Cultivos neuronales del hipocampo para detectar y estudiar nuevos anticuerpos patógenos implicados en la encefalitis autoinmune

Resumen

La encefalitis autoinmune es una nueva categoría de enfermedades mediadas por anticuerpos del sistema nervioso central. Las neuronas del hipocampo se pueden utilizar para descubrir y caracterizar estos anticuerpos. Este artículo proporciona un protocolo para el cultivo celular primario y la inmunotinción para determinar los autoanticuerpos en el suero y el líquido cefalorraquídeo de los pacientes.

Resumen

En los últimos 15 años, se ha caracterizado una nueva categoría de enfermedades mediadas por anticuerpos del sistema nervioso central (SNC) y ahora se define como "encefalitis autoinmune" (EA). Actualmente hay 17 síndromes de EA conocidos, y todos están asociados con anticuerpos contra la superficie celular neuronal o proteínas sinápticas. Los síndromes clínicos son complejos y varían según el tipo de anticuerpo asociado. La más conocida de estas enfermedades es la encefalitis anti-N-metil D-aspartato (NMDAR), que es un trastorno neuropsiquiátrico prominente asociado con graves trastornos de memoria y comportamiento. Los anticuerpos asociados reaccionan con la subunidad GluN1 del NMDAR en el dominio N-terminal. El enfoque más utilizado para el descubrimiento y caracterización de anticuerpos EA incluye el cultivo de neuronas disociadas, fetales y roedores del hipocampo. Durante el proceso de caracterización de anticuerpos, las neuronas vivas en cultivo se exponen al suero o LCR de los pacientes, y la detección de reactividad indica que las muestras de suero o LCR del paciente contienen anticuerpos contra antígenos de superficie neuronal. Los cultivos del hipocampo también se pueden usar para determinar si los anticuerpos en pacientes son potencialmente patógenos examinando si causan alteraciones estructurales o funcionales de las neuronas. El nivel de éxito de estos estudios depende de la calidad de los cultivos y de los protocolos utilizados para obtener y detectar la reactividad de las muestras de pacientes. Este artículo proporciona un protocolo optimizado para el cultivo celular primario de neuronas del hipocampo de ratas fetales combinadas con inmunotinción para determinar la presencia de anticuerpos en el suero o LCR de los pacientes. También se presenta un ejemplo de cómo examinar los posibles efectos patogénicos de los anticuerpos NMDAR utilizando neuronas cultivadas e imágenes de calcio.

Introducción

La encefalitis autoinmune (EA) es una categoría recientemente descubierta de enfermedades del sistema nervioso central (SNC) mediadas por anticuerpos que se dirigen a la superficie neuronal o proteínas sinápticas ^1,2. Las características clínicas varían según el anticuerpo, pero comúnmente incluyen deterioro de la memoria y la cognición, alteración del comportamiento y síntomas psiquiátricos, movimientos anormales, disfunción del sueño, disminución del nivel de conciencia y convulsiones. Estos trastornos pueden afectar a individuos de todas las edades, con algunos tipos de EA que afectan predominantemente a niños y adultos jóvenes².

En los últimos 15 años, se han descrito 17 síndromes de EA con anticuerpos contra proteínas sinápticas específicas de superficie neuronal (Tabla 1). Algunos ejemplos de las dianas neuronales incluyen los receptores excitatorios sinápticos NMDAR^3,4 y AMPAR⁵, el receptor inhibidor sináptico GABAbR^6, la proteína neuronal secretada LGI1⁷ y la molécula de adhesión celular IgLON5⁸. Para la mayoría de estos EA, los estudios han demostrado que los anticuerpos interrumpen la estructura o función de su antígeno diana, apoyando fuertemente un papel patogénico. Por ejemplo, en la encefalitis anti-NMDAR, los anticuerpos reaccionan con el dominio N-terminal de la subunidad GluN1 del NMDAR, produciendo una internalización selectiva y reversible de estos receptores que resulta en alteraciones neuropsiquiátricas prominentes 4,9,10,11. Así, la identificación de cualquiera de los 17 anticuerpos conocidos en el suero o LCR de un paciente también puede utilizarse como prueba diagnóstica que establece el diagnóstico de un EA específico.

Una de las técnicas más utilizadas para la identificación y caracterización de estos anticuerpos incluye el uso de cultivos de neuronas disociadas, fetales y roedores del hipocampo. Estos cultivos son útiles por varias razones: el cerebro embrionario es fácil de disociar y contiene un bajo nivel de células gliales, la principal fuente de contaminación en los cultivos neuronales¹²; la población celular del hipocampo es relativamente homogénea en comparación con la mayoría de las otras regiones del SNC, con células piramidales que representan la gran mayoría^13,14; los cultivos se preparan a partir de embriones en etapa tardía cuando la generación de neuronas piramidales está completa pero las células granulares aún no se han desarrollado, lo que aumenta aún más la homogeneidad del cultivo; Cuando se cultivan, las neuronas piramidales expresan la mayoría de sus principales características fenotípicas, son capaces de formar dendritas bien desarrolladas y establecer redes sinápticamente conectadas que pueden ser utilizadas para investigaciones estructurales y electrofisiológicas^12,13; Como los anticuerpos no pueden penetrar en las neuronas vivas, el uso de cultivos vivos permite la identificación de objetivos antigénicos que residen en la superficie celular; y la inmunoprecipitación del complejo anticuerpo-antígeno de cultivos neuronales permite la identificación del antígeno diana⁵.

