Cribado genético para la identificación de supresores multicopia en Schizosaccharomyces pombe

Resumen

Este trabajo describe un protocolo para un cribado genético supresor multicopia en Schizosaccharomyces pombe. Esta pantalla utiliza una biblioteca de plásmidos de todo el genoma para identificar clones supresores de un fenotipo de pérdida de función asociado con una cepa mutante de consulta. Los nuevos supresores genéticos del mutante nulo ell1 se identificaron utilizando esta pantalla.

Resumen

La identificación de interacciones genéticas es una herramienta poderosa para descifrar las funciones de los genes al proporcionar información sobre sus relaciones funcionales con otros genes y la organización en vías y procesos biológicos. Aunque la mayoría de los cribados genéticos se desarrollaron inicialmente en Saccharomyces cerevisiae, una plataforma complementaria para llevar a cabo estos cribados genéticos ha sido proporcionada por Schizosaccharomyces pombe. Uno de los enfoques comunes utilizados para identificar interacciones genéticas es mediante la sobreexpresión de clones de una biblioteca de plásmidos de todo el genoma y alto número de copias en un mutante de pérdida de función, seguido de la selección de clones que suprimen el fenotipo mutante.

Este artículo describe un protocolo para llevar a cabo esta prueba genética basada en la "supresión de múltiples copias" en S. pombe. Este cribado ha ayudado a identificar supresores multicopia del fenotipo genotóxico sensible al estrés asociado con la ausencia del factor de elongación de transcripción Ell1 en S. pombe. La pantalla se inició mediante la transformación de la cepa mutante nula ell1 de consulta con una biblioteca de plásmidos de ADNc de S. pombe de alto número de copias y la selección de los supresores en placas EMM2 que contienen 4-nitroquinolina 1-óxido (4-NQO), un compuesto genotóxico inductor de estrés. Posteriormente, el plásmido se aisló de dos colonias supresoras preseleccionadas y se digirió mediante enzimas de restricción para liberar el ADN insertado. Los plásmidos que liberan un fragmento de ADN insertado se retransformaron en la cepa de deleción ell1 para confirmar la capacidad de estos clones de plásmidos supresores para restaurar el crecimiento del mutante de deleción ell1 en presencia de 4-NQO y otros compuestos genotóxicos. Los plásmidos que muestran un rescate del fenotipo de deleción se secuenciaron para identificar los genes responsables de la supresión del fenotipo sensible al estrés genotóxico asociado a la deleción ell1 .

Introducción

Las redes de interacciones genéticas proporcionan información funcional sobre los genes y delinean vías y procesos biológicos en los que estos genes pueden estar involucrados in vivo. Además, también pueden proporcionar información sobre cómo los diferentes genes interactúan entre sí, lo que resulta en un fenotipo específico ^1,2,3. A lo largo de los años, una variedad de pantallas genéticas han sido diseñadas por investigadores para responder preguntas biológicas fundamentales y estudiar enfermedades humanas. Las pantallas para la identificación de interacciones genéticas se pueden realizar de múltiples maneras. Las interacciones genéticas identificadas en diferentes pantallas genéticas pueden representar distintas relaciones mecanicistas entre genes. Además, los estudios han revelado que un conjunto común de interacciones genéticas son compartidas por genes que codifican proteínas pertenecientes a la misma vía o complejo ^4,5. Así, las redes de interacción genética pueden ser utilizadas para establecer la organización funcional en una célula, en la que los genes que comparten los perfiles más similares pertenecen al mismo complejo o vía, aquellos genes que comparten perfiles algo menos similares pertenecen al mismo proceso biológico, y aquellos genes que exhiben perfiles superpuestos pero más diversos reflejan miembros pertenecientes al mismo compartimento celular⁶.

