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Summary

Aquí, presentamos un protocolo para reconstituir haces de microtúbulos in vitro y cuantificar directamente las fuerzas ejercidas dentro de ellos utilizando trampeo óptico simultáneo y microscopía de fluorescencia de reflexión interna total. Este ensayo permite la medición a nivel nanométrico de las fuerzas y desplazamientos generados por los conjuntos de proteínas dentro de las redes de microtúbulos activos.

Abstract

Las redes de microtúbulos se emplean en las células para realizar una amplia gama de tareas, que van desde actuar como pistas para el transporte de vesículas hasta trabajar como matrices especializadas durante la mitosis para regular la segregación cromosómica. Las proteínas que interactúan con los microtúbulos incluyen motores como las quinesinas y la dineína, que pueden generar fuerzas activas y movimiento direccional, así como proteínas no motoras que entrecruzan filamentos en redes de orden superior o regulan la dinámica del filamento. Hasta la fecha, los estudios biofísicos de las proteínas asociadas a microtúbulos se han centrado abrumadoramente en el papel de las proteínas motoras individuales necesarias para el transporte de vesículas, y se ha logrado un progreso significativo en la elucidación de las propiedades generadoras de fuerza y la regulación mecanoquímica de las quinesinas y las dineínas. Sin embargo, para los procesos en los que los microtúbulos actúan como carga y pista, como durante el deslizamiento del filamento dentro del huso mitótico, se entiende mucho menos sobre la regulación biofísica de los conjuntos de las proteínas de reticulación involucradas. Aquí, detallamos nuestra metodología para sondear directamente la generación de fuerza y la respuesta dentro de redes mínimas de microtúbulos reticulados reconstituidas a partir de microtúbulos purificados y proteínas mitóticas. Los pares de microtúbulos están entrecruzados por proteínas de interés, un microtúbulo se inmoviliza a un cubreobjetos de microscopio y el segundo microtúbulo es manipulado por una trampa óptica. La microscopía de fluorescencia de reflexión interna total simultánea permite la visualización multicanal de todos los componentes de esta red de microtúbulos a medida que los filamentos se separan para generar fuerza. También demostramos cómo estas técnicas se pueden utilizar para sondear las fuerzas de empuje ejercidas por los conjuntos de quinesina-5 y cómo surgen fuerzas de frenado viscosas entre pares de microtúbulos deslizantes reticulados por el MAP mitótico PRC1. Estos ensayos proporcionan información sobre los mecanismos de ensamblaje y función del huso y pueden adaptarse más ampliamente para estudiar la mecánica de la red de microtúbulos densos en diversos contextos, como el axón y las dendritas de las neuronas y las células epiteliales polares.

Introduction

Las células emplean redes de microtúbulos para realizar una amplia variedad de tareas mecánicas, que van desde el transporte de vesículas 1,2,3 hasta la segregación cromosómica durante la mitosis 4,5,6. Muchas de las proteínas que interactúan con los microtúbulos, como las proteínas motoras moleculares quinesina y dineína, generan fuerzas y están reguladas por cargas mecánicas. Para comprender mejor cómo funcionan estas moléculas críticas, los investigadores han empleado métodos biofísicos de una sola molécula, como la captura óptica y la microscopía TIRF, para monitorear directamente parámetros críticos como las tasas de paso descargadas, la procesividad y las relaciones fuerza-velocidad para proteínas individuales. La geometría experimental más utilizada ha sido unir proteínas motoras directamente a las perlas de captura cuya geometría esférica y tamaño imitan vesículas sometidas a transporte motorizado. Numerosas quinesinas, incluyendo kinesina-1 7,8,9, kinesina-2 10,11,12, kinesina-3 13,14,15,16 kinesina-517,18, kinesina-8 19,20, así como complejos de dineína y dineína21,22, 23,24,25, han sido estudiados con estos métodos.

En muchos procesos celulares, sin embargo, las proteínas motoras y no motoras utilizan microtúbulos como pista y carga26,27. Además, en estos escenarios donde los filamentos de microtúbulos están entrecruzados en haces de orden superior, estas proteínas funcionan como conjuntos en lugar de unidades individuales. Por ejemplo, dentro de las células somáticas en división, las redes de filamentos densos se autoorganizan para construir el aparato del huso mitótico28,29,30. La red de microtúbulos del huso interpolar es altamente dinámica y está dispuesta en gran medida con extremos negativos apuntando hacia los polos del huso y extremos más que se superponen cerca del ecuador del huso. Los filamentos dentro del huso están reticulados por proteínas motoras como kinesina-5 31,32,33, quinesina-12 34,35,36 y kinesina-1437,38,39, o por proteínas no motoras como PRC1 40,41,42,43 o NuMA 44,45, 46. Con frecuencia se mueven o experimentan estrés mecánico durante procesos como el flujo hacia los polos o al coordinar el centrado cromosómico durante la metafase o la segregación cromosómica durante la anafase 47,48,49,50,51,52. La integridad del aparato del huso a escala micrométrica a través de la mitosis, por lo tanto, se basa en un equilibrio cuidadosamente regulado de las fuerzas de empuje y tracción generadas y sostenidas por esta red de filamentos que interactúan. Sin embargo, las herramientas necesarias para investigar esta regulación mecánica y explicar cómo los conjuntos de proteínas funcionan en concierto para coordinar los movimientos de los microtúbulos y producir las fuerzas necesarias para ensamblar adecuadamente el huso se han desarrollado recientemente, y apenas estamos empezando a comprender las reglas biofísicas que definen las redes dinámicas de microtúbulos.

El objetivo de este manuscrito es demostrar los pasos necesarios para reconstituir pares de microtúbulos reticulados in vitro, inmovilizar estos haces en una cámara de microscopía que permita la visualización simultánea de fluorescencia tanto de los microtúbulos como de las proteínas de reticulación y la medición de la fuerza a nanoescala, y procesar estos datos de manera robusta. Detallamos los pasos necesarios para polimerizar de manera estable los microtúbulos marcados con fluorescencia, preparar cubreobjetos de microscopio para su fijación, preparar perlas de poliestireno para experimentos de captura óptica y ensamblar redes de filamentos reticulados que preservan su funcionalidad in vivo al tiempo que permiten la manipulación biofísica directa.

