Medición in vivo resuelta en el tiempo de la dinámica de neuropéptidos mediante inmunosonda capacitiva en corazón porcino

Resumen

Los métodos inmunoquímicos establecidos para medir los transmisores de péptidos in vivo se basan en la microdiálisis o la extracción de líquido a granel para obtener la muestra para su análisis fuera de línea. Sin embargo, estos sufren de limitaciones espaciotemporales. El presente protocolo describe la fabricación y aplicación de un biosensor de inmunosonda capacitiva que supera las limitaciones de las técnicas existentes.

Resumen

La capacidad de medir biomarcadores in vivo relevantes para la evaluación de la progresión de la enfermedad es de gran interés para las comunidades científica y médica. La resolución de los resultados obtenidos de los métodos actuales de medición de ciertos biomarcadores puede tardar varios días o semanas en obtenerse, ya que pueden tener una resolución limitada tanto espacial como temporalmente (por ejemplo, microdiálisis del compartimento fluido del líquido analizado por ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas [ELISA], cromatografía líquida de alto rendimiento [HPLC] o espectrometría de masas); por lo tanto, su orientación de diagnóstico y tratamiento oportunos se interrumpe. En el presente estudio, se informa de una técnica única para detectar y medir transmisores de péptidos in vivo mediante el uso de un biosensor de inmunosonda capacitiva (sonda IC). Se describe el protocolo de fabricación y caracterización in vitro de estas sondas. Se proporcionan mediciones de la liberación in vivo del neuropéptido Y (NPY) evocado por estimulación simpática. La liberación de NPY se correlaciona con la liberación simpática de norepinefrina como referencia. Los datos demuestran un enfoque para la medición rápida y localizada de neuropéptidos in vivo. Las aplicaciones futuras incluyen la evaluación intraoperatoria en tiempo real de la progresión de la enfermedad y el despliegue mínimamente invasivo de estas sondas basadas en catéteres.

Introducción

Varios métodos químicos para detectar y cuantificar biomarcadores se utilizan rutinariamente tanto en la química de proteínas como en el diagnóstico clínico, particularmente en diagnósticos de cáncer y la evaluación de la progresión de la enfermedad cardiovascular. Actualmente, métodos como la cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), el ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) y la espectrometría de masas se basan en la recolección de muestras del compartimento vascular ^1,2,3 por extracción de líquido a granel o del compartimento intersticial por microdiálisis. La microdiálisis emplea un tubo de membrana semipermeable de longitud conocida que se coloca en una región de interés. El líquido de recolección se perfunde a través del tubo durante varios minutos⁴ para recoger la muestra para el análisis⁵, limitando así la resolución temporal. De esta manera, las muestras recolectadas solo proporcionan un valor promedio a lo largo del tiempo del microambiente local y están limitadas por la tasa de perfusión y la recolección de suficiente volumen de muestra. Además, estos métodos requieren la puesta en común de datos experimentales y el promedio de señales; por lo tanto, pueden no tener en cuenta la variabilidad entre los sujetos. Es importante destacar que el tiempo entre la recolección de muestras y el posterior análisis fuera de línea impide la intervención clínica y terapéutica inmediata.

En el presente protocolo, se describe el uso de un biosensor de inmunosonda capacitiva (sonda CI) para la detección eléctrica resuelta en el tiempo de péptidos bioactivos específicos. El neuropéptido Y (NPY), liberado de las neuronas simpáticas post-ganglionares que inervan la vasculatura, el endocardio, los cardiomiocitos y los ganglios intracardíacos, es un importante transmisor peptídico neuromodulador en el sistema cardiovascular 6,7,8,9. El método presentado aquí está diseñado para medir NPY, y la viabilidad experimental se demuestra en un modelo de corazón porcino. Sin embargo, este enfoque se aplica a cualquier péptido bioactivo para el que se disponga de un anticuerpo selectivo¹⁰. Este método se basa en la unión capacitiva entre una sonda de alambre de platino y el fluido conductor en la punta funcionalizada^11,12. En esta aplicación, la interacción fue mediada a través de un anticuerpo contra el neuropéptido objetivo (NPY), que se unió a la punta del electrodo, interactuando con el ambiente del fluido conductor. Esta funcionalización se logró mediante electrodeposición de polidopamina reactiva en la punta de la sonda de alambre de platino^10,13.

