Inducción y diversos indicadores de evaluación de la encefalomielitis autoinmune experimental

Resumen

El presente protocolo describe la inducción de encefalomielitis autoinmune experimental en un modelo de ratón utilizando glicoproteína oligodendrocitos de mielina y monitoreando el proceso de la enfermedad utilizando un sistema de puntuación clínica. Los síntomas experimentales relacionados con la encefalomielitis autoinmune se analizan mediante análisis de tomografía microcomputarizada de fémur de ratón y prueba de campo abierto para evaluar el proceso de la enfermedad de manera integral.

Resumen

La esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad autoinmune típica del sistema nervioso central (SNC) caracterizada por infiltración inflamatoria, desmielinización y daño axonal. Actualmente, no existen medidas para curar la EM por completo, pero hay múltiples terapias modificadoras de la enfermedad (DMT) disponibles para controlar y mitigar la progresión de la enfermedad. Existen similitudes significativas entre las características patológicas del SNC de la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) y los pacientes con EM. EAE se ha utilizado ampliamente como modelo representativo para determinar la eficacia de los fármacos para la EM y explorar el desarrollo de nuevas terapias para la enfermedad de la EM. La inducción activa de EAE en ratones tiene un efecto estable y reproducible y es particularmente adecuada para estudiar los efectos de fármacos o genes sobre la neuroinflamación autoinmune. El método de inmunización de ratones C57BL / 6J con glicoproteína oligodendrocitos de mielina (MOG_35-55) y la evaluación diaria de los síntomas de la enfermedad utilizando un sistema de puntuación clínica se comparte principalmente. Dada la compleja etiología de la EM con diversas manifestaciones clínicas, el sistema de puntuación clínica existente no puede satisfacer la evaluación del tratamiento de la enfermedad. Para evitar las deficiencias de una sola intervención, se crean nuevos indicadores para evaluar la EAE basados en las manifestaciones clínicas de estados de ánimo similares a la ansiedad y la osteoporosis en pacientes con EM para proporcionar una evaluación más completa del tratamiento de la EM.

Introducción

Las enfermedades autoinmunes son un espectro de trastornos causados por la respuesta inmune del sistema inmune a sus propios antígenos que resultan en daño o disfunción tisular¹. La esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad autoinmune crónica de polineuropatía en el sistema nervioso central (SNC), caracterizada por infiltración inflamatoria, desmielinización y degeneración axonal neuronal ^2,3. En la actualidad, la EM ha afectado a hasta 2,5 millones de personas en todo el mundo, en su mayoría jóvenes y de mediana edad de entre 20 y 40 años, que a menudo son la columna vertebral de sus familias y de la sociedad. Esto ha causado un impacto y daño considerable a las familias y a la sociedad ^2,4.

La EM es una enfermedad multifactorial con manifestaciones clínicas diversas y complejas. Además de los trastornos neurológicos clásicos caracterizados por infiltración inflamatoria y desmielinización, la EM a menudo muestra discapacidad visual, discinesia de las extremidades y trastornos cognitivos y emocionales ^5,6,7. Si los pacientes con EM no reciben el tratamiento adecuado y correcto, la mitad de ellos vivirá en sillas de ruedas después de 20 años, y casi la mitad de ellos experimentará síntomas depresivos y de ansiedad, lo que llevará a niveles mucho más altos de ideación suicida que la población general ^8,9.

A pesar de un largo período de investigación, la etiología de la EM sigue siendo difícil de alcanzar, y la patogénesis de la EM aún no se ha dilucidado. Los modelos animales de EM han permitido servir como herramientas de prueba para explorar el desarrollo de enfermedades y nuevos enfoques terapéuticos, a pesar de las diferencias significativas entre los sistemas inmunológico roedor y humano, mientras que al mismo tiempo comparten algunos principios básicos. La encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) es actualmente el modelo animal ideal para estudiar la EM, que utiliza la inmunidad a los autoantígenos de las proteínas de mielina para inducir la autoinmunidad a los componentes del SNC en ratones susceptibles, con la adición de adyuvante completo de Freund (CFA) y toxina pertussis (PTX) para mejorar la respuesta inmune humoral. Dependiendo de los antecedentes genéticos y los antígenos inmunes, se obtienen diferentes procesos de la enfermedad, incluidos los agudos, recurrentes-remitentes o crónicos, para imitar varias formas clínicas de EM^10,11,12. Los inmunógenos relevantes comúnmente utilizados en la construcción de modelos EAE provienen de proteínas auto-SNC, como la proteína básica de mielina (MBP), la proteína proteolípida (PLP) o la glicoproteína oligodendrocitos de mielina (MOG). Los ratones SJL/L inmunizados con MBP o PLP desarrollan un curso recurrente-remitente, y MOG desencadena EAE progresiva crónica en ratones C57BL / 6^11,12,13.