El éxito de los estudios que utilizan cultivos neuronales depende en gran medida de la calidad de los cultivos y de los protocolos utilizados para evaluar la inmunorreactividad del suero o líquido cefalorraquídeo (LCR) de un paciente. Las variables que pueden afectar los cultivos incluyen los procedimientos de aislamiento del hipocampo antes del desarrollo del cultivo, la disociación del tejido, la densidad de placa, la superficie de crecimiento utilizada y la composición de los medios^13,15,16. Este artículo proporciona un protocolo optimizado para el cultivo celular primario de neuronas del hipocampo de rata fetal combinadas con inmunotinción fluorescente que se puede utilizar para determinar la presencia de anticuerpos contra antígenos AE conocidos y objetivos de superficie potencialmente novedosos. También proporciona un ejemplo de cómo examinar los efectos patogénicos de los anticuerpos NMDAR mediante técnicas de imagen de células vivas utilizando neuronas cultivadas del hipocampo que expresan un indicador de calcio codificado genéticamente (GECI) de la familia GCaMP, GCaMP5G.

Proteína diana	Función proteica	Compartimento celular	Síndrome de Main
NMDAR (en inglés)	Ion Chanel	Proteína sináptica	Encefalitis anti-NMDAR
AMPAR	Ion Chanel	Proteína sináptica	Encefalitis límbica
GluK2	Ion Chanel	Proteína sináptica	Encefalitis
GABAaR	Ion Chanel	Proteína sináptica	Encefalitis
GABAbR	Receptor metabotrópico	Proteína sináptica	Encefalitis límbica
mGluR1	Receptor metabotrópico	Proteína sináptica	Encefalitis
mGluR2	Receptor metabotrópico	Proteína sináptica	Encefalitis
mGluR5	Receptor metabotrópico	Proteína sináptica	Encefalitis
D2R	Receptor metabotrópico	Proteína sináptica	Encefalitis de los ganglios basales
LGI1	Molécula de adhesión	Proteína de la superficie celular	Encefalitis límbica
CASPR2	Molécula de adhesión	Proteína de la superficie celular	Encefalitis límbica
IgLON5	Molécula de adhesión	Proteína de la superficie celular	Enfermedad anti-IgLON5
Neurexina-3α	Molécula de adhesión	Proteína de la superficie celular	Encefalitis
DNER (Tr)	Proteína transmembrana	Proteína de la superficie celular	Encefalitis
SEZ6L	Proteína transmembrana	Proteína de la superficie celular	Encefalitis
Anfifisina	Molécula estructural	Proteína de la superficie celular	Encefalitis límbica
DPPX	Peptidasa	Proteína de la superficie celular	Encefalitis

Tabla 1: Anticuerpos contra la superficie celular neuronal y proteínas sinápticas.

Protocolo

Todos los procedimientos fueron aprobados por el comité de ética local de la Universidad de Barcelona siguiendo la normativa europea (2010/63/UE) sobre el uso y cuidado de animales de experimentación. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de los pacientes y el estudio fue aprobado por la junta de revisión institucional local para el uso de muestras humanas (Hospital Clínic, HCB/2018/0192).

NOTA: Hay tres partes en el protocolo actual. El primero es para establecer los cultivos neuronales, el segundo es para la detección de anticuerpos de superficie utilizando cultivos vivos de neuronas, y el tercero es para determinar la patogenicidad de estos anticuerpos.

PARTE 1: Establecimiento de cultivos neuronales disociados, fetales y roedores del hipocampo