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Protocol

1. Preparación de microtúbulos

NOTA: Cuando se emplean proteínas de reticulación marcadas con GFP, rojas (por ejemplo, rodamina) y rojas lejanas (por ejemplo, HiLyte647 biotiniladas, denominadas rojo lejano biotinilado en el resto del texto) el etiquetado de fluoróforos orgánicos de los microtúbulos funciona bien. Se puede lograr una diafonía mínima entre los tres canales durante la obtención de imágenes mediante el uso de un filtro de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF) de banda cuádruple de alta calidad.

  1. Preparar las existencias de semillas de microtúbulos GMPCPP
    1. Suspender 1 mg de tubulina liofilizada no marcada en 84 μL de 1x BRB80 helado (80 mM PIPES, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA; pH 6.8), con TDT añadido a una concentración final de 1 mM justo antes de su uso. Suspender 60 μg de tubulina liofilizada marcada con fluoróforos en 6 μL de BRB80 en frío 1x BRB80 con 1 mM de TDT. Suspender 60 μg de tubulina liofilizada marcada con biotina en 6 μL de BRB80 frío 1x con 1 mM de TDT.
    2. Para preparar semillas de tubulina marcadas con rodamina no biotiniladas con una relación de etiquetado de 1:10, agregue 84 μL de tubulina no marcada, 6 μL de tubulina marcada con fluoróforos y 10 μL de solución madre GMPCPP de 10 mM a un tubo de 0,5 ml. Mezclar bien pipeteando suavemente y mantener en hielo.
      NOTA: Se prefiere la polimerización GMPCPP para estos ensayos ya que los microtúbulos son más estables y susceptibles de manipulación directa con la trampa óptica que si se polimerizan con GTP o si se omite el taxol.
    3. Para preparar semillas de tubulina biotiniladas marcadas en rojo lejano con una proporción de marcado fluorescente de 1:10, agregue 80 μL de tubulina no marcada, 6 μL de tubulina marcada con fluoróforos, 4 μL de tubulina marcada con biotina y 10 μL de solución madre GMPCPP de 10 mM en un tubo de 0,5 ml. Mezclar bien pipeteando suavemente y mantener en hielo. Incubar el stock de semillas en hielo durante 5 min.
    4. Transfiera la solución de tubulina a un tubo de policarbonato apropiado para la centrifugación a alta velocidad. Centrifugar el stock de semillas a ~350.000 x g durante 5 min a 2 °C para evitar la polimerización de microtúbulos y recuperar el sobrenadante para alícuota. La concentración final estimada de tubulina en esta etapa es ~50 μM.
    5. Utilizando tubos de PCR de 0,2 ml, preparar 2 μL de alícuotas del stock de semillas y congelar rápidamente con nitrógeno líquido. Las alícuotas pueden almacenarse a -80 °C durante un máximo de 6 meses.
  2. Polimerización de microtúbulos
    1. Preparar 500 μL de 1x BRB80 y colocar en hielo. Coloque una de las alícuotas de semillas de rodamina de color rojo lejano y no biotiniladas biotiniladas en hielo para descongelar.
    2. Incubar las existencias de semillas en hielo durante 5 min. Al final del período de incubación, agregue inmediatamente 26 μL de 1x BRB80 a cada tubo. Si se desean microtúbulos más largos, aumente el volumen de BRB80 en 5-10 μL, mientras que, para microtúbulos más cortos, reduzca el volumen para la polimerización en 5 μL.
    3. Incubar las existencias de semillas de microtúbulos durante 1 h a 37 °C en un baño maría. Combine 298,5 μL de temperatura ambiente 1x BRB80 y 1,5 μL de solución madre de taxol de 4 mM para producir una solución de taxol de 20 μM. Prepare 300 μL de 1x BRB80 y mantenga ambos tubos a temperatura ambiente.
    4. Calentar un rotor apropiado de alta velocidad a 30 °C. Esto se puede hacer en una ultracentrífuga de mesa a 30 °C. Retire los microtúbulos del baño de agua y manténgalos a temperatura ambiente en un banco durante 10-15 min.
  3. Clarificación de microtúbulos
    1. Agregue 100 μL de temperatura ambiente 1x BRB80 a la solución de crecimiento de microtúbulos y mezcle moviendo el tubo ~ 10 veces o pipeteando suavemente. Transfiera la solución de crecimiento de microtúbulos a un tubo centrífugo de policarbonato.
    2. Marque un lado del tubo de policarbonato, que mirará hacia afuera en relación con la rotación de la centrífuga. Esto ayudará a localizar el pellet de microtúbulos, que será apenas visible debido al pequeño volumen de material.
    3. Centrifugar la solución de microtúbulos a ~350.000 x g durante 10 min a 30 °C. Después de la centrifugación, inspeccione el tubo que contiene los microtúbulos en busca de un pellet si es posible. Retire todos los microlitros, excepto los últimos microlitros, del líquido con cuidado, sin alterar el pellet. Si el pellet no es claramente visible, use la marca hecha como guía para evitar perturbar el área donde se encuentra el pellet.
    4. Añadir inmediatamente 100 μL de 1x BRB80 + 20 μM taxol al tubo de microtúbulos. Esto se puede agregar directamente sobre el pellet; La interrupción del pellet en esta etapa no afecta significativamente el proceso de clarificación.
    5. Centrifugar los microtúbulos de nuevo a ~350.000 x g durante 10 min, teniendo cuidado de asegurarse de que la sección marcada del tubo esté nuevamente orientada hacia afuera en relación con la rotación de la centrífuga.
    6. Retire todos los microlitros de solución excepto unos pocos como antes, nuevamente teniendo cuidado de evitar interrumpir el pellet de microtúbulos. Repita los pasos 1.3.4.-1.3.5. y luego resuspender el pellet de microtúbulos en 20-50 μL de 1x BRB80 + 20 μM taxol.
    7. Resuspender pipeteando la mayor parte del volumen de resuspensión y expulsándolo suavemente directamente sobre el pellet, repitiendo 20-30x o hasta que el pellet esté completamente resuspendido. Esto debe hacerse con cuidado para no cortar los microtúbulos con un pipeteo demasiado vigoroso. Cortar la punta de la pipeta para aumentar el tamaño de la abertura también puede ser útil para reducir el cizallamiento de microtúbulos.
    8. Guarde los microtúbulos a temperatura ambiente envolviendo el tubo en papel de aluminio para proteger los fluoróforos de la luz y manteniéndolos en la mesa de trabajo. Los microtúbulos son generalmente utilizables durante 2-3 días después de la aclaración.
  4. Evaluación de microtúbulos mediante microscopía
    1. Preparar una dilución 1:10 de la solución de microtúbulos clarificada mezclando 1 μL de microtúbulos y 9 μL de temperatura ambiente 1x BRB80. Inmediatamente obtenga una imagen de esta solución pipeteando 10 μL en un portaobjetos de microscopio y luego colocando un cubreobjetos sobre la gota para formar una calabaza.
    2. Asegúrese de que los microtúbulos que varían en longitudes de 8 a 25 μm a una alta densidad (varios cientos por campo de visión completo en capas en una malla densa) sean visibles cuando se visualicen utilizando microscopía de fluorescencia y un objetivo 100x enfocado en la superficie del cubreobjetos en contacto con la dilución de microtúbulos.