Cuando la sonda funcionalizada con anticuerpos se coloca en una región de interés in vivo, la liberación endógena evocada de NPY conduce a la unión a los anticuerpos de captura en la punta de la sonda, y el fluido conductor en la superficie del electrodo es desplazado por la proteína NPY. La alteración local en el entorno eléctrico resulta en el desplazamiento de fluido de alta movilidad y alta dieléctrico con una molécula inmóvil y cargada estáticamente. Esto altera la interfaz electrodo-fluido y, por lo tanto, su capacitancia, que se mide como un cambio en la corriente de carga en respuesta a un potencial de comando de función de paso. Se emplea un potencial de "reinicio" negativo inmediatamente después de cada ciclo de medición individual para repeler el NPY unido del anticuerpo a través de la interacción electrostática, despejando así los sitios de unión de anticuerpos para rondas posteriores de medición¹⁰. Esto permite efectivamente la medición de NPY de una manera resuelta en el tiempo. La técnica única de IC supera las limitaciones de los métodos inmunoquímicos basados en microdiálisis descritos anteriormente para medir los niveles de biomarcadores dinámicos de un solo experimento sin agrupación de datos o promedio de señales en varios experimentos⁹, proporcionando datos casi en tiempo real. Además, la capacidad de adaptar este método a cualquier biomarcador de interés para el que exista un anticuerpo apropiado en una escala resuelta y localizada proporciona un gran avance técnico en la medición inmunoquímica para la evaluación de la progresión de la enfermedad y la orientación de intervenciones terapéuticas.

El software para la adquisición y el análisis de datos fue escrito a medida en IGOR Pro (un entorno de software totalmente interactivo). Un sistema de convertidor analógico a digital (A / D) emitió un voltaje de comando bajo control de computadora y adquirió datos de un amplificador personalizado. El amplificador poseía ciertas características únicas. Estos incluían una resistencia de retroalimentación (conmutable) para cada uno de los cuatro canales de adquisición, lo que permitía elegir circuitos de abrazadera de voltaje de retroalimentación de 1 MOhm o 10 MOhm para integrar la variabilidad del electrodo. También se construyó una unidad de etapa con un solo cabezal y un circuito mutuo de tierra / referencia para los cuatro canales de adquisición para colocar el dispositivo cerca del cofre en un solo módulo físico. Se utilizó una configuración de resistencia de retroalimentación de 1 MOhm para recopilar todos los datos informados.

Los ajustes de filtro y ganancia se telegrafiaron desde el amplificador y se registraron dentro del archivo de datos. Los datos se filtraron a 1 kHz a través de un filtro Bessel analógico de 2 polos digitalizado a 10 kHz. La diferencia de potencial entre la sonda y la solución conductora circundante crea una capa capacitiva de Helmholtz en la punta de la sonda. La unión del ligando al anticuerpo en la punta de la sonda da como resultado una carga local alterada y, por lo tanto, un cambio en la capacitancia de Helmholtz. Este cambio en el componente capacitivo del circuito da como resultado un cambio en la magnitud de la carga inyectada requerida para llevar la sonda al potencial en el protocolo de voltaje de función paso a paso. Por lo tanto, la unión de un ligando específico a la sonda funcionalizada resulta en una alteración en la medición de la capacitancia del electrodo como un cambio en la corriente capacitiva máxima.

Protocolo

Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Investigación Animal de la Universidad de California, Los Ángeles y se realizaron siguiendo las pautas establecidas por la Guía de los Institutos Nacionales de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (8ª edición, 2011). Se utilizaron cerdos Yorkshire machos adultos de aproximadamente 75 kg para estudios in vivo ¹⁰.