1. Pasos preparatorios

1. Recubrimiento de poli-L-lisina de las superficies de recubrimiento (3 días antes de la disección)
   1. Prepare el tampón de borato agregando 2,38 g de ácido bórico y 1,27 g de bórax a 500 ml de agua destilada y agitando durante 15 minutos hasta que se disuelva. Bajo una campana, esterilice la solución tampón filtrando (tamaño de poro de 0,2 μm), etiquete y guárdela a temperatura ambiente (RT).
      NOTA: Esta solución es estable y se puede utilizar durante 6 meses.
      PRECAUCIÓN: Cuando prepare el tampón de borato, use el equipo de protección personal recomendado.
   2. Prepare la solución madre de poli-L-lisina (PLL) (100 mg/ml) agregando 1 g de PLL a 10 ml de agua destilada y agitando hasta que se disuelva. Preparar alícuotas de 500 μL de solución madre de PLL. Para alcanzar una concentración final de 1 mg/ml, añadir 500 μL de alícuota de PLL a 50 ml de tampón de borato y agitar hasta que se disuelva, y esterilizar la solución filtrando (tamaño de poro de 0,2 μm).
      NOTA: Esta solución es estable y se puede utilizar durante 6 meses.
   3. Prepare las superficies para el recubrimiento. Use cubreobjetos de 12 mm de diámetro para procedimientos de inmunotinción y platos con fondo de vidrio para estudios que incluirán imágenes de neuronas vivas. Si utiliza cubreobjetos, autoclave y luego coloque cinco cubreobjetos en cada plato (3,5 cm de diámetro).
      NOTA: El grosor del cubreobjetos afecta a la calidad e intensidad de la señal de las imágenes adquiridas. La mayoría de los objetivos del microscopio están diseñados para cubreobjetos #1.5. Elija los cubreobjetos apropiados de acuerdo con la configuración y las técnicas de imagen.
   4. Bajo una campana, agregue 1,5 ml de solución de PLL a cada plato (plato con fondo de vidrio o plato de 3,5 cm con cinco cubreobjetos). Asegúrese de que todos los cubreobjetos estén sumergidos y almacenados en RT durante 24 h.
   5. 2 días antes de la disección, aspire la solución de PLL y lávese con agua estéril libre de endotoxinas, asegurándose de que los cubreobjetos estén sumergidos. Mantener el agua en los platos y almacenar en RT durante 24 h.
   6. 1 día antes de la disección, aspirar el agua y reemplazarla con medios de cultivo NB + B27 (ver más abajo), y colocar los platos en una incubadora a 37 °C durante 24 h.
2. Preparación de medios de cultivo y solución madre (1 día antes de la disección)
   1. Medio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM): Para 500 mL de DMEM High Glucose (4.5 g/L) sin L-Glutamina y rojo de fenol, agregue 50 mL de suero de caballo, 50 mL de suero fetal bovino (FBS), 10 mL de L-glutamina (200 mM), 10 mL de piruvato de sodio (100 mM), 10 mL de penicilina-estreptomicina (10,000 U/mL). Filtrar (tamaño de poro de 0,2 μm) y conservar en alícuotas de 5 ml a 4 oC con una tapa bien cerrada.
      NOTA: Esta solución es estable y se puede utilizar durante 1 mes.
   2. Medio neurobasal (NB) suplementado con B27 (NB + B27): A 50 mL de medio NB sin rojo fenol, añadir 1 mL de suplemento B27.
   3. Medio Hibernate-E suplementado con B27 (Hibernate + B27): A 50 mL de medio Hibernate-E, añadir 1 mL de suplemento B27.
   4. Solución fisiológica extracelular (EPS): A 1 L de agua estéril, agregue lo siguiente a las concentraciones finales especificadas: NaCl (140 mM), KCl (3.5 mM), HEPES (10 mM), glucosa (20 mM) y CaCl 2 (₂ mM). Revuelva hasta que se disuelva y ajuste el pH a 7.4 agregando NaOH (0.5 M) o HCl (0.5 M). Bajo la campana, esterilizar filtrando (tamaño de poro de 0,2 μm) y conservar a 4 oC.
3. Equipo y otros materiales de laboratorio (día de disección)
   1. Poner al baño maría a 37 °C. Calentar las siguientes alícuotas: 50 ml de HBSS y 5 ml de DMEM.
   2. Esterilice las siguientes herramientas sumergiéndolas en un vaso de precipitados que contenga etanol absoluto (Figura 1B): fórceps, pinzas curvas, tijeras, pinzas curvadas finas, pinzas rectas finas, tijeras de cirugía, pinzas de ángulo fino y tijeras de resorte de precisión.
      NOTA: Para proteger las herramientas, coloque un material blando (por ejemplo, toallitas de precisión científica) en la parte inferior del vaso de precipitados.
   3. Llene dos bandejas con hielo y coloque los siguientes elementos.
      1. Bandeja de hielo 1 (Figura 1C): Coloque las herramientas quirúrgicas en el vaso de precipitados con etanol absoluto, un vaso de precipitados con HBSS para enjuagar las herramientas quirúrgicas, una placa de 10 cm con HBSS para colocar los embriones, una placa de 6 cm con HBSS para colocar las cabezas de los embriones, y una placa de 6 cm con Hibernate + B27 para colocar los cerebros de los embriones.
      2. Bandeja de hielo 2: Colocar una alícuota de 1 mL de tripsina al 2,5% y una placa de 3,5 cm con Hibernación + B27 para el hipocampo disecado.
         NOTA: El tiempo necesario para este procedimiento depende de la experiencia del investigador y del número de embriones a diseccionar. Por lo tanto, el hielo debe permanecer congelado durante el tiempo necesario. Las bandejas de poliestireno se recomiendan para este propósito.