Las pantallas de interacción genética basadas en la supresión de la dosis ("supresión de copia alta o multicopia") son uno de los enfoques comúnmente utilizados. Estas pantallas se pueden realizar transformando una cepa mutante de consulta con una biblioteca genómica o de ADNc de alto número de copias, seguida de ensayos / técnicas de selección adecuadas para identificar la supresión o mejora de las interacciones genéticas ^7,8,9. Para garantizar una cobertura completa de todo el genoma, estas pantallas también se han llevado a cabo sobreexpresando un gen específico de interés en una colección de mutantes de pérdida de función de todo el genoma o sobreexpresando una biblioteca genómica o de ADNc codificada por plásmidos de alto número de copias en un mutante de consulta de pérdida de función 9,10,11,12,13,14,15 . La estrategia de multicopia también podría funcionar utilizando un enfoque dominante/de sobreexpresión utilizando un promotor regulable.

Las principales ventajas de usar pantallas basadas en supresores son que la supresión de un fenotipo preexistente en una cepa mutante por otro gen establece una relación genética entre estos dos productos génicos que puede no haberse demostrado utilizando otros enfoques. En segundo lugar, se ha observado que la presencia de una mutación preexistente sensibiliza una vía particular, permitiendo identificar componentes adicionales de esa vía mediante el aislamiento de supresores, que pueden no haber sido identificados por selecciones genéticas más directas. Además, esta pantalla puede ser utilizada para identificar supresores que tienen diferentes mecanismos de supresión¹⁶. Las interacciones supresoras generalmente ocurren entre genes que están funcionalmente relacionados y pueden usarse para dilucidar jerarquías en vías. El mecanismo subyacente exacto de supresión puede diferir en función de varios factores, incluido el tipo de mutante de consulta utilizado en la pantalla, las condiciones experimentales y el nivel de expresión génica. Uno de los mecanismos comunes de supresión de dosis implica genes que codifican productos que funcionan juntos en el mismo complejo o en paralelo en el mismo proceso celular / biológico. Los resultados de tales pantallas en organismos modelo más simples, como la levadura, pueden extenderse a organismos eucariotas superiores, ya que la mayoría de las vías y procesos biológicos fundamentales se conservan a lo largo de la evolución.

Estas pruebas genéticas también se pueden modificar de varias maneras para responder a diferentes preguntas biológicas. Por ejemplo, se pueden identificar genes ortólogos de diferentes organismos que pueden suprimir el fenotipo de la cepa mutante de consulta. También se ha utilizado para delinear posibles mecanismos de resistencia y determinar dianas proteicas de nuevos compuestos antibacterianos^17,18, antifúngicos^19,20, antiparasitarios ^{21 y 22} anticancerígenos. Esta pantalla también ha sido explotada para identificar supresores de la actividad de fármacos cuyo mecanismo de acción se desconoce. Por lo tanto, en principio, estas pantallas supresoras de copia múltiple se pueden optimizar y utilizar en una variedad de aplicaciones en diferentes organismos. Aunque la mayoría de los cribados genéticos empleados por los investigadores de levaduras han sido desarrollados inicialmente en S. cerevisiae, S. pombe ha surgido como un sistema modelo complementario para la realización de diversos cribados genéticos y ensayos²³. Además, la organización genómica y los procesos biológicos en S. pombe, como la aparición de intrones en más genes, la complejidad de los orígenes de la replicación del ADN, la estructura del centrómero, la organización del ciclo celular y la presencia de la maquinaria de ARNi, muestran mayor semejanza entre S. pombe y los eucariotas superiores^23,24, subrayando la importancia de diseñar y utilizar herramientas genéticas en S. pombe.

Este artículo describe un protocolo para identificar interactores genéticos basado en la "supresión de dosis" de un fenotipo mutante de pérdida de función en S. pombe. La base de este protocolo es que es un método rápido y eficiente para cribar una biblioteca de ADNc que sobreexpresa genes de tipo salvaje, ya sea en un plásmido multicopia y/o de un promotor fuerte. Este protocolo tiene cuatro pasos principales: transformación de la biblioteca en una cepa mutante de consulta, selección de clones de plásmidos que suprimen el fenotipo deseado de la cepa mutante de consulta, recuperación de los plásmidos de estos clones supresores e identificación del gen responsable de la supresión del fenotipo. Como ocurre con cualquier método basado en la selección e identificación de ADNc de una biblioteca, el éxito de la pantalla depende del uso de una biblioteca de alta calidad y alta complejidad, ya que la pantalla puede recuperar solo aquellos clones de ADNc que están presentes en la biblioteca.