2. Preparación de cubreobjetos pasivados

  1. Cubreobjetos de lavado
    1. Coloque cubreobjetos de 18 mm x 18 mm en bastidores de plástico no reactivos, luego coloque cada bastidor en un vaso de precipitados de 100 ml. Coloque un cubreobjetos por ranura en los bastidores, ya que es necesario limpiar ambos lados de los cubreobjetos.
    2. Sonicate usando un sonicador de baño durante 5 min, usando 50 mL de las siguientes soluciones en el orden dado para cada ciclo de sonicación: (1) agua desionizada (con resistividad de 18.3 MΩ-cm), (2) solución Micro-90 al 2%, (3) agua desionizada, (4) KOH recién preparada 0.1 M, (5) agua desionizada (Figura 1A). Asegúrese de que los cubreobjetos estén completamente cubiertos de líquido. Entre ciclos de sonicación, enjuague cada rejilla de cubreobjetos en agua desionizada usando pinzas para sumergir la rejilla hacia arriba y hacia abajo 10-20x en agua desionizada, reemplace el agua y repita el proceso de enjuague 2x.
    3. Enjuague los cubreobjetos 3 veces en agua, luego vuelva a llenar los vasos de precipitados con etanol al 100% y devuelva los bastidores a los vasos de precipitados. Mueva los vasos de precipitados a una campana extractora de humos y coloque suficientes toallitas de pañuelos para dejar espacio para todos los bastidores de cubreobjetos. Luego, retire las rejillas con pinzas y colóquelas en las toallitas de pañuelos de papel.
    4. Usando una corriente seca de gas nitrógeno, sople el etanol de los cubreobjetos y sus bastidores hasta que se seque. Deseche el etanol restante de los vasos de precipitados y séquelos de manera similar utilizando la corriente de gas nitrógeno seco (Figura 1A).
  2. Funcionalización superficial de aminosilano en cubreobjetos
    1. Prepare la solución de reactivo (3-aminopropil)tietoxisilano (APTES) agregando 40 ml de acetona y 400 μL de reactivo APTES a un tubo cónico de 50 ml, tapando herméticamente y mezclando invirtiendo 10x.
    2. Mueva un estante de cubreobjetos a su vaso de precipitados seco correspondiente y luego sumérjase completamente en la solución APTES. Incubar durante 5 min (Figura 1A). Mueva la rejilla tratada con APTES a un nuevo vaso de precipitados secos y mueva una nueva rejilla al APTES para incubar durante 5 m.
    3. Enjuague la rejilla tratada con agua desionizada sumergiendo la rejilla 10-20x como se describe en el Paso 2.1.2., reemplazando el agua 5x. Repita hasta que todos los cubreobjetos hayan sido tratados y lavados.
  3. PEGilación de superficie aminosilano
    1. Preparar dos soluciones de PEG, una de ~100 μL con 25% p/v PEG y otra de ~10 μL con 10% p/v de biotina-PEG, ambas suspendidas en NaHCO3 0,1 M recién preparado, suficiente para recubrir 24 cubreobjetos. Centrifugar la solución de PEG al 25% a 3.000 x g durante 20 s una vez que se añade NaHCO3 0,1 M para disolver completamente el PEG; La solución puede permanecer turbia. Mezclar la biotina-PEG pipeteando suavemente (Figura 1B).
    2. Prepare una mezcla de las soluciones de PEG y biotina-PEG, con 33,3 veces el volumen de PEG a 1 volumen de biotina-PEG (p. ej., 100 μL de solución de PEG y 3 μL de solución de biotina-PEG).
    3. En una campana extractora, coloque varias toallitas estériles y sin pelusa. Mueva las rejillas de cobertura sobre las toallitas y séquelas con una corriente de gas nitrógeno seco como antes. En varias toallitas nuevas y secas, coloque los cubreobjetos ahora completamente secos dispuestos en pares y etiquete cada uno en la esquina inferior derecha con un símbolo asimétrico como "b". Esta marca estará opuesta a la superficie de la muestra del cubreobjetos y no interferirá con el experimento (Figura 1B).
    4. Voltee un cubreobjetos en cada par con pinzas. En cada cubreobjetos volteados, coloque 6 μL de mezcla de PEG / biotina-PEG y coloque el segundo cubreobjetos en la parte superior de modo que ambas etiquetas "b" miren hacia afuera.
    5. Alinee los bordes del cubreobjetos y colóquelos en una cámara humidificada y hermética para evitar que se sequen. Incubar los cubedores en la cámara de humedad a temperatura ambiente durante 3 h.
    6. Después de la incubación, retire los cubreobjetos de la cámara de humedad, separe cuidadosamente los pares de cubreobjetos y vuelva a colocarlos en sus bastidores. Lave cada rejilla en agua desionizada como antes, sumergiendo las rejillas con pinzas 10-20x y reemplazando el agua un total de 5x.
    7. Coloque todos los lados PEGylated de los cubreobjetos orientados en la misma dirección de modo que no haya dos superficies de cubreobjetos PEGylated enfrentadas entre sí. La superficie PEGylated estará muy pegajosa hasta que se seque por completo, así que tenga especial cuidado para evitar que los cubreobjetos se toquen. Seque cada bastidor y cubreobjetos como antes usando una corriente seca de gas nitrógeno (Figura 1B).
    8. Una vez que los cubreobjetos y sus bastidores estén completamente secos, guárdelos en un desecador al vacío para evitar la degradación del revestimiento de la superficie. Almacenado adecuadamente al vacío y con desecante para evitar que la humedad interrumpa el recubrimiento PEG; Los cubreobjetos se pueden usar durante aproximadamente 1 semana.

