Fabricación de microesferas porosas altamente abiertas (HOPM) mediante tecnología microfluídica

Resumen

El presente protocolo describe la fabricación de microesferas porosas altamente abiertas (HOPM) basadas en ácido poli(láctico-co-glicólico) a través de la tecnología microfluídica fácil basada en formulación de emulsión única. Estas microesferas tienen aplicaciones potenciales en ingeniería de tejidos y detección de fármacos.

Resumen

En comparación con los andamios a granel y la inyección directa de células solas, las unidades modulares inyectables han despertado un enorme interés en la reparación de tejidos mal funcionantes debido a la conveniencia en el empaquetado de las células, la mejora de la retención celular y la mínima invasividad. Además, la conformación porosa de estos portadores de microescala podría mejorar el intercambio medio y mejorar el nivel de nutrientes y suministros de oxígeno. El presente estudio ilustra la fabricación conveniente de microesferas porosas altamente abiertas basadas en ácido poli(láctico-co-glicólico) (PLGA-HOPM) mediante la tecnología microfluídica fácil para aplicaciones de administración celular. Los PLGA-HOPM monodispersos resultantes poseían tamaños de partícula de ~ 400 μm y poros abiertos de ~ 50 μm con ventanas de interconexión. Brevemente, las gotas de aceite emulsionado (solución de PLGA en diclorometano, DCM), envueltas con la fase acuosa de gelatina al 7,5% (p/v), se introdujeron en la solución acuosa de poli (alcohol vinílico) (PVA) de flujo continuo al 1% (p/v) a través de la boquilla coaxial en la configuración microfluídica personalizada. Posteriormente, las microesferas se sometieron a procedimientos de extracción con disolventes y liofilización, lo que resultó en la producción de HOPM. En particular, varias formulaciones (concentraciones de PLGA y porógeno) y parámetros de procesamiento (poder emulsionante, medidor de aguja y caudal de fase dispersa) juegan un papel crucial en las cualidades y características de los PLGA HOPM resultantes. Además, estas arquitecturas podrían encapsular potencialmente otras señales bioquímicas, como factores de crecimiento, para aplicaciones extendidas de descubrimiento de fármacos y regeneración de tejidos.

Introducción

Las microesferas cargadas de células ofrecen ventajas favorables, como una mayor capacidad de retención celular in situ, una entrega eficiente de células y la posterior capacidad de proliferación celular in vivo¹. Hasta la fecha, se han presentado numerosas investigaciones para desarrollar una estructura de andamiaje exitosa para apoyar un entorno propicio para las células para la regeneración de tejidos o aplicaciones de detección de drogas². Sin embargo, el ambiente de hipoxia es a menudo inevitable en el interior debido a los suministros insuficientes de nutrientes / oxígeno y la acumulación de desechos metabólicos³. Para superar estos problemas, se han desarrollado microesferas altamente porosas (PMs) utilizando diversos biomateriales ^4,5,6. Además, en el cultivo dinámico, los andamios sufren de un esfuerzo cortante excesivo⁷, y el estado inestable del medio de cultivo podría romper la fidelidad de los PM. Alternativamente, el ácido poli(láctico-co-glicólico) (PLGA) podría usarse para procesar PM con buena resistencia mecánica para el cultivo dinámico¹. Por ejemplo, demostramos la coinyección de PMs altamente abiertos (HOPM) de PLGA cargados de mioblastos de ratón (C2C12) y microvarillas huecas de poli(etilenglicol) cargadas de células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) para curar la pérdida muscular volumétrica, logrando una mejora notable de la regeneración del músculo esquelético in situ ⁸.