2. Disección y siembra (Figura 1)

1. Aislamiento del hipocampo
   NOTA: Las ratas preñadas con embriones en E18 son sacrificadas inmediatamente antes de que comience el protocolo de acuerdo con el comité de ética local de la Universidad de Barcelona, siguiendo la normativa europea (2010/63/UE) sobre el uso y cuidado de animales de experimentación. En este protocolo, se utilizó la inhalación de dióxido de carbono (CO₂) como método de eutanasia.
   1. Diseccionar a la rata a nivel del peritoneo abdominal con fórceps y tijeras. Extrae el útero con los embriones E18 y colócalo en un plato de 10 cm que se haya enfriado sobre hielo.
      NOTA: Es importante evitar que los pelos de rata se adhieran a los embriones. Se recomienda utilizar grandes cantidades de etanol al 70% para esterilizar el abdomen. A partir de este paso, trabaje dentro de la campana en la bandeja de hielo 1.
   2. Abra los sacos embrionarios y transfiera los embriones a la placa de 10 cm con HBSS, asegurándose de que los embriones estén completamente sumergidos.
   3. Retire la cabeza del embrión con tijeras y colóquela en el plato de 6 cm con HBSS. Repita este proceso con todos los embriones.
      NOTA: Para evitar la contaminación, todo el tejido, excepto las cabezas de embriones, debe desecharse en un recipiente con tapón de rosca.
   4. Sostenga la cabeza del embrión con pinzas curvas finas y perfore las órbitas con un par de pinzas rectas finas, entrando en un ángulo de 45 °, y luego suelte las pinzas curvas finas.
      NOTA: Los fórceps no deben atravesar el cerebro, por lo que es importante mantener el ángulo al entrar.
   5. Diseccionar la piel y el cráneo con las tijeras de cirugía, comenzando desde el hueso occipital hasta el hueso frontal. Retire el cerebro con un par de pinzas curvas finas y colóquelo en el plato de 6 cm con Hibernate + B27. Repita este proceso hasta que se recuperen todos los cerebros.
   6. Separe sagitalmente los telencéfalos con los fórceps finos-rectos.
      NOTA: A partir de este paso, la disección del hipocampo se lleva a cabo bajo un microscopio estereoscópico. Se recomienda utilizar lámparas articuladas para que la luz ilumine la superficie de disección desde los lados. También se recomienda utilizar un fondo negro ya que esto proporciona más contraste, permitiendo distinguir mejor el hipocampo.
   7. Prepara un plato de 10 cm colocando gotas de Hibernate + B27 a distancias de 1 cm (por ejemplo, en un círculo). Coloque un telencéfalo por gota de Hibernate + B27 y visualice a través del alcance de disección (se recomienda un aumento objetivo de 1.25x).
   8. Pelar cuidadosamente las meninges y quitar el tálamo para visualizar mejor el hipocampo.
   9. Diseccionar el hipocampo con las tijeras de resorte de precisión y colocarlo en el plato de 3,5 cm con Hibernate + B27 en la bandeja de hielo 2. Repita para cada telencéfalo hasta que se recojan todos los hipocampos.
   10. Recoja cuidadosamente todos los hipocampos con una pipeta Pasteur y transfiéralos a un tubo de 50 ml.
       NOTA: Tome el volumen mínimo de hibernación + B27 al recolectar el hipocampo para no diluir la tripsina.
2. Disociación celular
   1. Disociación enzimática del hipocampo
      1. En el tubo de 50 ml que contiene el hipocampo, agregue 1 ml de tripsina al 2,5% y llévelo a un volumen de 5 ml con HBSS. Incubar durante 15 min en el baño maría a 37 °C.
      2. Para diluir la tripsina, añadir 10 ml de HBSS precalentado e incubar durante 5 min en el baño maría a 37 °C.
      3. Transfiera los hipocampos que ahora aparecen como una masa de moco a un tubo de 50 ml con una micropipeta de 1.000 μL, agregue 6 ml de HBSS precalentado e incube durante 5 minutos en el baño de agua a 37 ° C.
   2. Disociación mecánica del hipocampo
      1. Transfiera la masa a un tubo de 2 ml con fondo cónico, tomando el volumen mínimo. Agregue 1 ml de medio DMEM precalentado. Homogeneizar el pellet con una micropipeta de 1.000 μL aspirando suavemente hacia arriba y hacia abajo.
         NOTA: Es fundamental evitar generar burbujas al aspirar, ya que las burbujas pueden lisar las células.
      2. Repita la aspiración hacia arriba y hacia abajo con una pipeta de vidrio pretirada (10x-20x), con su punta en contacto con el fondo cónico del tubo. Evita generar burbujas. Al final de este paso, la mezcla debe ser translúcida.
      3. Una vez mezclada homogéneamente de tal manera que la mezcla sea translúcida, transferir la mezcla a un tubo que contenga 4 ml de medio DMEM a 37 °C y homogeneizar con una pipeta de vidrio pipeteando hacia arriba y hacia abajo.
3. Siembra celular
   1. Cuenta las celdas. El número de neuronas en la solución se puede contar de acuerdo con los procedimientos de laboratorio estándar.
      NOTA: En experimentos de imágenes para la detección de anticuerpos y la actividad del calcio, una concentración de 50.000 células por plato de 3,5 cm es óptima.
   2. Manteniendo las celdas suspendidas, retire el volumen calculado y coloque en platos de 3,5 cm que contengan cubreobjetos recubiertos con PLL o en los platos con fondo de vidrio recubiertos de PLL.
   3. Distribuya uniformemente las células en los platos agitando suavemente en movimientos cruzados (hacia adelante y hacia atrás, luego de lado a lado; repita según sea necesario) y coloque los platos en la incubadora de_CO2 (5%).
      NOTA: Es importante utilizar movimientos cruzados para evitar que las células se asienten en la periferia del plato.
   4. Cada semana, agregue aproximadamente 1 mL de NB + B27, para que el cultivo no se seque.
      NOTA: Después de 2 semanas (14 días in vitro [div]), las neuronas están maduras y expresan todos los factores que se utilizarán para la experimentación. El número promedio total de neuronas obtenidas utilizando este protocolo es de aproximadamente 2.5 x 10⁶ neuronas provenientes de un promedio de 12 embriones E18 por rata preñada.

   
PARTE 2: Uso de cultivos neuronales del hipocampo para la detección de anticuerpos en proteínas de la superficie celular neuronal

NOTA: Esta parte del protocolo demuestra cómo se utilizan los cultivos del hipocampo para identificar anticuerpos anti-NMDAR en el suero y/o LCR de pacientes con encefalitis anti-NMDAR. La inmunotinción fluorescente se utiliza para visualizar la reactividad en las neuronas vivas, pero también se podrían utilizar otros métodos de visualización. Un control apropiado para este experimento sería suero o LCR de un individuo sano. Cuando utilice muestras humanas, tenga en cuenta que puede ser necesaria la aprobación del comité de ética institucional.

3. Inmunotinción fluorescente viva

1. Use 14 células div que se hayan cultivado en cubreobjetos (50,000 células por plato de 3.5 cm que contenga cinco cubreobjetos).
2. Dentro de la campana, enjuague los cubreobjetos con NB precalentado a 37 °C.
3. Añadir la muestra que en este caso contiene anticuerpos anti-NMDAR (utilizados como anticuerpo primario) diluidos en medios NB a 1:200 para suero o 1:2 para LCR e incubar 1 h a 37 °C (dentro de la incubadora de_CO2 (5%).
4. Enjuague cuidadosamente con PBS 3x en RT.
5. Añadir solución de fijación (formaldehído al 4% en PBS) e incubar a RT durante 5 min.
   PRECAUCIÓN: Cuando manipule formaldehído al 4%, trabaje dentro de la capucha y use el equipo de protección personal recomendado.
6. Lave 3 veces con PBS durante 5 minutos cada una.
7. Añadir el anticuerpo secundario Cabra anti-humano AF488 a 1:1000 dilución e incubar a RT durante 1 h.
   NOTA: Durante la incubación, protéjase de la exposición a la luz cubriendo con papel de aluminio.
8. Lave 3 veces con PBS durante 5 minutos cada una. Enjuagar con agua destilada
9. Monte los cubreobjetos con un medio de montaje líquido (por ejemplo, medios de montaje antidecolorantes con DAPI; aproximadamente 7 μL), aspire cualquier líquido restante y enjuague con agua destilada. Las neuronas ahora están listas para imágenes de fluorescencia.
   PRECAUCIÓN: Cuando manipule el medio de montaje, use el equipo de protección personal recomendado.