Utilizando este protocolo, hemos identificado con éxito dos nuevos supresores del fenotipo genotóxico sensible al estrés de la consulta S. pombe ell1 mutante nulo. La familia ELL (Eleven Nineteen Lysine Rich Leukemia) de factores de elongación de transcripción suprime la pausa transitoria de la ARN polimerasa II en plantillas de ADN en ensayos bioquímicos in vitro y se conserva en varios organismos, desde levaduras de fisión hasta humanos²⁵. Trabajos anteriores han proporcionado evidencia de que un mutante nulo de S. pombe ell1 muestra sensibilidad al estrés genotóxico en presencia de 4-nitroquinolina 1-óxido (4-NQO) y metanosulfonato de metilo (MMS)²⁶. Por lo tanto, transformamos una biblioteca de ADNc multicopia codificada por plásmidos de S. pombe en la consulta S. pombe ell1 null mutant e identificamos dos clones putativos que exhibían la capacidad de suprimir la sensibilidad al estrés genotóxico del mutante nulo S. pombe ell1 en presencia de 4-NQO, un compuesto que induce lesiones en el ADN. La secuenciación posterior del inserto presente en los clones de plásmidos identificó que los genes que codifican rax2+ y osh6⁺ eran responsables de suprimir la sensibilidad al estrés genotóxico del mutante nulo ell1 cuando se sobreexpresaba en el mutante nulo ell1.

Protocolo

1. Transformación de la biblioteca de ADNc en la cepa mutante de consulta de S. pombe para detectar supresores de copias múltiples

NOTA: Se siguió el método estándar de acetato de litio²⁷ para transformar la biblioteca de ADNc de S. pombe en la cepa Δ de consulta S. pombe ell1con algunas modificaciones:

1. Cultivar la cepa S. pombe ell1Δ a 32 °C en una placa de medio YE (Tabla 1) suplementada con 225 μg/ml de adenina, leucina y uracilo. Inocular un asa llena de inóculo de la cepa ell1Δ de la placa anterior en 15-20 ml de medio YE suplementado con 225 μg/ml de adenina, leucina y uracilo. Incubar durante la noche a 32 °C con agitación (200-250 rpm).
2. Al día siguiente, diluir el cultivo nocturno en 100 ml de medio YE fresco con los suplementos deseados a un OD 600 nm (densidad óptica a 600 nm) de 0,3 e incubarlo a 32 °C con agitación a 200-250 rpm hasta que el OD_{600 nm} alcance la fase logarítmica media.
3. Dividir el cultivo de 100 ml en dos tubos de centrífuga de 50 ml, seguidos de centrifugación a temperatura ambiente durante 10 min a 4.000 × g.
4. Desechar el sobrenadante y lavar el pellet celular con 1 mL de agua estéril, es decir, resuspender las celdas en 1 mL de agua estéril y centrifugar a 4.000 × g durante 5 min a temperatura ambiente.
5. Deseche el sobrenadante y lave cada gránulo celular con 1 ml de solución LiAc-TE (acetato de litio de 100 mM, Tris-HCl de 10 mM, EDTA de 1 mM, pH 7,5) como se describe en el paso 1.4.
6. Retirar el sobrenadante y resuspender cada pellet celular en 250 μL de 1x LiAc-TE. Utilice estas células competentes de S. pombe (500 μL) para la transformación con el ADN de interés. Transfiera 125 μL de las células competentes a cuatro tubos de microcentrífuga estériles diferentes para los pasos posteriores de transformación.
7. Hervir el ADN portador de los testículos de salmón o esperma de arenque durante 1 minuto e inmediatamente colocarlo en hielo. Para cada transformación, añadir 10 μL de 10 mg/ml de ADN portador monocatenario desnaturalizado al tubo de microcentrífuga que contiene 125 μL de las células competentes, seguido de una mezcla suave con una punta de micropipeta. Posteriormente, agregue 50 μg de la biblioteca de ADNc de S. pombe al tubo de microcentrífuga competente que contiene una mezcla de ADN portador de células.
8. Incubar los tubos de microcentrífuga a temperatura ambiente durante 10 min, y luego añadir 260 μL de solución de polietilenglicol-acetato de litio (40% [p/v] PEG 4.000, 100 mM de acetato de litio, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,5) a los tubos y mezclar suavemente con la ayuda de una punta de micropipeta.
9. Incubar los tubos de microcentrífuga que contienen la mezcla de transformación a 32 °C durante 2 h sin agitar. Añadir 43 μL de dimetilsulfóxido (DMSO) precalentado al tubo de microcentrífuga y mezclar suavemente. Posteriormente, exponga los tubos a choques térmicos a 42 °C durante 5 min.
10. Granular las células a 4.000 × g durante 5 min a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante y retire la solución residual de PEG-LiAc-TE con la ayuda de una punta de micropipeta.
11. Resuspender las células en 100 μL de agua estéril y placa en una placa EMM2 (Tabla 1) (150 mm) con suplementos requeridos y 0,2 μg/mL de 4-NQO.
12. Incubar las placas a 32 °C durante 5-6 días para permitir que aparezcan colonias en las placas. Rayar las colonias obtenidas en la misma placa media en presencia de 0,2 μg/ml de 4-NQO y utilizar para cribado adicional.
13. Para un experimento de transformación de biblioteca, utilice 500 μL de células competentes (125 μL de células competentes x 4 tubos de microcentrífuga) para la transformación, como se describe en los pasos 1.8 a 1.14 anteriores.
14. Como control, placa 1/10^de la mezcla de transformación en una placa EMM2 (150 mm) con suplementos requeridos, pero que carecen de 4-NQO, para calcular el número total de clones de biblioteca obtenidos después de la transformación de la biblioteca, y detectar el aislamiento de los clones supresores.

2. Probar y validar el rescate/supresión del fenotipo asociado con la cepa mutante de consulta por el supresor putativo

NOTA: Los ensayos de puntos de estrés se llevaron a cabo como se describe a continuación para probar y validar el rescate/supresión de la sensibilidad al estrés 4-NQO asociada a la deleción ell1 por los supresores putativos.

1. Agregue 100-200 μL de agua estéril en cada uno de los diferentes pocillos de una placa estéril de microtitulación de 96 pocillos.
2. Recoger una pequeña cantidad de inóculo de cada una de las diferentes colonias obtenidas después de la transformación de la biblioteca de ADNc en la placa que contiene 4-NQO utilizando un palillo estéril o una punta de micropipeta de 20-200 μL. Añadir el inóculo de cada una de las diferentes colonias en pocillos independientes separados de la placa de microtitulación que contenga 100-200 μL de agua estéril. Homogeneizar.
3. Detectar 3 μL de la suspensión celular de cada pocillo en placas de agar EMM2 que contienen adenina (225 μg/ml) y uracilo (225 μg/ml) pero que carecen de leucina (el marcador auxotrofo seleccionable presente en el vector plásmido utilizado para la construcción de la biblioteca utilizada en este trabajo). Agregue concentraciones apropiadas de 4-NQO a las placas según sea necesario.
4. Incubar las placas a 32 °C durante 3-4 días para permitir que las células crezcan. Identificar las colonias que muestran crecimiento en presencia de diferentes concentraciones de 4-NQO como supresores putativos.
5. Para validar aún más los supresores, cultivar los supresores seleccionados junto con las cepas de control apropiadas durante la noche a 32 °C con agitación (200-250 rpm) en medio EMM2 que contiene 225 μg / ml de adenina y uracilo pero que carece de leucina.
6. Al día siguiente, diluir las células a un OD 600 nm de 0,3 en medio EMM2 fresco y cultivarlas a 32 °C con agitación hasta la fase logarítmica media (aproximadamente_{OD 600 nm} de 0,6-0,8).
7. Detectar diluciones seriadas apropiadas (1:10 o 1:5) de cultivos en placas EMM2 con suplementos requeridos que contengan 0,4 μM 4-NQO o 0,01% MMS. Para el control, detecte las cepas en una placa EMM2 con los suplementos requeridos pero que carecen de cualquier agente dañino para el ADN.
8. Incubar las placas a 32 °C durante 3-5 días para controlar el crecimiento.
   NOTA: Se deben utilizar ensayos adecuados basados en el fenotipo asociado con la cepa mutante de consulta para probar el rescate o la supresión del fenotipo. Por ejemplo, si es necesario identificar supresores de un fenotipo sensible al frío de una cepa mutante de consulta, el ensayo para probar y validar los clones supresores implicaría el crecimiento de transformadores a baja temperatura.
9. Detecte las cepas mutantes transformadas con gen de interés de longitud completa (Spell1 en este caso) o vector vacío como controles positivos y negativos, respectivamente, junto con los transformadores de biblioteca.