3. Preparación de perlas recubiertas de kinesina

  1. Selección y preparación del constructo de kinesina rigurosa
    1. Expresar y purificar los constructos de quinesina de rigor según los protocolos publicados53,54. Congelar rápidamente 5 μL de alícuotas de 0,02 mg/ml de soluciones de kinesina y almacenar a -80 °C durante un máximo de 1 año.
      NOTA: Las proteínas de quinesina rigurosa tienen una mutación puntual G234A que impide la hidrólisis de ATP. Cuando se conjugan con microperlas, las interacciones de alta afinidad con los microtúbulos permiten que las perlas mantengan cargas de 10-20 pN durante varios minutos. Las versiones mutadas por rigor tanto del homodímero K56053 de kinesina-1 comúnmente empleado como de una construcción K43955 optimizada adicional también se han empleado con éxito en estos ensayos54. Esta construcción mejorada de K439 contiene un dominio de dimerización EB1 para mejorar la estabilidad y una etiqueta C-terminal 6-His para la unión específica a un anticuerpo 6-His, como se describe a continuación.
  2. Unión del anticuerpo 6-His a las perlas recubiertas de estreptavidina
    1. Agregue 50 μL de perlas de poliestireno recubiertas con estreptavidina de 1 μm de diámetro en un tubo de centrífuga de 0,5 ml. Sonicate durante 30 s.
    2. Añadir 10 μL de 200 mM de TDT a 790 μL de 1x BRB80. Agregue 10 μL de perlas sonicadas a 40 μL de este tampón TDT 1x BRB80 + 2.5 mM.
    3. Combinar 1 μL de anticuerpo 6-His biotinilado y 49 μL de 1x BRB80 + 2,5 mM DTT; Vórtice brevemente para mezclar.
    4. Combine los 50 μL de mezcla de perlas diluidas y 50 μL de dilución de anticuerpos en un tubo nuevo. Colocar el tubo en un rotador de tubo a 4 °C y girar durante 1 h. Girar la mezcla de perlas durante 10 min a 3.000 x g a 4 °C.
    5. Pipetear el sobrenadante y resuspender el pellet en 100 μL de solución de caseína de 2 mg/ml en 1x BRB80. Repita esta centrifugación y resuspensión 2x.
  3. Adición de kinesina rigurosa
    1. Resuspender el pellet final en 100 μL de solución de caseína de 2 mg/ml. En un tubo de centrífuga de 0,5 ml, combine 5 μL de 0,02 mg/ml de quinesina rigurosa y 5 μL de perlas, mezclando suavemente moviendo ligeramente el tubo ~10x.
    2. Mantenga la suspensión de talón K439 G234A y las perlas 6-His restantes en el rotor a 4 °C cuando no esté en uso. Las cuentas deben prepararse frescas y usarse el mismo día para los experimentos, ya que tienden a agruparse y perder actividad más allá de este tiempo.