   

PARTE 3: Demostración de los efectos patógenos de anticuerpos utilizando imágenes de calcio

NOTA: Esta parte del protocolo demuestra cómo determinar si los anticuerpos en pacientes tienen un efecto funcional en los cultivos, lo que sugeriría patogenicidad. Para aumentar la importancia de los efectos, se utilizó un grupo de LCR de ocho pacientes. La actividad de calcio de los cultivos vivos se registró tras la estimulación química (NMDA + glicina) utilizando el indicador de calcio de fluorescencia GECI (GCaMP5G). Estos estudios requieren un microscopio de fluorescencia invertida con una cámara celular que pueda mantener las condiciones fisiológicas requeridas de las neuronas.

4. Imágenes de calcio

1. Use 14-18 células div que se hayan cultivado en cubreobjetos (50,000 células por plato de 3.5 cm con cinco cubreobjetos)
2. 1 semana antes de la toma de imágenes, agregue el vector viral pAAV2-CAG-GCaMP5G a 2.5 x^{10 10} GC / ml a las células e incube durante 5-7 días.
   NOTA: Este vector AAV serotipo 2 preempaquetado disponible comercialmente sobreexpresa el indicador de calcio codificado genéticamente GCaMP5G bajo un promotor CAG.
3. 1 día antes de la imagen, añadir la muestra del paciente (en este ejemplo, un pool de LCR diluido 1:25 en NB + B27) e incubar durante 24 h. Siempre filtre muestras humanas (tamaño de poro de 0,2 μm) antes de usarlas para evitar la contaminación.
   NOTA: Para estos estudios, el control del LCR de sujetos sanos debe ejecutarse en paralelo.
4. El día de la obtención de imágenes, prepare la configuración de imágenes y ajuste la cámara celular del microscopio a 37 ° C, llene el carril con agua destilada e infunda con 5% de_CO2 para mantener las condiciones fisiológicas celulares.
5. En la campana, lavar las celdas del paso 3 con 3 ml de EPS precalentado a 37 °C
6. Cubra las células con 2,45 ml de EPS y transfiéralas a la cámara celular del microscopio. Agregue NBQX (10 μM) para bloquear los receptores AMPA y KA para visualizar exclusivamente la respuesta del receptor NMDA.
7. En el microscopio de fluorescencia invertido equipado con una lámpara de mercurio y un cubo de filtro FIFC, adquiera una película de 2 minutos con fotogramas grabados cada 100 ms (actividad espontánea).
   NOTA: Se utilizó un objetivo aéreo 20x NA 0.75, y se tomaron imágenes (512 x 512 píxeles, escala de grises de 16 bits) cada 100 ms con una cámara sCMOS.
8. Adquiere la segunda película de 4 min con fotogramas grabados cada 100 ms. Poco después de comenzar la adquisición, agregue una solución de estimulación (NMDA [100 μM] + glicina [1 μM]) al plato.
   NOTA: La adición de medios en el plato generará turbulencias que podrían interrumpir las condiciones de imagen (enfoque, intensidad de fluorescencia y / o señal de fondo inespecífica). No agregue más de 50 μL de solución en el plato lleno de 2,5 ml para disminuir la probabilidad de tales alteraciones.
9. Utilizando el software de procesamiento de imágenes (aquí se utilizó ImageJ), extraer la señal de fluorescencia a lo largo del tiempo, obtenida tras la estimulación, de los cultivos incubados con el paciente y controlar las muestras de LCR.
   NOTA: Las sondas GCaMP, cuando se unen a iones de calcio libres, sufren un cambio conformacional que hace que se vuelvan más brillantes. Por lo tanto, el aumento en la intensidad de fluorescencia se correlaciona con una afluencia de calcio debido a la despolarización neuronal.
10. Determine las regiones de interés (ROI) a analizar. Segmente manualmente los somas de neuronas y agregue los ROI al administrador de ROI (Analyze > Tools > ROI Manager > Add). Guarde el ROI desde el menú ROI Manager (Más > Guardar).
11. Defina las medidas (Analizar > Establecer medidas) y seleccione el valor de gris medio. Extraiga el perfil de intensidad de fluorescencia media de los somas de celda haciendo clic en Más > medida múltiple y, a continuación, guarde la tabla generada como una hoja de cálculo .xls.
12. Realizar análisis estadísticos para comparar la fluorescencia entre grupos (LCR de los pacientes frente al LCR del control).

Resultados

Establecimiento de cultivos neuronales disociados, fetales y roedores del hipocampo
El protocolo presentado aquí se basa en los influyentes estudios sobre el cultivo de células nerviosas realizados por Banker y Goslin¹⁵. El protocolo se ha perfeccionado para obtener cultivos neuronales con morfología, densidad y pureza óptimas para realizar estudios de detección de anticuerpos de superficie neuronal. El protocolo de disección y siembra se divide en tres partes (Figura 1A). La primera parte, el aislamiento del hipocampo, consiste en la extracción quirúrgica del tejido vivo (Figura 1A, panel izquierdo). Como indica la figura, las ratas Wistar preñadas con embriones E18 son el material de partida clave para un cultivo exitoso. Una vez que se extrae el cerebro de los embriones E18, la microcirugía se lleva a cabo bajo un microscopio estereoscópico. Con las herramientas adecuadas (Figura 1B) y un manejo preciso, es posible separar el hipocampo del resto del tejido nervioso. La disposición de los tejidos en los medios específicos se representa en la Figura 1C. La segunda parte del protocolo consiste en la disociación celular del hipocampo. Se subdivide en dos pasos (Figura 1A, panel central): disociación enzimática y disociación mecánica del hipocampo, que dan como resultado células individuales intactas y disociadas. Utilizando esta metodología, es posible obtener cultivos celulares sin agregados celulares, como se representa en la Figura 2A-D. La tercera parte del protocolo consiste en la siembra de celdas (Figura 1A, panel derecho). Esta parte del protocolo es crucial para ajustar la densidad y homogeneidad del cultivo neuronal en la placa. Contar las células y sembrar 50.000 neuronas en un área de una placa de 3,5 cm proporciona una densidad óptima para llevar a cabo no solo experimentos para determinar la presencia de anticuerpos contra proteínas de la superficie celular neuronal (Figura 3) sino también para analizar la patogenicidad de estos anticuerpos con imágenes de calcio (Figura 4).

