Medición directa de las fuerzas dentro de haces de microtúbulos activos reconstituidos

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para reconstituir haces de microtúbulos in vitro y cuantificar directamente las fuerzas ejercidas dentro de ellos utilizando trampeo óptico simultáneo y microscopía de fluorescencia de reflexión interna total. Este ensayo permite la medición a nivel nanométrico de las fuerzas y desplazamientos generados por los conjuntos de proteínas dentro de las redes de microtúbulos activos.

Resumen

Las redes de microtúbulos se emplean en las células para realizar una amplia gama de tareas, que van desde actuar como pistas para el transporte de vesículas hasta trabajar como matrices especializadas durante la mitosis para regular la segregación cromosómica. Las proteínas que interactúan con los microtúbulos incluyen motores como las quinesinas y la dineína, que pueden generar fuerzas activas y movimiento direccional, así como proteínas no motoras que entrecruzan filamentos en redes de orden superior o regulan la dinámica del filamento. Hasta la fecha, los estudios biofísicos de las proteínas asociadas a microtúbulos se han centrado abrumadoramente en el papel de las proteínas motoras individuales necesarias para el transporte de vesículas, y se ha logrado un progreso significativo en la elucidación de las propiedades generadoras de fuerza y la regulación mecanoquímica de las quinesinas y las dineínas. Sin embargo, para los procesos en los que los microtúbulos actúan como carga y pista, como durante el deslizamiento del filamento dentro del huso mitótico, se entiende mucho menos sobre la regulación biofísica de los conjuntos de las proteínas de reticulación involucradas. Aquí, detallamos nuestra metodología para sondear directamente la generación de fuerza y la respuesta dentro de redes mínimas de microtúbulos reticulados reconstituidas a partir de microtúbulos purificados y proteínas mitóticas. Los pares de microtúbulos están entrecruzados por proteínas de interés, un microtúbulo se inmoviliza a un cubreobjetos de microscopio y el segundo microtúbulo es manipulado por una trampa óptica. La microscopía de fluorescencia de reflexión interna total simultánea permite la visualización multicanal de todos los componentes de esta red de microtúbulos a medida que los filamentos se separan para generar fuerza. También demostramos cómo estas técnicas se pueden utilizar para sondear las fuerzas de empuje ejercidas por los conjuntos de quinesina-5 y cómo surgen fuerzas de frenado viscosas entre pares de microtúbulos deslizantes reticulados por el MAP mitótico PRC1. Estos ensayos proporcionan información sobre los mecanismos de ensamblaje y función del huso y pueden adaptarse más ampliamente para estudiar la mecánica de la red de microtúbulos densos en diversos contextos, como el axón y las dendritas de las neuronas y las células epiteliales polares.

Introducción

Las células emplean redes de microtúbulos para realizar una amplia variedad de tareas mecánicas, que van desde el transporte de vesículas ^1,2,3 hasta la segregación cromosómica durante la mitosis 4,5,6. Muchas de las proteínas que interactúan con los microtúbulos, como las proteínas motoras moleculares quinesina y dineína, generan fuerzas y están reguladas por cargas mecánicas. Para comprender mejor cómo funcionan estas moléculas críticas, los investigadores han empleado métodos bio....

Protocolo

1. Preparación de microtúbulos

NOTA: Cuando se emplean proteínas de reticulación marcadas con GFP, rojas (por ejemplo, rodamina) y rojas lejanas (por ejemplo, HiLyte647 biotiniladas, denominadas rojo lejano biotinilado en el resto del texto) el etiquetado de fluoróforos orgánicos de los microtúbulos funciona bien. Se puede lograr una diafonía mínima entre los tres canales durante la obtención de imágenes mediante el uso de un filtro de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF) de banda cuádruple de alta calidad.

1. Preparar las existencias de semillas de microtúbulos GMPCPP
   1. Suspender 1 mg de tubulina lio....

Resultados

La preparación de haces de microtúbulos adecuados para el análisis biofísico se considera exitosa si se cumplen varios de los criterios clave. Primero, las imágenes en tres colores deben revelar dos microtúbulos alineados con una concentración de proteína de reticulación que decora preferentemente la región de superposición (Figura 5B, C y Figura 6B). Idealmente, la distancia entre el borde de superposición y el extr.......