4. Montaje de la cámara de microscopía

  1. Preparación de portaobjetos de vidrio y construcción de cámaras
    1. Enjuague los portaobjetos de vidrio de microscopio de 75 mm x 25 mm primero con agua ultrapura, seguido de un limpiador de vidrio sin rayas con amoníaco y luego una vez más con agua ultrapura. Agitar para eliminar el exceso de gotas de agua. Seque los portaobjetos con una corriente de nitrógeno para que no queden rayas y coloque los portaobjetos sobre una toalla de papel (Figura 2A).
    2. Con tijeras, corte la cinta de doble cara en tiras de ~2-3 mm x 2,5 cm (2 tiras por cámara simple y 3 por cámara doble).
    3. Usando fórceps, coloque dos tiras de cinta adhesiva en un portaobjetos de vidrio para que haya ~ 0.5 cm de espacio entre ellos para construir una sola cámara. Para cámaras dobles, use el mismo espacio, pero con tres tiras de cinta (Figura 2B). El volumen del canal de muestra utilizando este método es de aproximadamente 10 μL.
      NOTA: Cuanto más ancha(s) sea(s) la(s) cámara(s), más probable es que se formen burbujas cuando se fluyan las soluciones; Sin embargo, las cámaras que tienen menos de 0,5 cm de ancho pueden ser difíciles de usar debido al área reducida para la obtención de imágenes.
    4. Raspa la longitud de cada tira de cinta con pinzas para que la cinta quede firmemente adherida al portaobjetos de vidrio.
    5. Libere la presión del desecador y use fórceps para extraer un cubreobjetos biotinilados de un estante de almacenamiento. Coloque un cubreobjetos biotinilados encima del portaobjetos de vidrio con pinzas. Asegúrese de que el lado biotinilado esté orientado hacia adentro, hacia el portaobjetos de vidrio.
    6. Usando el extremo posterior plano de las pinzas, presione suavemente el vidrio donde el cubreobjetos toca la cinta para sellar firmemente las cámaras. Se debe utilizar una ligera presión para garantizar que el cubreobjetos no se agriete (Figura 2C).
    7. Guarde las cámaras de microscopía terminadas en un recipiente hermético, lejos de la luz directa, hasta su uso (Figura 2D).
      NOTA: Se recomienda utilizar cámaras el mismo día en que se fabrican, ya que los cubreobjetos biotinilados se degradan cuando se exponen al aire.
  2. Flujo de reactivos de microscopía
    1. Construya una cámara de humedad colocando un pañuelo doblado sin pelusa humedecido con agua ultrapura en el fondo de una caja de punta de pipeta vacía. Las cámaras de muestra deben mantenerse en esta caja entre los pasos de flujo para reducir la evaporación de las soluciones del canal.
    2. Introduce todos los reactivos pipeteando el líquido en un extremo del canal y absorbiendo el líquido en el extremo opuesto. Para la mecha, gire un extremo del tejido y colóquelo suavemente en el lado de salida de la cámara, permitiendo la acción capilar para distribuir homogéneamente el reactivo (Figura 3A). Lleve todos los reactivos a temperatura ambiente justo antes de fluir para evitar la despolimerización de los microtúbulos.
    3. Usando una punta de pipeta en ángulo de 20 μL para que toque el lado de entrada de una cámara, fluya lentamente en 10 μL de 0,5 mg/ml de estreptavidina o neutravidina. Utilice puntas de pipeta más pequeñas y un flujo lento y constante de reactivos para disminuir la probabilidad de obtener burbujas en la cámara (Figura 3B).
    4. Incubar el portaobjetos en la cámara de humedad durante 4 minutos con el lado del cubreobjetos de la cámara hacia abajo. Esta orientación permitirá que objetos más grandes, como microtúbulos o perlas, se hundan cerca de la superficie pegilada.
    5. Enjuague la cámara con 20 μL de 1x BRB80, usando un pañuelo sin pelusa para extraer líquidos. Si hay una fuga presente en la cámara, deseche la corredera y comience con otra; Las pequeñas burbujas que se producen en la cámara no afectarán negativamente las imágenes.
    6. Repita los pasos de flujo, incubación y lavado con 10 μL de solución bloqueadora de caseína de 0,5 mg/ml (Figura 3C). Diluir microtúbulos biotinilados de color rojo lejano ~1:20 y fluir 10 μL en la cámara. Incubar durante 5 min y enjuagar la cámara con 20 μL de 1x BRB80 (Figura 3D). La densidad óptima de estos microtúbulos dentro de un campo de visión de imagen de 100 μm x 100 μm debe ser de 10-20; y la dilución en esta etapa debe ajustarse para lograr esta relación de unión superficial.
    7. Repita los pasos de flujo, incubación y lavado con 10 μL de una concentración apropiada (típicamente 1-10 nM) de proteína motora o no motora de reticulación a estudiar (Figura 3E).
    8. Flujo en 10 μL de microtúbulos de rodamina diluidos a una concentración similar a la de los microtúbulos de color rojo lejano biotinilados anteriores. Repita los pasos de incubación y lavado (Figura 3F).
    9. Combine 1 μL de perlas recubiertas de quinesina rigurosa y 19 μL de tampón de reacción optimizado para la actividad de la proteína de reticulación. Por ejemplo, para el análisis de la actividad de la quinesina-5, use tampón de reacción con 1 mM de rompedor de enlace TCEP, 0.2 mg/ml de alfa caseína, 70 mM de KCl, sistema de eliminación de oxígeno (4.5 mg/ml de glucosa, 350 unidades/ml de glucosa oxidasa, 34 unidades/ml de catalasa), 1 mM de TDT y ATP a la concentración deseada (por ejemplo, 1 mM para condiciones de velocidad máxima de kinesina) en 1x BRB80 (Figura 3G ). Para el análisis de proteínas no motoras, omitir ATP y variar la concentración de KCl para modular la fuerza de interacción proteína-microtúbulos en estos ensayos.
    10. Selle ambos bordes de la cámara con esmalte de uñas transparente y espere hasta que el esmalte se seque antes de obtener imágenes (Figura 3H). Una cámara construida con éxito no tendrá fugas presentes y burbujas mínimas.

5. Obtención de imágenes de haces de microtúbulos con TIRF de 3 colores

  1. Emplear un instrumento de microscopio invertido que tenga capacidades de imagen TIRF, y en el que se ha construido una trampa óptica de haz único (Figura 4).
    NOTA: Para los estudios descritos aquí, se utilizó un microscopio invertido con una lente objetivo de aceite 100x/NA1.49, módulo TIRF y tres láseres a 488 nm, 561 nm y 640 nm para la proteína marcada con GFP, microtúbulos marcados con rodamina y microtúbulos biotinilados marcados en rojo lejano, respectivamente.
    1. Agregue una gota de aceite de inmersión en el cubreobjetos de la cámara de muestra. El exceso de aceite puede dañar el objetivo del microscopio. Con el lado del cubreobjetos de la cámara de muestras hacia abajo, coloque la muestra que se va a fotografiar en la plataforma del microscopio.
    2. Levante lentamente el objetivo para que haya contacto entre el cubreobjetos y el objetivo a través del aceite. Ajuste la altura del objetivo para que la superficie del cubreobjetos de la cámara de muestras esté enfocada.
    3. Grabe imágenes de un solo fotograma de la muestra en los tres canales. Para los experimentos aquí, use 100-200 ms de exposición como una duración óptima de la imagen en los tres canales; Los tiempos de exposición más largos pueden resultar en un aumento del fotoblanqueo.
    4. Ajuste la potencia del láser para lograr una buena relación señal-ruido de las muestras mientras minimiza el fotoblanqueo durante los 2-5 minutos cuando se ensaya el paquete individual. Para el láser utilizado aquí (Figura 4 y Figura 5), utilice una potencia láser de 5 mW para el canal GFP y 3 mW para ambos canales de microtúbulos como óptimo.
      NOTA: Los haces ensamblados con éxito deben consistir en un microtúbulo inmovilizado superficialmente en el canal rojo lejano, una región coextensiva de varias micras con una señal significativa de proteína GFP y un microtúbulo de rodamina que se superponga a estas regiones y luego se extienda varias micras lejos del haz (Figura 5B, C y Figura 6 ). Las imágenes en vivo del microtúbulo de rodamina deberían revelar fluctuaciones sutiles en el extremo del microtúbulo no reticulado, lo que indica que este filamento no está unido a la superficie u otras proteínas en la cámara.
    5. Observe la frecuencia de los haces de microtúbulos por campo de visión. Para una muestra preparada con éxito, debe haber aproximadamente 3-4 haces de microtúbulos presentes por campo de visión de 100 μL x 100 μL por cámara.