Figura 1: Protocolo visual para cultivos primarios de neuronas del hipocampo. (A) Diagrama de flujo que muestra las tres partes del protocolo para preparar cultivos de células disociadas de neuronas del hipocampo de ratas embrionarias en E18. El protocolo se divide en 1. Aislamiento del hipocampo, 2. Disociación celular, y 3. Siembra celular. (B) Selección de herramientas recomendadas para el aislamiento del hipocampo agrupadas en tres categorías: (1- Fórceps, 2- Fórceps curvos, 3- Tijeras) para la recolección de embriones, (4- Pinzas curvadas finas, 5- Pinzas rectas finas, 6- Tijeras de cirugía) para la extracción de cerebro, y (7- Pinzas de ángulo fino, 8- Tijeras de resorte de precisión) para el aislamiento del hipocampo. (C) Representación esquemática de la bandeja de hielo 1 con placas y medios necesarios para el aislamiento del hipocampo. Los embriones y las cabezas se colocan en HBSS, mientras que los cerebros se colocan en medio de hibernación + B27. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los cultivos de neuronas del hipocampo a 18 div son maduros, interconectados y expresan proteínas estructurales y funcionales.
En el crecimiento y maduración de los cultivos neuronales se pueden apreciar dos fases diferenciadas: la fase de polarización de la neurona (Figura 2A,B) y la fase de desarrollo dendrítico y construcción de la red sináptica (Figura 2C,D). Las células en 1 div se distribuyen uniformemente y se han adherido a la placa, desarrollando una lámina alrededor del cuerpo celular con neuritas menores que comienzan a extenderse (Figura 2A). Después de algunos días en cultivo, las neuritas se extienden una corta distancia. Las células muestran una polarización significativa, pero hay poco crecimiento neto (Figura 2B). Después de esta etapa, la sinaptogénesis es prominente y las neuronas comienzan a interconectarse. La red neuronal sigue creciendo y se vuelve más compleja (Figura 2C). A los 18 div, las neuronas están maduras e interconectadas; se construye la red neuronal (Figura 2D). Una vez que las espinas sinápticas se forman y conectan, las neuronas están completamente polarizadas y expresan todas las proteínas funcionales y estructurales. De las muchas proteínas expresadas por neuronas cultivadas maduras, el receptor neuronal NMDA (Figura 2E) y la proteína sináptica PSD95 (Figura 2F) han sido elegidos aquí como marcadores representativos. Además, es posible visualizar selectivamente los axones marcando neurofilamentos (NF) (Figura 2G) y visualizando dendritas dirigiéndose a la proteína MAP2 (Figura 2H).
Figura 2: Curso temporal de la maduración de cultivos celulares disociados de neuronas del hipocampo. (A-D) Imágenes de contraste de fase de neuronas del hipocampo durante los primeros 18 días de cultivo. (A) Neuronas a 1 div al unirse al sustrato recubierto de PLL. (B) La aparición de pequeñas neuritas en neuronas a 5 div. (C) Las neuronas a 11 div han desarrollado neuritas largas que se alargan y adquieren características axonales. (D) Las neuronas a 18 div son maduras y han formado una red neuronal. Barra de escala (A-D) = 40 μm. (E-H) Imágenes fluorescentes representativas tomadas por microscopía de barrido láser confocal utilizando marcadores selectivos para mostrar neuronas maduras a 18 div. Los cultivos neuronales se fijaron e inmunotiñeron con anticuerpos que tiñen selectivamente (E) receptor neuronal (NMDAR), (F) marcador sináptico (PSD95), (G) marcador axonal (neurofilamento, NF) y (H) marcador dendrítico (MAP2). Barra de escala (E-H) = 20 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los anticuerpos en muestras de pacientes reaccionan con antígenos de superficie celular neuronal
Las muestras (suero y LCR) obtenidas de pacientes que tienen encefalitis anti-NMDAR contienen autoanticuerpos que reconocen el NMDAR presente en la superficie de las neuronas. La incubación de los cultivos con las muestras de pacientes produce una intensa señal de fluorescencia en la superficie celular y las dendritas (Figura 3A,C). Por el contrario, las muestras control no producen señal de fluorescencia cuando se administran a los cultivos neuronales (Figura 3B, D). Estos hallazgos muestran cómo los cultivos se pueden utilizar para detectar anticuerpos en muestras de pacientes y pueden conducir a la identificación de nuevos anticuerpos que se dirigen a la superficie celular neuronal. 

La muestra de LCR del paciente disminuye la concentración de calcio intracelular en cultivos de neuronas del hipocampo inducidos por NMDA
Para evaluar el efecto de los anticuerpos de los pacientes sobre la actividad neural (después de 24 h de tratamiento), los transitorios de calcio intracelular se monitorizaron ópticamente desde las neuronas cultivadas en tiempo real tras la estimulación mediada por NMDA. La aplicación de NMDA genera un aumento en la intensidad de fluorescencia, como lo indica un cambio en la fluorescencia verde intracelular (Figura 4A y Video Suplementario 1). Las neuronas tratadas con la muestra de LCR control mostraron una mayor diferencia en la intensidad de fluorescencia (56%) cuando se aplicó el estimulador en comparación con las células tratadas con la muestra de LCR del paciente. Se midieron las diferencias en la intensidad de fluorescencia y se compararon las curvas de estimulación mediadas por NMDA a partir de los datos extraídos del soma de las células (Figura 4B, C). Las curvas de estimulación muestran que hubo una afluencia intracelular de calcio en ambos escenarios, pero los cultivos tratados con LCR (línea gris) de los pacientes mostraron una respuesta menor que los cultivos tratados con control (línea negra). Estos resultados demuestran que los anticuerpos presentes en el LCR de los pacientes disminuyen la actividad celular debido a la interacción de los anticuerpos con el NMDAR, y por lo tanto causan un efecto patogénico.