Discusión

Las redes de microtúbulos son empleadas por innumerables tipos de células para realizar una amplia gama de tareas que son fundamentalmente de naturaleza mecánica. Para describir cómo funcionan las células tanto en estados sanos como en estados de enfermedad, es fundamental comprender cómo estas redes a escala micrométrica están organizadas y reguladas por las proteínas de tamaño nanométrico que las construyen colectivamente. Las herramientas biofísicas, como las pinzas ópticas, son muy adecuadas para sondear.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
10W Ytterbium Fiber Laser, 1064nm	IPG Photonics	YLR-10-1064-LP
405/488/561/640nm Laser Quad Band Set for TIRF applications	Chroma	TRF89901v2
6x His Tag Antibody, Biotin Conjugate	Invitrogen	#MA1-21315-BTIN
Acetone, HPLC grade	Fisher Scientific	18-608-395
Alpha casein from bovine milk	Sigma	1002484390
ATP	Fisher Scientific	BP413-25
Benzonase	Novagen	70746-3
Biotin-PEG-SVA-5000	Laysan Bio, Inc.	NC0479433
BL21 (DE3) Rosetta Cells	Millipore Sigma	71-400-3
Catalase	MP Biomedicals LLC	190311
CFI Apo 100X/1.49NA oil immersion TIRF objective	Nikon	N/A
Chloramphenicol	ACROS Organics	227920250
Coverslip Mini-Rack, for 8 coverslips	Fisher Scientific	C14784
Delicate Task Wipers	Kimberly-Clark	34120
Dextrose Anhydrous	Fisher Scientific	BP3501
D-Sucrose	Fisher Scientific	BP220-1
DTT	Fisher Scientific	BP172-25
Ecoline Immersion Thermostat E100 with 003 Bath	LAUDA-Brinkmann	27709
EDTA	Fisher Scientific	BP118-500
EGTA	Millipore Corporation	32462-25GM
FIJI / Image J	https://fiji.sc/	N/A
Frosted Microscope Slides	Corning	12-553-10	75mmx25mm, with thickness of 0.9-1.1mm
Glucose Oxidase	MP Biomedicals LLC	195196	Type VII, without added oxygen
GMPCPP	Jena Biosciences	JBS-NU-405S	Can be stored for several months at -20 °C and up to a year at -80 °C
Gold Seal-Cover Glass	Thermo Scientific	3405
HEPES	Fisher Scientific	BP310-500
Imidazole	Fisher Scientific	03196-500
IPTG	Fisher Scientific	BP1755-10
Laboratory dessicator	Bel-Art	999320237	190mm plate size
Kanamycin Sulfate	Fischer Scientific	BP906-5
KIF5A K439 (aa:1-439)-6His	Gilbert Lab, RPI	N/A	doi.org/10.1074/jbc.RA118.002182
Kimwipe	Kimberley Clark	Z188956	lint-free tissue
Immersion Oil, Type B	Cargille	16484
Lens Tissue	ThorLabs	MC-5
LuNA Laser launch (4 channel: 405, 488, 561, 640nm)	Nikon	N/A
Lysozyme	MP Biomedicals LLC	100834
Magnesium Acetate Tetrahydrate	Fisher Scientific	BP215-500
Microfuge 18	Beckman Coulter	367160
MPEG-SVA MW-5000	Laysan Bio, Inc.	NC0107576
Neutravadin	Invitrogen	PI31000
Nikon Ti-E inverted microscope	Nikon	N/A	Nikon LuN4 Laser
Ni-NTA Resin	Thermo Scientific	88221
Oligonucleotide - CACCTATTCTGAGTTTGCGCGA GAACTTTCAAAGGC	IDT	N/A
Oligonucleotide - GCCTTTGAAAGTTCTCGCGCAA ACTCAGAATAGGTG	IDT	N/A
Open-top thickwall polycarbonate tube, 0.2 mL, 7 mm x 22 mm	Beckman Coulter	343755
Optima-TLX Ultracentrifuge	Beckman Coulter	361544
Paclitaxel (Taxol equivalent)	Thermo Fisher Scientific	P3456
PIPES	ACROS Organics	172615000
PMSF	Millipore	7110-5GM
Porcine Tubulin, biotin label	Cytoskeleton, Inc.	T333P
Porcine Tubulin, HiLyte 647 Fluor	Cytoskeleton, Inc.	TL670M	far red labelled
Porcine Tubulin, Rhodamine	Cytoskeleton, Inc.	TL590M
Porcine Tubulin, Tubulin Protein	Cytoskeleton, Inc.	T240
Potassium Acetate	Fisher Scientific	BP364-500
Prime 95B sCMOS camera	Photometric	N/A
Quadrant Detector Sensor Head	ThorLabs	PDQ80A
Quikchange Lightning Kit	Agilent Technologies	210518
Sodium Bicarbonate	Fisher Scientific	S233-500
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous	Fisher Scientific	BP332-500
Square Cover Glasses	Corning	12-553-450	18 mm x 18 mm, with thickness of 0.13-0.17 mm
Streptavidin Microspheres	Polysciences Inc.	24162-1
Superose-6 Column	GE Healthcare	29-0915--96
TCEP	Thermo Scientific	77720
TLA-100 Fixed-Angle Rotor	Beckman Coulter	343840
Ultrasonic Cleaner (Sonicator)	Vevor	JPS-08A(DD)	304 stainless steel, 40 kHz frequency, 60 W power
Vectabond APTES solution	Vector Laboratories	SP-1800-7
Windex Powerized Glass Cleaner with Ammonia-D	S.C. Johnson	SJN695237