6. Realización de experimentos de trampas ópticas en haces de microtúbulos

  1. Calibración preexperimental de condiciones
    1. Para realizar estos experimentos, utilice una trampa óptica de haz único con una rigidez de 0.05-0.1 pN / nm. Incorpore la óptica de captura y el fotodetector sensible a la posición en un microscopio invertido con capacidad TIRF introduciendo filtros de paso corto justo debajo del objetivo y por encima del condensador, respectivamente (Figura 4).
    2. Además, agregue una etapa de nanoposicionamiento en la que se asienta la muestra para permitir al usuario mover los microtúbulos con precisión a escala nanométrica de manera controlada durante estos ensayos. El sistema utilizado aquí para adquirir datos representativos ha sido descrito en el trabajo publicado 27,53,54,56,57.
      NOTA: Aunque más allá del alcance de este protocolo, hay múltiples recursos disponibles que detallan la construcción y calibración de una trampa óptica de haz único58,59,60.
    3. Observe la densidad de las perlas en la muestra utilizando un canal de campo claro o DIC y el objetivo 100x en el microscopio. Utilice la microscopía de campo claro solo para identificar y manipular cuentas y no para grabar simultáneamente con la adquisición de imágenes de fluorescencia. Espaciar las cuentas para que estén a un mínimo de 10 μm de distancia entre sí en promedio, y asegúrese de que estén libres de cualquier tipo de confinamiento o fijación superficial y no estén unidas entre sí o agrupadas de otra manera.
    4. Asegúrese de que los microtúbulos biotinilados de color rojo lejano estén firmemente unidos a la superficie del cubreobjetos, sin movimiento browniano visible, como movimientos a lo largo del eje de microtúbulos o extremos libres de microtúbulos que fluctúan en solución.
    5. Asegúrese de que los microtúbulos de rodamina estén unidos a los microtúbulos biotinilados a través de la MAP de reticulación y fluctúen visiblemente en sus extremos libres. La fijación superficial de microtúbulos no biotinilados a menudo indica que la PEGilación puede haber sido infructuosa o que el recubrimiento PEG se ha degradado.
  2. Mediciones de deslizamiento de microtúbulos de accionamiento del motor
    1. Expresar y purificar la proteína motora de interés siguiendo los protocolos publicados. Por ejemplo, las proteínas de quinesina-5 marcadas con GFP de longitud completa se han purificado con éxito y se han empleado en estos ensayos 53,61, así como en kinesina-1262 y kinesina-1463 no marcadas. Ensamble y visualice haces reticulados de proteínas motoras como se describió anteriormente en los pasos 4 y 5.
    2. Capture con la trampa óptica una sola cuenta libre en solución que exhiba movimiento browniano. Ajuste la óptica de la trampa según sea necesario para mover el talón al centro del campo de visión. Asegúrese de que el patrón de interferencia reflejado del haz de trampa sea simétrico y ajuste la óptica de la trampa para resolver cualquier asimetría del haz.
    3. Mueva la etapa de muestra de modo que el extremo libre de un microtúbulo de rodamina dentro de un haz esté directamente debajo de la perla y la cuenta esté a varias micras de distancia de la región de superposición que contiene proteínas de reticulación para minimizar el fotoblanqueo inducido por el haz de trampa. Baje el cordón en el eje Z hasta que choque con el microtúbulo. Tenga cuidado de bajar el talón suavemente y no empuje el talón contra la superficie del cubreobjetos, ya que esto puede causar que se pegue a la superficie del cubreobjetos.
    4. Apague brevemente la trampa para observar con el canal de campo claro la motilidad de la cuenta unida al microtúbulo deslizante. Al realizar ensayos de proteínas motoras, la cuenta unida se moverá direccionalmente a medida que los microtúbulos se separan. Reactiva la trampa y captura la cuenta de nuevo.
    5. Comience a grabar datos de fluorescencia en los tres canales (488 nm, 561 nm, 640 nm) a una velocidad de 1-2 fotogramas por s utilizando la potencia del láser y los tiempos de exposición que se optimizaron en el paso 5 anterior.
    6. Usando el software de computadora de captura, registre los datos de voltaje del fotodetector sensible a la posición (señales de intensidad X, Y y SUM), la etapa de nanoposicionamiento (coordenadas X, Y y Z) y el estado del obturador de la cámara TIRF. Comience a digitalizar estos valores de voltaje de captura utilizando una placa de adquisición de datos de entrada de voltaje dedicada controlada por el software apropiado (como el código LabView escrito a medida) a una velocidad de 1-10 kHz, dependiendo de los requisitos experimentales.
    7. Monitoree la señal de fuerza a medida que se adquieren los datos y preste mucha atención a cualquier anomalía que pueda interferir con la recopilación exitosa de datos.
      NOTA: Las anomalías incluyen, entre otras, (1) otras perlas que se mueven hacia la trampa, (2) la cuenta que escapa prematuramente de la trampa y (3) caídas repentinas de fuerza y la posterior falla para reiniciar la fuerza contra la trampa, lo que indica problemas con las moléculas de quinesina de rigor en la superficie de la cuenta.
    8. Después de la medición, desactive la trampa para liberar la cuenta y repita con una nueva cuenta y un nuevo microtúbulo hasta que se logre el número requerido de repeticiones experimentales.
  3. Mediciones pasivas de resistencia a la reticulación
    1. Expresar y purificar las proteínas de reticulación no motoras de interés siguiendo los protocolos publicados. Por ejemplo, en estos ensayos se han empleado con éxito PRC1 43,54,57 marcado con GFP de longitud completa y una construcción truncada 56 dimérica NuMA. Ensamble y visualice los paquetes entrecruzados como se describe anteriormente en los pasos 4 y 5.
    2. Identificar un haz de microtúbulos adecuado que contenga solo dos microtúbulos, uno biotinilado con unión superficial completa y un microtúbulo no biotinilado que esté parcialmente libre en solución; esto da un extremo libre para unir una cuenta y garantiza que la cuenta no esté unida al microtúbulo unido a la superficie y esté alineada en el eje X o Y, de modo que el movimiento del escenario sea a lo largo de un solo eje.
    3. Usa la trampa óptica para capturar una cuenta libre que se somete a un movimiento browniano. Una vez que la cuenta haya quedado atrapada, mueva con cuidado la cuenta al haz de microtúbulos seleccionado, asegurándose de que no se tire de otras cuentas en la trampa en el proceso. Asegúrese de que la perla esté a varias micras de distancia de la región de superposición que contiene proteínas de reticulación para minimizar el fotoblanqueo de la etiqueta GFP.
    4. Baje con cuidado el cordón en el eje Z hasta que haga contacto con el borde del segmento libre del microtúbulo de rodamina. Tire hacia arriba suavemente y muévase perpendicular al eje de los microtúbulos para verificar la fijación observando la flexión del microtúbulo de rodamina y siguiendo la posición del talón. Si no está conectado, repita el suave golpe de la cuenta sobre el microtúbulo hasta que esté conectado.
    5. Realinee cuidadosamente el microtúbulo de rodamina a lo largo del eje de microtúbulos del microtúbulo unido a la superficie moviendo la etapa de nanoposicionamiento y configure los parámetros para la extracción automatizada del haz de microtúbulos. Ajuste la dirección a lo largo del eje paralelo de los microtúbulos, establezca la velocidad de tracción deseada (25-200 nm / s es un rango útil de velocidades) y el tiempo de tracción deseado (aproximadamente 30 s a 2 min) dependiendo de la longitud de superposición.
    6. Comience a grabar datos de fluorescencia en los tres canales (488 nm, 561 nm, 640 nm) a una velocidad de 1-2 fotogramas por segundo. Utilice potencias láser y tiempos de exposición optimizados en el paso 5 anterior.
    7. Inicie el movimiento automatizado de la etapa y registre los datos de captura desde el detector sensible a la posición, el escenario y el estado de la cámara TIRF. Monitoree cualquier factor que pueda interferir con la recopilación de datos, que incluyen, entre otros, (1) otra cuenta que ingresa a la trampa, (2) pérdida prematura de la reticulación de microtúbulos o (3) desprendimiento de perlas del microtúbulo de rodamina.
    8. Desactive la trampa para liberar la cuenta y repita el experimento como desee. Se puede utilizar una cámara de muestra típica durante aproximadamente 30 minutos antes de que se produzca la degradación de los haces y la pérdida de actividad proteica.
      NOTA: Los efectos de degradación variarán según la reticulación utilizada, pero pueden manifestarse como la formación de puntos estáticos en los microtúbulos o en la superficie, la pérdida de fluctuaciones de microtúbulos que indican una unión no específica o la incapacidad de unir perlas estables a los microtúbulos.