1. Fabricación y funcionalización de inmunosondas capacitivas

1. Corte una longitud de 25 cm de alambre de platino recubierto de perfluoroalcoxi (PFA) (consulte la Tabla de materiales) y retire aproximadamente 5 mm de recubrimiento de PFA de un extremo con un bisturí, teniendo cuidado de no cortar el alambre de platino.
2. Inserte el extremo pelado del cable de platino en un pasador de conector macho de 1 mm chapado en oro y engarce los dientes del pasador del conector alrededor del extremo pelado del cable de platino con alicates de nariz de aguja (consulte la Tabla de materiales).
3. Suelde el cable de platino al pin del conector chapado en oro. Tenga cuidado de no usar una cantidad excesiva de soldadura.
4. Prepare la solución de dopamina disolviendo 50 mg de dopamina HCl en 50 ml de solución salina tamponada con fosfato de 10 mM (PBS, pH 6.0) agitando.
5. Una vez que la dopamina esté completamente disuelta, coloque la punta del alambre de platino en el recipiente que contiene el PBS recién hecho suplementado con dopamina. Conecte un pin de conector dorado en un canal del cabezal (consulte la Tabla de materiales).
6. Conecte el electrodo de disco AgCl (electrodo de tierra, consulte la Tabla de materiales) al canal de tierra en el escenario principal. Coloque el disco AgCl en el recipiente que contiene PBS suplementado con dopamina y alambre de platino; tenga cuidado solo de sumergir el electrodo de disco y no cualquier longitud del cable o soldadura. Conecte una derivación de cable en los canales de referencia del estadio antes de continuar.
7. Abra el software interactivo de adquisición de datos (consulte la Tabla de materiales). Preparar un protocolo de potencial de comando de electrodeposición de diente de sierra con los siguientes parámetros: potencial de inicio = −0.6 V; potencial final = +0,65 V; velocidad de escaneo = 0.04 V∙^s-1; duración de la deposición = 420 s. Comience el protocolo de deposición de polidopamina, asegurándose de que todos los cables estén conectados correctamente.
8. Después de completar la deposición de polidopamina, retire el pellet de tierra AgCl y la punta del cable de platino del recipiente, teniendo cuidado de no molestar la punta del electrodo de alambre de platino. Coloque la punta del cable en un microtubo que contenga PBS (pH 7.4) durante 2-5 minutos mientras se prepara la solución de anticuerpos; asegúrese de que la punta del cable no entre en contacto con los lados o la parte inferior del microtubo.
   NOTA: La solución de anticuerpos se puede hacer durante la deposición de polidopamina; sin embargo, no se debe omitir la transferencia del alambre de platino desde el vaso que contiene dopamina al microtubo de PBS después de la deposición de polidopamina.
9. Prepare la solución de anticuerpos. Combine el anticuerpo de interés con PBS (pH 7.4) en una proporción de 1:20 en un recipiente de un tamaño apropiado (por ejemplo, un microtubo).
   NOTA: El anticuerpo monoclonal anti-NPY (ver Tabla de Materiales) utilizado aquí fue aludido a 1 mg/ml; un ejemplo de preparación de anticuerpos aquí sería 4 μL de anticuerpo a 76 μL de PBS.
10. Remoje la punta depositada en polidopamina del electrodo de platino en solución de anticuerpos durante un mínimo de 2 h a temperatura ambiente, asegurando nuevamente que la punta del alambre de platino esté suspendida en solución y no descanse en la superficie interior del microtubo.
    NOTA: La implementación reciente de esta técnica ha favorecido el uso del electrodo de alambre de platino inmediatamente después de este paso en lugar del almacenamiento húmedo o seco para su uso posterior.
11. Después de sumergirse en la solución de anticuerpos, enjuague brevemente la punta de inmunosonda capacitiva (sonda CI) recién funcionalizada en PBS (pH 7.4). La sonda ya está lista para su uso.

2. Configuración experimental para la detección y medición in vitro de péptidos

1. Coloque la punta funcional de la sonda CI en la cámara de flujo, teniendo cuidado de no perturbar la punta del electrodo de ninguna manera, ya que hacerlo puede dañar la punta sensorial de la sonda.
   NOTA: La cámara de flujo se creó vertiendo elastómero de silicona (ver Tabla de materiales) en un plato de cultivo de 35 mm con un relleno de espacio ovoide alargado en el centro del plato. Después del endurecimiento, la forma ovoide se elimina del elastómero. La cámara se sobrefunde con solución salina tamponada tris (TBS) y se permite un caudal de 3 ml / min. Asegúrese de que la entrada y la salida mantengan el nivel de líquido en la cámara de tal manera que no se observe ninguna acción de marea del superfusado. El flujo debe permanecer en su lugar mientras la sonda CI esté en uso.
2. Antes de la primera prueba experimental, realice una ejecución estándar TBS para condicionar la sonda CI. Configure el siguiente protocolo de voltaje de comando: potencial de paso positivo = +100 mV; potencial de paso negativo = −5 mV; duración del paso = 20 ms; duración de la adquisición = 600 s.
   NOTA: Es importante permitir el equilibrio de la sonda durante la fase inicial del potencial de comando de ciclo antes de la adquisición de datos.
3. Crear una solución del péptido de interés utilizando el mismo TBS para mantener la composición del superfusado. Configure un sistema de colector donde el superfusato se pueda cambiar entre TBS y TBS suplementado con péptidos sin introducir burbujas en el sistema de tubos o la cámara de flujo.
   NOTA: En el presente estudio se utilizó el péptido NPY porcino sintético (ver Tabla de Materiales).
4. Configure el protocolo de adquisición de datos de detección de péptidos utilizando los parámetros estándar de TBS (consulte el paso 2.2.).
   NOTA: En esta implementación, la duración de cada prueba experimental fue de 360 s (120 s TBS, 120 s TBS suplementado con péptidos, 120 s TBS).