El objetivo principal de la terapia modificadora de la enfermedad (DMT) es minimizar los síntomas de la enfermedad y mejorar la función⁶. Varios medicamentos se usan clínicamente para aliviar la EM, pero aún no se ha utilizado ningún medicamento para curarla por completo, lo que revela la necesidad de un tratamiento sinérgico. Los ratones C57BL/6 son actualmente los más utilizados para construir ratones transgénicos, y en este trabajo se utilizó un modelo EAE inducido por MOG_35-55 en ratones C57BL/6J con una escala de 5 puntos para monitorizar la progresión de la enfermedad. Los modelos EAE también sufren de estados de ánimo similares a la ansiedad y pérdida ósea, y las lesiones desmielinizantes ampliamente conocidas. Aquí también se describe el método para evaluar los síntomas de EAE desde múltiples perspectivas mediante prueba de campo abierto y análisis de microtomografía computarizada (Micro-CT).

Protocolo

El Comité de Cuidado de Animales de la Universidad de Tongji aprobó el presente trabajo y se siguieron todas las pautas de cuidado de los animales. Se utilizaron ratones machos o hembras C57BL / 6J entre 8-12 semanas de edad para los experimentos. Se aseguró que la edad y el sexo fueran los mismos en los grupos experimentales; de lo contrario, la susceptibilidad a la enfermedad se vio afectada. Los ratones fueron alojados en un ambiente específico libre de patógenos con ciclos alternos de luz y oscuridad de 12 h en condiciones constantes (temperatura ambiente 23 ± 1 ° C, humedad 50% ± 10%), con libre acceso a comida y agua para ratones.

1. Preparación de la emulsión MOG_35-55

1. Agregue Mycobacterium tuberculosis liofilizada inactivada por calor (MTB, H37Ra) para completar el adyuvante de Freund (que contiene 1 mg / ml de MTB inactivado por calor, H37Ra), lo que resulta en una concentración final de MTB de 5 mg / ml (ver Tabla de materiales).
   NOTA: Toda la operación debe completarse en el gabinete de bioseguridad; No abra el aire que sopla.
2. Disuelva el péptido liofilizado MOG_35-55 (ver Tabla de materiales) con solución salina tamponada con fosfato (PBS) estéril preenfriada (sin iones de calcio y magnesio, pH 7.4) para preparar la solución de antígeno a la concentración de 2 mg / ml.
3. Tome un tubo de microcentrífuga limpio de 2 ml y agregue una bola de acero esterilizada de 5 mm (consulte la Tabla de materiales) a cada tubo.
4. Añadir 500 μL de adyuvante completo de Freund que contenga 5 mg/ml de MTB y 500 μL de solución de antígeno MOG_35-55 al tubo de microcentrífuga anterior que contenga una bola de acero.
5. Oscile el tubo anterior en un TissueLyser (consulte la Tabla de materiales) durante 10 minutos, enfríe en hielo durante 10 minutos y repita cuatro veces para mezclarlo bien y finalmente formar una solución viscosa blanca.
   NOTA: Una buena emulsificación es un paso clave en la preparación de la emulsión MOG_35-55 , por lo que se requiere una mezcla completa. El TissueLyser está ajustado a una velocidad de 28 Hz.

2. Preparación de la toxina de la tos ferina (PTX)

1. Preparar PTX con_ddH2Oen una concentración de 100 μg/ml y almacenar a 4 °C.
2. Diluir la solución madre de PTX 50 veces con 1x PBS estéril (sin iones de calcio y magnesio, pH 7,4) para obtener una solución de 200 ng/100 μL para su uso.