7. Análisis de datos y correlación de imágenes de fluorescencia con registros de trampas ópticas

NOTA: Para optimizar la recopilación de datos, es beneficioso emplear dos sistemas de control informático separados: uno para el software de captura óptica y otro para las imágenes de fluorescencia. Esta configuración permite la adquisición de datos de alta velocidad en ambas modalidades experimentales y elimina los retrasos de nano y microsegundos en la ejecución de la operación que se introducen en los datos, lo que puede surgir cuando se usa una sola CPU.

  1. Digitalice los datos de captura óptica a una velocidad optimizada para las proteínas de reticulación motoras o no motoras empleadas y sus tasas esperadas de paso (por ejemplo, típicamente entre 1-10 kHz).
  2. Grabe las señales de voltaje X, Y y SUM del fotodetector sensible a la posición, así como los datos de posición X, Y y Z de la etapa de nanoposicionamiento utilizando un software dedicado para controlar la trampa óptica y muestrear las señales de voltaje digital de estos componentes.
  3. Grabe la señal digital de estado de obturación abierta de la cámara con un canal de entrada de voltaje adicional en la placa de adquisición de datos de captura óptica. Esto permite la correlación de los datos de imágenes de fluorescencia con las trazas de tiempo de captura óptica. Comience la recopilación de datos con la trampa óptica antes del inicio de la imagen para que la señal de la cámara del primer fotograma se registre correctamente.
  4. Promedie los datos de series temporales sin procesar adquiridos a altas velocidades de muestreo utilizando un método de filtrado apropiado, como ventana deslizante, filtro mediano o filtro gaussiano, según las necesidades.
  5. Cuantifique los datos de series temporales de imágenes de fluorescencia utilizando métodos como el análisis de escaneo lineal, en el que se calcula el valor de intensidad de píxeles a lo largo de la longitud de la región de microtúbulos. A partir de estas líneas, se analizan las trayectorias de los microtúbulos y, por lo tanto, las regiones de superposición. Además, utilice la intensidad de fluorescencia del canal de proteína reticulante para calcular la localización, concentración y densidad de proteínas.
  6. La correlación de la fuerza y los datos de imagen es un resultado esencial de este sistema experimental. Por ejemplo, seleccione y promedie todos los puntos de datos de fuerza dentro de una región de exposición de cámara determinada (indicada por el pico de señal digital correspondiente en el canal de la cámara) para compararlos directamente con el marco de imagen de fluorescencia correspondiente. Posteriormente, extraiga las relaciones entre la magnitud de la fuerza y el número de proteínas de reticulación, la longitud de superposición o la distribución de reticulación.