En particular, las PM se caracterizan por grandes áreas de superficie y altas porosidades, lo que es de interés específico para la adhesión celular y el crecimiento hacia la entrega celular mínimamente invasiva⁹. En vista de estos aspectos, se han empleado diversos materiales biocompatibles para fabricar las PM^10,11. Estos PM diseñables cocultivados con células ofrecen una excelente adherencia, una resistencia mecánica considerable y ventanas altamente interconectadas, lo que podría mejorar la proliferación celular para reparar tejidos dañados¹². En este sentido, también se han desarrollado diversas tecnologías para fabricar esferas porosas^13,14. Por un lado, las PM fueron producidas utilizando agentes formadores de gas, como NH₄HCO₃, que fueron restringidos debido a la insuficiente interconectividad^15,16,17. Por otro lado, las PM fueron cortadas directamente después de la emulsificación, lo que condujo a PMs polidispersas¹⁸. Al final, la tecnología microfluídica de gotas basada en el enfoque de plantillas de emulsión es quizás un método eficiente para construir PMs, ya que a menudo resulta en partículas de tamaño uniforme¹⁹. En particular, los atributos morfológicos de las microesferas a menudo dependen de la calidad de las gotas de emulsión generadas (es decir, agua en aceite, W / O, o aceite en agua, O / W), lo que puede afectar significativamente los atributos de los biomateriales²⁰. Vale la pena señalar que la plataforma microfluídica prediseñada se puede aplicar para generar las microfibras o microesferas. En un caso, Yu et al. demostraron la producción de estructuras microfibrosas cargadas de células basadas en plataformas microfluídicas capilares, que podrían usarse para ensamblar redes celulares para imitar tejidos naturales²¹. En otro caso, Ye et al. fabricaron microcápsulas de cristal fotónico mediante la replicación de plantillas de perlas de cristal coloidal de sílice a través de tecnologías microfluídicas, lo que podría superar muchas limitaciones de las técnicas actuales que requieren un etiquetado complejo y aparatos específicos²².

De hecho, la razón detrás de la utilización de esta técnica se debe a varias ventajas, como ser de naturaleza fácil, no requerir equipos sofisticados y su conveniencia para sintetizar PM de tamaño uniforme para aplicaciones de administración celular y medicina regenerativa. En este contexto, con componentes prediseñados de plantillas de emulsión, las PM con altas porosidades e interconectividad se pueden obtener convenientemente de un dispositivo microfluídico ensamblado a partir de tubos de poli(cloruro de vinilo) (PVC), un capilar de vidrio y una aguja. Se prepara un precursor de emulsión W/O homogeneizando una solución acuosa de gelatina y una solución orgánica de PLGA. Al inyectar selectivamente la porción aplicable de la emulsión en la plataforma microfluídica, se fabrican los PM con tamaños de partícula uniformes y poros interconectados en toda la superficie hasta el interior. El presente protocolo tiene como objetivo fabricar los PLGA-HOPM mediante plantillas de emulsión en la plataforma microfluídica. Se cree que este protocolo permite la producción reproducible de PLGA-HOPM y será potencialmente aplicable en sus campos relacionados de ingeniería de tejidos y detección de fármacos.

Protocolo

1. Preparación de soluciones

1. Preparar previamente la solución madre de PVA calentando la solución de PVA en un baño maría a 80 °C y, posteriormente, colocándola en la nevera a 4 °C. Enfriar a temperatura ambiente (RT) para uso experimental.
2. Preparar la emulsión-precursor añadiendo la solución acuosa de gelatina (1 mL, 7,5%, p/v) a la fase orgánica de PLGA (2 mL, 2%, p/v en diclorometano, DCM) (ver Tabla de materiales).
   NOTA: Generalmente, la tecnología microfluídica implica diferentes fases para formar las microesferas. La fase continua o colectora comprende un poli(alcohol vinílico) acuoso (PVA, 600 mL, 1%, p/v).

2. Montaje de dispositivos microfluídicos de gotas y fabricación de PLGA-HOPM

NOTA: Los elementos consumibles necesarios para este ensamblaje se enumeran en la Tabla de materiales.