3. Adaptación de la sonda CI para uso in vivo

1. Antes de la deposición de polidopamina (paso 1.7.), enhebrar la punta expuesta del electrodo de alambre de platino a través de una aguja hipodérmica de 22 G, dejando aproximadamente 2 mm más allá de la punta de la aguja. Usando fórceps, doble suavemente hacia atrás la punta del electrodo de alambre de platino, creando una "púa" que cuelga del extremo de la aguja hipodérmica.
   1. Retire suavemente la aguja de la punta de púas, dejando suficiente alambre para colocar en el recipiente sin que la aguja entre en contacto con el fluido. Continúe con los pasos 1.4.-1.11.
      NOTA: Dependiendo de la configuración in vivo , puede ser necesario cortar una longitud de alambre de platino de más de 25 cm.
2. Antes de conectar la sonda CI al estadio principal, asegúrese de que toda la configuración eléctrica esté correctamente conectada a tierra. De lo contrario, puede introducir interferencias eléctricas no deseadas durante las grabaciones experimentales.
3. Anestesiar a los animales siguiendo un informe publicado previamente¹⁰.
4. Realizar cirugía para exponer la región de interés.
   NOTA: En el presente estudio se realizó una esternotomía mediana para exponer el corazón. Consulte Kluge et ^{al.10 para obtener} detalles sobre la cirugía animal.
5. Retire suavemente la punta funcionalizada del enjuague PBS (paso 1.11.), envíe la aguja hidodérmica a la sonda C.I. de púas e implíquela suavemente en la región de interés antes de tapar el pasador del conector dorado en el escenario principal. Una vez implantada, retire la aguja hipodérmica, dejando el electrodo en su lugar.
   NOTA: Para el presente estudio, la sonda se colocó en la pared lateral media del miocardio ventricular izquierdo¹⁰.
6. Después de garantizar una configuración eléctrica adecuada, continúe con los protocolos de prueba estándar y experimentales (paso 2.2. y paso 2.4.).
7. Una vez finalizados los experimentos, sacrificar al animal siguiendo técnicas aprobadas institucionalmente.
   NOTA: En el presente estudio, los animales son sacrificados bajo anestesia profunda mediante inducción de fibrilación ventricular¹⁰.

Resultados

Fabricación y caracterización de electrodos
Se fabricó una inmunosonda capacitiva flexible (sondas CI), y en la Figura 1A se representa una imagen representativa. El potencial del electrodo se estableció mediante un circuito de abrazadera de voltaje controlado por computadora (Figura 1B), y el electrodo se sumergió en una solución de polidopamina hecha en PBS. La polidopamina se electrodespuso en la punta del electrodo conductor

Discusión

El presente protocolo describe la fabricación y prueba de una inmunosonda capacitiva (sonda IC) capaz de detectar y medir biomarcadores de interés tanto en entornos in vitro como in vivo . La detección se logra atrapando el biomarcador en la punta del electrodo. El evento de atrapamiento altera la unión capacitiva entre una inmunosonda capacitiva de alambre de platino y el entorno del fluido conductor circundante, medido como un cambio en la corriente de carga en respuesta a un cambio potencial en l...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
AgCl disc electrode	Warner Instruments (Holliston, MA)	64-1307
Anti-NPY monoclonal antibody	Abcam, (Cambridge, MA)	ab112473
Custom multichannel amplifier/ 1 MΩ feedback resistor multichannel headstage	NPI Electronic, (Tamm, Germany)	NA	Based on NPI VA-10M multichannel amplifier
Dopamine HCl	Sigma Aldrich (St. Louis, MO)	H8502-10G
Gold-plated male connector pin	AMP-TE Connectivity (Amplimite)	6-66506-1
HEKA LIH 8+8 analog-to-digital/digital-to-analog device	HEKA Elektronik, (Holliston, MA)	NA
Igor Pro data acquisition software, v. 7.08	WaveMetrics, (Lake Oswego, OR)		Software driving command potential and data acquisition was custom written
Masterflex L/S Standard Digital peristaltic pump	Cole Palmer, (Vernon Hills, IL)
PFA-coated platinum wire	A-M Systems, (Sequim, WA)	773000	0.005” bare diameter, 0.008” coated diameter
Silicone elastomer	World Precision Instruments (Sarasota, FL)	SYLG184
Synthetic porcine NPY peptide	Bachem (Torrance, CA)	4011654
Synthetic porcine NPY peptide	Bachem (Torrance, CA)	4011654