3. Establecimiento del modelo animal EAE

1. Construir el modelo EAE utilizando ratones machos o hembras C57BL/6J machos o hembras de 8-12 semanas de edad. Asegúrese de que los ratones estén adecuadamente aclimatados al entorno de alimentación antes de la inmunización.
2. Centrifugar la emulsión MOG_35-55 preparada (paso 1) a 4 °C durante 2-3 s pulsando el botón de pulso del equipo (ver Tabla de materiales) para precipitar todas las emulsiones en el fondo del tubo.
   NOTA: La emulsión MOG_35-55 se puede almacenar a -20 °C durante varios días. Para evitar el fracaso del medicamento, se recomienda usarlo lo antes posible.
3. Conecte una aguja de 22 G al cilindro de una jeringa de 1 ml, aspire la emulsión MOG 35-55 y transfiera la emulsión MOG_35-55 a un nuevo cilindro de jeringa de 1 ml. Asegure la conexión entre el cilindro de la jeringa de 1 ml y una aguja de 26 G con película de sellado (consulte la Tabla de materiales).
   NOTA: Evite las burbujas de aire al cargar la emulsión MOG_35-55 en barriles de jeringa de 1 ml.
4. Limpie y desinfecte el lugar de inyección con etanol al 70%.
5. Inyecte la emulsión MOG_35-55 por vía subcutánea a cada lado de la columna dorsal de los ratones, 100 μL en cada lado. Observe la formación automática de masas bulbosas debajo de la piel del dorso de los ratones después de que se complete la operación de inyección.
   NOTA: Asegúrese de que los experimentadores experimentados realicen el proceso de inmunización y que la inyección se realice suave y lentamente para minimizar la presión sobre los ratones.
6. Inyecte los ratones anteriores por vía intraperitoneal con 100 μL de PTX (paso 2).
   NOTA: El día de la inmunización es el día 0. Además, asegúrese de que los ratones puedan identificarse con precisión para una evaluación diaria posterior, como el uso de un marcador de color en la cola de los ratones.
7. Inyecte la misma dosis de PTX el día 2 después de la inmunización.
8. Prepare un grupo de ratones no inmunizados como ratones de tipo salvaje (WT).

4. Monitorización clínica de ratones

1. Registre diariamente el peso corporal de los ratones EAE y WT.
   NOTA: La gravedad de EAE se correlaciona positivamente con la pérdida de peso de los ratones, por lo que el peso corporal también es un índice de monitorización muy importante.
2. Monitorear el estado de los ratones de 0 a 21 días después de la inmunización utilizando el sistema de puntuación de 0 a 5 que figura en la Tabla 1.
   NOTA: Los síntomas intermedios se cuentan como más o menos 0.5 puntos.

5. Prueba de campo abierto

NOTA: Los animales experimentales seleccionados para este paso son ratones EAE en los períodos de inicio temprano, pico y remisión. Además, se utilizaron ratones WT como control. Cabe señalar que todos los ratones fueron probados para el comportamiento similar a la ansiedad antes del modelado para excluir a los ratones con trastornos de ansiedad para el modelado EAE. Además, los ratones EAE en períodos pico y de remisión con incapacidad motora completa fueron excluidos de la prueba.

1. Prepare una cámara de reacción de campo abierto de 40 × 40 × 40^cm3 y un sistema de análisis de video de actividad de locomoción (campo abierto) (ver Tabla de materiales).
   NOTA: La cámara está instalada en una posición que cubre completamente la caja, la sala de reacción está iluminada uniformemente y se requiere que la sala de pruebas sea un área silenciosa.
2. Coloque los ratones de prueba en la sala de prueba para la habituación 1 h antes de comenzar el experimento.
3. Rocíe toda el área con etanol al 70% y limpie con una toalla de papel limpia para asegurarse de que la cámara de reacción esté limpia antes de comenzar la prueba.
4. Retire cada ratón individualmente de su jaula y colóquelo en la misma esquina de la arena antes de comenzar a explorar.
   NOTA: La parte inferior de la caja se divide en 16 cuadrículas, de las cuales el área de las cuatro cuadrículas centrales es el área central y el área circundante es el área periférica.
5. Haga clic en el botón Iniciar captura en la barra de menú del sistema de análisis de video, grabe el tiempo y comience a disparar.
6. Manténgase en silencio en la sala de pruebas.
7. Deje que el ratón se mueva libremente durante 5 minutos durante el proceso de grabación.
8. Detenga el sistema de adquisición y guarde el video.
9. Saque el ratón de la arena, vuelva a colocarlo en la jaula y proceda al siguiente ratón.
   NOTA: Limpie el área de prueba con etanol al 70% entre series para eliminar olores y otras sustancias.
10. Analice los resultados utilizando el sistema de análisis de video.