3. Aislamiento del plásmido de los clones supresores de S. pombe

NOTA: El aislamiento de plásmidos de S. pombe se llevó a cabo siguiendo el protocolo descrito en Fission yeast: a laboratory manual²⁸ con algunas modificaciones.

1. Inocular una sola colonia de levadura en medio EMM2 que contenga 225 μg/ml de adenina y uracilo y cultivar las células durante la noche a 32 °C con agitación a 200-250 rpm. Al día siguiente, cosechar 5 células O.D. (es decir, 10 mL de cultivo de O.D. 0.5) centrifugando durante 2 min a 4,000 × g a temperatura ambiente.
2. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en 0,2 ml de tampón de lisis (2% Triton X-100, 1% SDS, 100 mM NaCl, 10 mM Tris HCl (pH 8.0) y 1 mM Na₂EDTA).
3. Añadir 0,2 ml de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1) y 0,3 g de perlas de vidrio lavadas con ácido al tubo de microcentrífuga. Vortex el tubo de microcentrífuga durante 2 min a 4 °C e incubar en hielo durante 1 min. Repita este paso 6x.
4. Centrifugar el tubo a 10.000 × g durante 15 min a temperatura ambiente. Transfiera la capa acuosa superior a un tubo de microcentrífuga nuevo y añada 200 μL de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1).
5. Centrifugar el tubo a 10.000 × g durante 10 min. Transfiera la capa acuosa superior a un tubo nuevo y agregue dos volúmenes de etanol al 100% (~400 μL) y 1/10 de volumen de acetato de sodio (3 M, pH 5.8) (~20 μL) al tubo. Incubar el tubo de microcentrífuga -70 °C durante 1 h.
6. Precipitar el ADN por centrifugación a 10.000 × g durante 15 min a 4 °C y retirar el sobrenadante. Lave el pellet de ADN con etanol al 70% (~500 μL) y manténgalo a temperatura ambiente para que se seque al aire.
7. Resuspender el ADN en 20 μL de agua estéril. Utilice 2-5 μL de ADN plásmido para la transformación de células competentes de E. coli.
   NOTA: El plásmido también se puede aislar de células de levadura utilizando cualquiera de los kits de aislamiento de plásmidos de levadura disponibles comercialmente.