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Results

La preparación de haces de microtúbulos adecuados para el análisis biofísico se considera exitosa si se cumplen varios de los criterios clave. Primero, las imágenes en tres colores deben revelar dos microtúbulos alineados con una concentración de proteína de reticulación que decora preferentemente la región de superposición (Figura 5B, C y Figura 6B). Idealmente, la distancia entre el borde de superposición y el extr...

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Discussion

Las redes de microtúbulos son empleadas por innumerables tipos de células para realizar una amplia gama de tareas que son fundamentalmente de naturaleza mecánica. Para describir cómo funcionan las células tanto en estados sanos como en estados de enfermedad, es fundamental comprender cómo estas redes a escala micrométrica están organizadas y reguladas por las proteínas de tamaño nanométrico que las construyen colectivamente. Las herramientas biofísicas, como las pinzas ópticas, son muy adecuadas para sondear...

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgements

Los autores desean agradecer el apoyo de R21 AG067436 (a JP y SF), T32 AG057464 (a ET) y Rensselaer Polytechnic Institute School of Science Startup Funds (a SF).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10W Ytterbium Fiber Laser, 1064nmIPG PhotonicsYLR-10-1064-LP
405/488/561/640nm Laser Quad Band Set for TIRF applicationsChromaTRF89901v2
6x His Tag Antibody, Biotin ConjugateInvitrogen#MA1-21315-BTIN
Acetone, HPLC gradeFisher Scientific18-608-395
Alpha casein from bovine milkSigma1002484390
ATPFisher ScientificBP413-25
BenzonaseNovagen70746-3
Biotin-PEG-SVA-5000Laysan Bio, Inc.NC0479433
BL21 (DE3) Rosetta CellsMillipore Sigma71-400-3
CatalaseMP Biomedicals LLC190311
CFI Apo 100X/1.49NA oil immersion TIRF objectiveNikonN/A
ChloramphenicolACROS Organics227920250
Coverslip Mini-Rack, for 8 coverslipsFisher ScientificC14784
Delicate Task WipersKimberly-Clark34120
Dextrose AnhydrousFisher ScientificBP3501
D-SucroseFisher ScientificBP220-1
DTTFisher ScientificBP172-25
Ecoline Immersion Thermostat E100 with 003 BathLAUDA-Brinkmann27709
EDTAFisher ScientificBP118-500
EGTAMillipore Corporation32462-25GM
FIJI / Image Jhttps://fiji.sc/N/A
Frosted Microscope SlidesCorning12-553-1075mmx25mm, with thickness of 0.9-1.1mm
Glucose OxidaseMP Biomedicals LLC195196Type VII, without added oxygen
GMPCPPJena BiosciencesJBS-NU-405SCan be stored for several months at -20 °C and up to a year at -80 °C
Gold Seal-Cover GlassThermo Scientific3405
HEPESFisher ScientificBP310-500
ImidazoleFisher Scientific03196-500
IPTGFisher ScientificBP1755-10
Laboratory dessicatorBel-Art999320237190mm plate size
Kanamycin SulfateFischer ScientificBP906-5
KIF5A K439 (aa:1-439)-6HisGilbert Lab, RPIN/Adoi.org/10.1074/jbc.RA118.002182
KimwipeKimberley ClarkZ188956lint-free tissue
Immersion Oil, Type BCargille16484
Lens TissueThorLabsMC-5
LuNA Laser launch (4 channel: 405, 488, 561, 640nm)NikonN/A
LysozymeMP Biomedicals LLC100834
Magnesium Acetate TetrahydrateFisher ScientificBP215-500
Microfuge 18Beckman Coulter367160
MPEG-SVA MW-5000Laysan Bio, Inc.NC0107576
NeutravadinInvitrogenPI31000
Nikon Ti-E inverted microscopeNikonN/ANikon LuN4 Laser
Ni-NTA ResinThermo Scientific88221
Oligonucleotide - CACCTATTCTGAGTTTGCGCGA
GAACTTTCAAAGGC		IDTN/A
Oligonucleotide - GCCTTTGAAAGTTCTCGCGCAA
ACTCAGAATAGGTG		IDTN/A
Open-top thickwall polycarbonate tube, 0.2 mL, 7 mm x 22 mmBeckman Coulter343755
Optima-TLX UltracentrifugeBeckman Coulter361544
Paclitaxel (Taxol equivalent)Thermo Fisher ScientificP3456
PIPESACROS Organics172615000
PMSFMillipore7110-5GM
Porcine Tubulin, biotin labelCytoskeleton, Inc.T333P
Porcine Tubulin, HiLyte 647 FluorCytoskeleton, Inc.TL670Mfar red labelled
Porcine Tubulin, RhodamineCytoskeleton, Inc.TL590M
Porcine Tubulin, Tubulin ProteinCytoskeleton, Inc.T240
Potassium AcetateFisher ScientificBP364-500
Prime 95B sCMOS cameraPhotometricN/A
Quadrant Detector Sensor HeadThorLabsPDQ80A
Quikchange Lightning KitAgilent Technologies210518
Sodium BicarbonateFisher ScientificS233-500
Sodium Phosphate Dibasic AnhydrousFisher ScientificBP332-500
Square Cover GlassesCorning12-553-45018 mm x 18 mm, with thickness of 0.13-0.17 mm
Streptavidin MicrospheresPolysciences Inc.24162-1
Superose-6 ColumnGE Healthcare29-0915--96
TCEPThermo Scientific77720
TLA-100 Fixed-Angle RotorBeckman Coulter343840
Ultrasonic Cleaner (Sonicator)VevorJPS-08A(DD)304 stainless steel, 40 kHz frequency, 60 W power
Vectabond APTES solutionVector LaboratoriesSP-1800-7
Windex Powerized Glass Cleaner with Ammonia-DS.C. JohnsonSJN695237

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