6. Análisis del fenotipo óseo

1. Eutanasia de los ratones EAE y WT por luxación cervical en el día 21.
   NOTA: El personal que realiza operaciones de luxación cervical debe estar bien capacitado para minimizar el dolor soportado durante la muerte del animal.
2. Haga que el ratón se acueste en una bandeja de disección y fije las extremidades.
3. Sostenga la piel de la extremidad posterior del ratón con fórceps y abra la piel del ratón y el tejido muscular con tijeras.
4. Separe el fémur de la tibia y el hueso de la cadera cuidadosamente con tijeras.
5. Retire el músculo adherido al fémur con tijeras y coloque el fémur en etanol al 70% a temperatura ambiente.
6. Escanear el fémur distal utilizando un sistema de micro-TC (ver Tabla de materiales) con un tamaño de vóxel isotrópico de 10 μm, con un voltaje máximo del tubo de rayos X de 70 kV y una intensidad de rayos X de 0.114 mA.
   NOTA: Un filtro gaussiano 3D permite eliminar ruido de imágenes de umbral 2D.
7. Analice los 100 cortes escaneados del eje femoral medio para medir los parámetros del fémur, incluido el volumen óseo, el volumen del tejido, la densidad mineral ósea, la separación trabecular, el número trabecular, la densidad de conexión trabecular y el grosor trabecular y cortical.
   NOTA: A partir del extremo proximal de la placa de crecimiento del fémur distal en ratones, se encontraron secciones completamente desprovistas de estructuras de tapa epifisaria y continuaron extendiéndose 100 cortes hacia el fémur proximal, que fueron contornos delineados manualmente en varios vóxeles lejos de la superficie cortical interna para identificar las trabéculas epifisarias.
8. Cree las reconstrucciones 3D apilando imágenes 2D de umbral de regiones de contorno en el sistema micro-CT.

Resultados

Después de la inmunización de los ratones, el peso corporal de los ratones se registra diariamente y sus síntomas clínicos se evalúan de acuerdo con el protocolo descrito anteriormente (paso 4). En ratones C57BL / 6J inmunizados con péptido MOG, debido a que la ubicación de la lesión se limita principalmente a la médula espinal, la patogénesis de los ratones EAE se propaga desde el extremo de la cola hasta la cabeza. Al comienzo de la enfermedad, los ratones EAE presentan debilidad y caída de la cola, seguidas...

Discusión

El SM es una enfermedad inflamatoria desmielinizante del SNC y es uno de los trastornos neurológicos más comunes que causan discapacidad crónica en los jóvenes, imponiendo una gran carga a las familias y a la sociedad ^3,4. La EM siempre ha sido clasificada como una enfermedad autoinmune mediada por células T específicas de órganos, induciendo al sistema autoinmune a erosionar lentamente el SNC, lo que involucrará múltiples sistemas en todo el cuerpo

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringe(with 26 G needle)	Shanghai Kindly Medical Instruments Co., Ltd	60017031
2 mL microcentrifuge tube	HAIKELASI	KY-LXG2A
22 G needle	Shanghai Kindly Medical Instruments Co., Ltd	60017208
Complete Freund’s Adjuvant	Sigma	F5881	Stored at 4 °C, 1 mg of heat-inactivated MTB (H37Ra) per mL
Conditioned place preference system	Shanghai Jiliang Software Technology Co., Ltd		Animal behavior
Ethanol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10009218	Stored at RT
Locomotion activity (open field) video analysis system	Shanghai Jiliang Software Technology Co., Ltd	DigBehv-002	Animal behavior
MOG35-55 peptide	Gill Biochemical Co., Ltd	GLS-Y-M-03590	Stored at -20 °C
Mycobacterium tuberculosis H37Ra	BD	231141	Stored at 4 °C
Open field reaction chamber	Shanghai Jiliang Software Technology Co., Ltd		Animal behavior
Pertussis toxin	Calbiochem	516560	Stored at 4 °C
Phosphate Buffered Saline			Made in our laboratory
Scissor	Shanghai Medical Instrument (group) Co., Ltd	J21010
Sealing film	Heathrow Scientific	HS 234526B
Sorvall Legend Micro 21R Microcentrifuge	Thermo Scientific	75002447
Steel ball	QIAGEN	69975
TissueLyser II	QIAGEN	85300
Tweezer	Shanghai Medical Instrument (group) Co., Ltd	JD1060
μCT 35 desktop microCT scanner	Scanco Medical AG, Bassersdorf, Switzerland