Figura 3: Los anticuerpos del paciente reaccionan con la superficie de los cultivos neuronales. (A,E) El suero y el LCR de pacientes con encefalitis anti-NMDAR reaccionan con la superficie celular de las neuronas vivas del hipocampo de rata, (B,F), mientras que el suero y el LCR de los sujetos control no muestran reactividad. Barra de escala (A,B,E,F) = 20 μm. Imagen de mayor aumento de una dendrita (63x) que muestra el patrón superficial típico de reactividad para (C, G) el suero del paciente y el LCR y (D, H) negativo para los controles. Las imágenes fueron tomadas por microscopía de barrido láser confocal. Barra de escala = 10 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Los anticuerpos de los pacientes reducen la afluencia de calcio en las neuronas de rata que expresan GCaMP5G. (A) La administración de solución de estimulación (NMDA [100 μM] + glicina [1 μM]) en cultivos de neuronas desencadenó una afluencia de calcio, como lo indica el aumento de la fluorescencia verde intracelular (pico de estimulación), en comparación con la imagen tomada antes de la estimulación (preestimulación). Después de 120 s, la intensidad de la fluorescencia disminuye y se estabiliza (post-estimulación). Los cultivos tratados con LCR de los pacientes mostraron una reducción significativa (56%) en el aumento de calcio mediado por NMDA en comparación con el LCR del control. Las imágenes fueron tomadas por microscopía de fluorescencia. Barra de escala = 20 μm. (B) Un gráfico de uno de los tres experimentos independientes que representan la intensidad de fluorescencia a lo largo del tiempo (180 s) para los cultivos tratados con LCR (línea negra) de control y LCR (línea gris) de los pacientes tras la estimulación NMDA (flecha azul). n(LCR de los controles) = 20 células; n (LCR de los pacientes) = 28 células. Los datos se representan como media ± SEM. (C) Los diagramas de caja muestran la mediana, los percentiles 25 y 75. Los bigotes indican los valores mínimo y máximo. La evaluación de la significancia se realizó mediante análisis bidireccional de varianza (ANOVA; p < 0,0001) y pruebas U de Mann-Whitney (p < 0,0001). Un valor de p < 0,05 fue considerado estadísticamente significativo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Video suplementario 1: Video que muestra dos neuronas del hipocampo que expresan GCaMP5G una al lado de la otra: neurona tratada con LCR de control (izquierda) vs. neurona tratada con LCR de pacientes (derecha). La aplicación de NMDAR (estimulación) genera un aumento de la intensidad de fluorescencia intracelular en ambos casos, pero con un nivel significativamente mayor en la neurona tratada con el LCR del control sobre el tratado con el LCR de los pacientes. Las imágenes fueron tomadas por microscopía de fluorescencia y editadas con ImageJ aplicando la tabla de búsqueda (LUT) Fire. 1700 cuadros (170 s); acelerado 5 veces. Barra de escala = 10 μm. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

El creciente campo de la autoinmunidad mediada por anticuerpos ha abierto una ventana de oportunidad para la identificación de autoanticuerpos neuronales que pueden utilizarse para mejorar el diagnóstico y el tratamiento de los pacientes. Los cultivos de neuronas del hipocampo son una herramienta esencial para la identificación de anticuerpos; Por lo tanto, es importante realizar un protocolo estandarizado para obtener resultados confiables y reproducibles. Los pasos más importantes a considerar, las limitaciones y la solución de problemas se discuten aquí.

Los pasos críticos de este protocolo se pueden agrupar en tres categorías dependiendo de si afectan la pureza, la homogeneidad o la viabilidad de las neuronas del hipocampo.

Pureza: para obtener cultivos celulares primarios óptimos, el investigador debe tener confianza, capacitación y capacidad para trabajar rápidamente, especialmente para minimizar el tiempo de la disección. Incluso si las neuronas piramidales son el tipo celular principal, el hipocampo contiene una variedad de interneuronas¹⁴. Para generar cultivos con células gliales mínimas, el hipocampo debe extraerse con el mínimo tejido circundante. El uso de un fondo negro durante la disección ayuda a identificar los límites del hipocampo bajo el microscopio estereoscópico. Además, debe tenerse en cuenta que las densidades celulares más bajas resultan en un menor soporte paracrino y dificultan el mantenimiento del cultivo¹³. Por lo tanto, es importante tener en cuenta este equilibrio. Esto es importante en estudios de imagen que utilizan un número bajo de células (50.000 neuronas por plato de 3,5 cm). Para poder tener tiempo adicional para la extracción del hipocampo, se deben utilizar medios de hibernación que preserven el tejido¹⁷. Trabajar con herramientas quirúrgicas adecuadas también es esencial. Las herramientas de alta precisión son delicadas, por lo que la reproducibilidad de la técnica debe garantizarse protegiéndolas cuidadosamente.

Homogeneidad - Para desarrollar un cultivo sin agregados celulares, la disociación celular mecánica se ha mejorado combinando el uso de pipetas de vidrio pre-tiradas con una pipeta estándar de 1.000 μL.

Viabilidad - En este protocolo, no se agregaron antibióticos porque influyen en la excitabilidad neuronal y alteran las propiedades electrofisiológicas de las neuronas cultivadas¹⁸. Por lo tanto, la contaminación es muy probable si no se mantienen los más altos estándares de esterilidad. La temperatura también es un factor clave. Mantener el tejido frío durante el aislamiento del hipocampo ralentiza el metabolismo y disminuye la degradación celular. Por lo tanto, el tejido se mantuvo en hielo hasta el proceso de disociación celular. Además, es crucial encontrar el equilibrio correcto durante la disociación celular enzimática que desagrega las células sin una marcada lisis celular. En este protocolo, se han optimizado los tiempos de incubación con tripsina y los pasos de lavado posteriores para obtener células individuales con suficiente espacio para permitir la creación de una red neuronal adecuada.