4. Identificación del gen codificado por el clon supresor

1. Transformar los plásmidos de levadura aislados en E. coli Top10 cepa [F-mcrA (mrr-hsdRMS-mcrBC) 80LacZM15 lacX74 recA1 ara139 (ara-leu)7697 galUgalKrpsL (StrR) endA1 nupG] utilizando el protocolo estándar²⁹ y esparcir las células en placas LB (caldo Luria) con los antibióticos necesarios.
2. Aislar los plásmidos de los transformadores de E. coli utilizando el protocolo estándar de lisis alcalina²⁹, y seguir las combinaciones apropiadas de enzimas de restricción para verificar la liberación del fragmento de ADN insertado por digestión de restricción.
   NOTA: El plásmido supresor 84 fue digerido con la enzima de restricción Bam HI, y el plásmido supresor 104 fue digerido con enzimas de restricción PstI/BamHI.
3. Retransformar los plásmidos que muestran liberación de inserción después de la digestión de restricción en la cepa ell1 Δ para verificar su capacidad para rescatar el fenotipo genotóxico sensible al estrés de la cepa ell1Δ.
4. Seleccione los clones de plásmidos que muestran la supresión de la sensibilidad al estrés genotóxico y secuencie el fragmento de ADN de inserción presente en estos clones de plásmidos utilizando cebadores directos e inversos específicos del vector.
   NOTA: En este estudio, se utilizó el cebador universal hacia adelante específico del promotor adh1 (5'CATTGGTCTTCCGCTCCG 3')³⁰.
5. Para identificar el gen responsable de la supresión, alinee la secuencia obtenida utilizando NCBI nucleótido blast (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&BLAST_SPEC=GeoBlast&PAGE_TYPE=BlastSearch) o herramienta de alineación de secuencia Pombase (https://fungi.ensembl.org/Schizosaccharomyces_pombe/Tools/Blast?db=core). Seleccione la secuencia que muestra la alineación máxima e identifíquela como el gen para el plásmido supresor multicopia.

Resultados

Detección de supresores multicopia de la sensibilidad al estrés genotóxico asociada a la deleción ell1 en S. pombe
Se realizó el cribado genético utilizando el protocolo descrito anteriormente para identificar supresores multicopia del fenotipo de pérdida de función de la cepa mutante de deleción ell1 de consulta. La sensibilidad relacionada con el crecimiento de la cepa de deleción ell1 observada en pre...

Discusión

Las levaduras se han utilizado ampliamente para investigar los procesos biológicos básicos y las vías que se conservan evolutivamente en los organismos eucariotas. La disponibilidad de herramientas genéticas y genómicas, junto con su facilidad para diversos procedimientos bioquímicos, genéticos y moleculares, hacen de las levaduras un excelente organismo modelo para la investigación genética^34,35,36. A lo largo de los a...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-NQO	Sigma	N8141
Acetic Acid, glacial	Sigma	1371301000
Adenine Sulphate	Himedia	GRM033
Agar	Himedia	GRM026
Agarose	Lonza	50004L
Ammonium Chloride	Himedia	MB054
BamHI	Fermentas	ER0051
Biotin	Himedia	RM095
Boric Acid	Himedia	MB007
Calcium Chloride	Sigma	C4901
Chloroform:Isoamyl alcohol 24:1	Sigma	C0549
Citric Acid	Himedia	RM1023
Disodium hydrogen phospahte anhydrous	Himedia	GRM3960
single stranded DNA from Salmon testes	Sigma	D7656
EDTA disodium	Sigma	324503
Ferric Chloride Hexahydrate	Himedia	RM6353
Glucose	Amresco	188
Ionositol	Himedia	GRM102
Isopropanol	Qualigen	Q26897
Leucine	Himedia	GRM054
Lithium Acetatae	Sigma	517992
Magnesium Chloride Hexahydrate	Himedia	MB040
Molybdic Acid	Himedia	RM690
Nicotinic Acid	Himedia	CMS177
PEG, MW 4000	Sigma	81240
Pentothinic Acid	Himedia	TC159
Phenol	Himedia	MB082
Plasmid Extraction Kit	Qiagen	27104
Potassium Chloride	Sigma	P9541
Potassium hydrogen Pthallate	Merc	DDD7D670815
Potassium iodide	Himedia	RM1086
RNAse	Fermentas	EN0531
SDS	Himedia	GRM205
Sodium Hydroxide	Himedia	GRM1183
Sodium Sulphate	Himedia	RM1037
Tris free Base	Himedia	MB209
Uracil	Himedia	GRM264
Yeast Extract Powder	Himedia	RM668
Zinc Sulphate Heptahydrate	Merc	DJ9D692580