Los medios y soluciones de cultivo celular se calentaron a 37 °C antes de entrar en contacto con las células o los esferoides tisulares. En la Figura 1 se muestra una representación esquemática del protocolo.

1. Preparación de moldes no adherentes a partir del dispositivo similar a un sello

1. Prepare el gel de agarosa al 2% (p/v) siguiendo los pasos que se indican a continuación.
   1. Diluir el polvo de agarosa en solución salina tamponada con fosfato (1x PBS) y homogeneizar la suspensión resultante con movimientos circulares.
      NOTA: Esta solución se puede colocar en una botella de vidrio. En este paso, la solución de agarosa no será translúcida.
   2. Coloque la botella de vidrio en el microondas y déjela reposar durante 30 s. Cada 5 s, detenga el microondas, retire la botella de vidrio y homogeneice manualmente la solución con movimientos circulares. El proceso de calentamiento debe realizarse hasta que la solución alcance un estado líquido-límpido.
      NOTA: Una placa calefactora también se puede utilizar como alternativa al microondas. Después del proceso de calentamiento, la solución debe ser translúcida/límpida.
   3. Agregue 1 mL de la solución de agarosa a cada pocillo de una placa de 6 pocillos planeada para el experimento.
   4. Espere ~ 15 minutos o hasta que la agarosa se solidifique.
      NOTA: Se puede utilizar una placa de enfriamiento para disminuir el tiempo de solidificación.
   5. Agregue 1-2 ml de la solución de agarosa e inserte suavemente el dispositivo sobre la agarosa líquida.
      NOTA: La colocación del dispositivo debe realizarse con cuidado para evitar burbujas de aire en la interfaz del dispositivo de agarosa.
   6. Espere ~ 30 minutos o hasta que la agarosa se solidifique.
      NOTA: Se puede utilizar una placa de enfriamiento para disminuir el tiempo de solidificación.
   7. Retire suavemente el dispositivo de la agarosa.
      NOTA: La eliminación es fundamental. Se debe retirar con cuidado para mantener intactas las características de la agarosa; de lo contrario, la agarosa puede interrumpirse.
   8. Agregue 2 ml de medio DMEM, espere 10 minutos, deseche el medio y reemplácelo con DMEM nuevo. Repita esto tres veces para lavar el pozo correctamente.
   9. Agregue 2 mL de DMEM y coloque la placa de 6 pocillos en una incubadora (a 37 °C con 5% de CO₂ y 80% de humedad) hasta la siembra de la celda (Figura 2A-F, Video Suplementario 1).

2. Generación de esferoides tisulares

NOTA: Los diferentes linajes celulares tienen diferentes propiedades de adhesión. Por lo tanto, con esta metodología, es posible que algunos tipos de células no formen correctamente los esferoides tisulares.

1. Cultivar las células siguiendo el cultivo tradicional de monocapa (es decir, cultivar las células en matraces de cultivo celular utilizando DMEM con glucosa baja suplementada con suero fetal bovino (FBS) al 10%, 100 μg/mL de penicilina y 100 μg/mL de estreptomicina) (ver Tabla de Materiales). Mantenga las células a 37 °C en una incubadora de CO₂ al 5% y controle hasta que alcancen el 80% de confluencia.
2. Después de alcanzar la confluencia deseable, lave las células con 1x PBS.
   NOTA: Se recomienda utilizar 5 mL para matraces de²⁵ cm2, 10 mL^{para matraces} de 75 cm2 y 15 mL para matraces^{de 150 cm2} .
3. Añadir la enzima de disociación e incubar las células durante 2-5 min a 37 °C con 5% de CO₂ y 80% de humedad.
   NOTA: En el presente estudio se utilizó tripsina al 0,125% con 0,78 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) como enzima de disociación (ver Tabla de Materiales).
4. Observe el desprendimiento de las células de los matraces de cultivo celular y agregue un medio de crecimiento suplementado con FBS para neutralizar la enzima de disociación celular.
   NOTA: Para el presente estudio se utilizó DMEM con glucosa baja (ver Tabla de Materiales) suplementado con FBS al 10%.
5. Centrifugar la suspensión de la célula a 400 x g durante 5 min a temperatura ambiente. A continuación, cuente las celdas manualmente.
6. Tome 50 x 10⁵ celdas por tubo y agregue 5 mL de 1x PBS.
   NOTA: El número de células sembradas influye en el diámetro final del esferoide tisular. Por lo tanto, se puede aumentar el número de células para generar esferoides de tejido con diámetros más grandes.
7. Centrifugar la suspensión de la célula a 400 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
8. Retirar el sobrenadante con una pipeta, añadir 1 mL del medio de cultivo celular y homogeneizar la solución.
   NOTA: En el presente estudio, se utilizó un medio de cultivo completo de DMEM con glucosa baja, suplementado con FBS al 10%, 100 μg/mL de penicilina y 100 μg/mL de estreptomicina.
9. Retire 2 mL de medio de la placa de 6 pocillos (paso 1.1.9) y agregue 1 mL de la suspensión celular al centro del molde de agarosa formado por el biodispositivo impreso en 3D (paso 1.1.7). Espere hasta que las células se sedimenten en las micro resecciones (~ 20-30 min) y agregue con cuidado 1 mL de medio de cultivo celular en el pocillo.
   NOTA: Hay que tener mucho cuidado en este paso. Se recomienda añadir suavemente el medio, colocar la punta de la pipeta cerca de la pared del pocillo y dispensar en pequeñas cantidades.
10. Coloque la placa de 6 pocillos en la incubadora (a 37 °C con 5% de CO₂ y 80% de humedad) para que se formen los esferoides de tejido (aproximadamente 24-48 h, dependiendo del tipo de célula) (Figura 3).
    NOTA: Los diferentes tipos de células (por ejemplo, células cancerosas, células primarias) tienen diferentes cinéticas de autoensamblaje¹¹.

Resultados

Generación de micro resecciones homogéneas utilizando el dispositivo tipo sello impreso en 3D
El dispositivo similar a un sello impreso en 3D se fabricó con éxito mediante el método de estereolitografía¹² utilizando una resina fotocurable (Figura 2A). El dispositivo final estaba compuesto por micropines cilíndricos con una altura de 1,3 mm y una anchura de 650 μm (Figura 2A). S...

Discusión

El presente protocolo describe un método sencillo, rápido y barato para la producción a gran escala de esferoides tisulares. Se utilizó un dispositivo impreso en 3D similar a un sello como molde maestro, que generó hasta 4.716 esferoides por placa de 6 pocillos. Se ha demostrado que las células cultivadas como esferoides tienen respuestas biológicas más realistas que se asemejan mucho al entorno in vivo ¹. Debido a sus ventajas, los esferoides tis...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 well plate	Merck	CLS3516
Agarose	Promega	V3121
Biodevice	Bioedtech
Biological Safety Cabinet	ThermoFisher	51029701
Centrifugue	ThermoFisher	75004031
Corning 50 mL centrifuge tubes	Merck	CLS430829-500EA
Corning cell culture flasks surface area 75 cm2	Merck	CLS430641
Draft Resin	FormLabs	FLDRBL01
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium - low glucose	Merck	D6046
Fetal Bovine Serum (FBS)	ThermoFisher	16000044
Form 2	FormLabs
Incubator	ThermoFisher	51033782
L929 cell lines	Stablished in the lab
Penicillin and Streptomycin (PS)	ThermoFisher	15140122
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Merck	806552
Trypsin with EDTA	Merck	T3924