También se encuentran pasos críticos en la inmunotinción fluorescente en vivo y en los registros de actividad de calcio de los cultivos neuronales. Para realizar con éxito la inmunotinción viva para determinar la presencia de anticuerpos contra las proteínas de la superficie celular en muestras de pacientes, se debe evitar la permeabilización de las células que permitirían el acceso de los anticuerpos a las proteínas intracelulares. Además, en función del título de los anticuerpos, el tiempo de incubación y la dilución de la muestra deben ajustarse en consecuencia (por ejemplo, los anticuerpos de título muy alto pueden dar una tinción de fondo que dificulta la interpretación de los resultados). Al llevar a cabo la evaluación de patogenicidad de los autoanticuerpos con imágenes de calcio, es necesario utilizar un medio que sea óptimo para las mediciones de la actividad celular (por ejemplo, la supresión de Mg²⁺ en el medio de cultivo es importante para un buen rendimiento). Además, para las imágenes de fluorescencia, se deben evitar los medios con indicadores de pH como el rojo fenol, ya que introducen una señal de fondo no específica.

Hay dos limitaciones principales del uso de cultivos neuronales del hipocampo. En primer lugar, en comparación con las líneas celulares estables, los cultivos primarios deben generarse continuamente, y esto implica el uso regular de animales de laboratorio. Las líneas de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) podrían reemplazar la necesidad de usar modelos animales, pero los protocolos de diferenciación para iPSC aún no son óptimos. En segundo lugar, las neuronas derivadas de iPSC no expresan los espectros completos de las proteínas de superficie y, por lo tanto, si se utilizan, la ausencia de reactividad no implica necesariamente la negatividad de la muestra¹⁹.

Existen tres métodos para detectar la presencia de autoanticuerpos en el suero o LCR de pacientes sospechosos de tener EA: ensayo basado en tejidos (TBA) utilizando tejido cerebral de rata, ensayo basado en células (CBA) utilizando células HEK transfectadas para expresar proteínas neuronales, y la aplicación reportada aquí usando cultivos vivos de neuronas del hipocampo¹⁹. La importancia del método de la neurona del hipocampo cultivada radica en su capacidad para diferenciar la reactividad con antígenos de superficie e intracelulares que no pueden distinguirse fácilmente por TBA. Además, los cultivos neuronales primarios, a diferencia del CBA en las células transfectadas con HEK, no están limitados por el repertorio de proteínas transfectadas. Además, las neuronas cultivadas del hipocampo se pueden utilizar para identificar nuevos anticuerpos y sus antígenos diana cuando se combinan con inmunoprecipitación y espectrometría de masas y, por lo tanto, ampliar el espectro de anticuerpos identificables. Por último, permite la evaluación de los efectos patogénicos de los autoanticuerpos mediante métodos de imagen en vivo que pueden monitorizar alteraciones en la actividad celular. En conclusión, la identificación de nuevos autoanticuerpos eventualmente permite el inicio de inmunoterapias específicas para mejorar los resultados de los pacientes.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm Cell culture dish	Nunc	12-565-020
12 mm round coverslips	Fisher	NC9708845
20x NA 0.75 S Fluor air objective	Nikon	CFI Super Fluor 20X
3.5 cm Cell culture dish	Nunc	12-565-90
6 cm Cell culture dish	Nunc	12-565-94
B27 supplement	Gibco	17504-044
Beaker 100 mL	Pirex	-
Borax	Sigma-Aldrich	B9876
Boric Acid	Sigma-Aldrich	B0252
CaCl2	Sigma-Aldrich	C1016
Curved forceps	FST	11009-13
D-Glucose	Sigma-Aldrich	D9434
DMEM High Glucose (4.5 g/L), without L-Glutamine, without Phenol Red	Capricorn	DMEM-HXRXA
Female Wistar rat (18-days pregnant)	Janvier	-
Fetal Bovine Serum (FBS)	Biowest	S181B-500
Fine-angled forceps	FST	11251-35
Fine-curved forceps	FST	11272-30
Fine-straight forceps	FST	11251-23
FITC filter cube	Nikon	Standard Series
Forceps	FST	11000-12
Goat anti-Human AF488	Invitrogen	A11013
HBSS	Capricorn	HBSS-1A
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Hibernate-E medium	Gibco	A12476-01
Horse Serum (HS)	Thermofisher	26050088
Human anti-NMDAR antibody (CSF)	Patient Sample	-
Human anti-NMDAR antibody (Serum)	Patient Sample	-
ImageJ/Fiji	NIH	v1.50i
Inverted fluorescence microscope	Nikon	Eclipse TE2000-U
KCl	Sigma-Aldrich	44675
L-Glutamine	Biowest	X0550-100
Mercury lamp	Nikon	C-HGFI
Microscope cell chamber	Custom-build	-
NaCl	Sigma-Aldrich	S9887
NBQX	Tocris	373
Neurobasal without phenol red	Gibco	12348-017
NMDA	Sigma-Aldrich	M3262
pAAV2-CAG-GCaMP5G	VectorBiolabs	-
Paraformaldehyde 4%	Thermo scientific	J199943-K2
Penicillin-Streptomycin	Biowest	L0022-100
Phosphate-Buffered Saline	Gibco	10010023
Poly-L-Lysine (PLL)	Peptide international	OKK-35056
Polystyrene ice tray	-	-	re-used cap of a polysterene box
Precision spring-scissors	FST	15000-08
ProLong Gold with DAPI (antifading mounting media)	Molecular Probes	P36941
Scissors	FST	14068-12
Sodium pyruvate	Biowest	L0642-100
Stereo microscope	Zeiss	Stemi 2000
Surgery scissors	FST	14081-09
Trypsin 2.5%	Gibco	15090046
Water, sterile endotoxine free	Sigma-Aldrich	W3500