1. Personalice el conjunto del generador de gotas.
   1. Construya un generador microfluídico de coflujo utilizando un capilar de vidrio (OD, 1 mm), tubos de PVC (ID, 1 mm) y una aguja dispensadora de 26 G.
   2. Conecte el capilar de vidrio al extremo del tubo de PVC y luego perfore con una aguja en la conexión de la estructura anterior.
   3. Coloque el otro extremo del tubo de PVC en la fase continua durante la generación de gotas. Usando pegamento UV, selle los espacios en la junta después del curado.
      NOTA: La aguja debe doblarse curvada aproximadamente 45 ° para una perforación conveniente en el tubo de PVC, y el punto de aguja se estira en el tubo capilar para formar la estructura coaxial.
2. Preparar la plataforma microfluídica de gotas.
   1. Use dos bombas de jeringa, como se muestra en la Figura 1. Utilice una jeringa de 50 ml para cargar la fase continua y una jeringa de 5 ml para la formación de emulsión.
   2. Establecer los caudales de las fases continua y de dispersión en 2 mL/min y 0,08 mL/min, respectivamente.
   3. Colocar un vaso de precipitados de 500 ml en un baño de hielo y llenarlo con una solución acuosa de PVA preenfriada (paso 1.1).
      NOTA: El extremo del capilar de vidrio debe sumergirse en la fase de recolección. Se sugiere agitar (1 h, 60 rpm) el sobrenadante de la fase colectora con la varilla de vidrio después de la formación de gotas de emulsión en la plataforma. Las gotas de emulsión se producen en la punta de la punta de aguja. En general, el calibre de la aguja influye en el tamaño de los PM, en el que el calibre menor corresponde al tamaño más pequeño de los PM. Además, el diámetro del poro se correlaciona principalmente con la concentración de poógenos, capaz de aumentar con la concentración adecuada de gelatina¹.
3. Realizar la emulsificación y generación de gotas.
   1. Prepare la emulsión siguiendo los pasos a continuación.
      1. Preparar la emulsión decantando inmediatamente la solución acuosa de gelatina en la solución DCM de PLGA (paso 1.2) y emulsionando con el dispositivo ultrasónico (ver Tabla de materiales).
      2. Ajuste la potencia ultrasónica a 400 W y ajuste el tiempo total de procesamiento en 90 s (intervalo 2 s, tratamiento ultrasónico 1 s), acompañado de un cambio constante de la posición de la sonda manualmente.
      3. Estabilice la emulsión resultante para la aspiración de la jeringa y la generación de gotas en aproximadamente 20 minutos.
         NOTA: Coloque la sonda del interruptor de células ultrasónicas en la interfaz aceite-agua. Se sugiere no dejar que la sonda ultrasónica entre en contacto con el contenedor.
   2. Realice la generación de gotas.
      1. Cargue rápidamente la emulsión preparada (paso 2.3.1) en la jeringa de 5 ml de la plataforma microfluídica después del tratamiento ultrasónico.
      2. Introducir la emulsión W/O inestable (que está en el curso de la separación de fases) en el dispositivo microfluídico como la fase discontinua. Al mismo tiempo, use la solución acuosa de PVA como fase continua.
      3. Recoja las microesferas que contienen la emulsión en la parte inferior del vaso de precipitados colector (PVA, 1%, p/v) después de inyectar porciones adecuadas de la emulsión en el dispositivo microfluídico.
      4. Colocar la muestra a 4 °C durante la noche para una mayor estabilización.
   3. Enjuague y liofililice las microesferas preparadas (PLGA-HOPM) siguiendo los pasos a continuación.
      NOTA: Los PLGA-HOPM generados contienen poros arbitrarios en el interior y la superficie.
      1. Conservar las microesferas a 4 °C antes de normalizar a RT y agitar con una varilla de vidrio (1 h, 60 rpm) para eliminar el DCM residual.
      2. Filtre cuidadosamente la fase de recolección en el vaso de precipitados de 500 ml y lave las microesferas recolectadas tres veces con agua desionizada para eliminar el PVA residual en la superficie de las PM.
      3. Coloque las microesferas de PLGA en el baño de agua a 37 °C durante 30 minutos para disolver la gelatina envuelta en la columna vertebral de PLGA.
      4. Enjuagar dos veces los PLGA-HOPM resultantes con el agua desionizada para eliminar la gelatina residual y enfriar previamente para la liofilización a -80 °C durante 24 h.
      5. Almacene los PLGA-HOPM secos a -20 °C para realizar más experimentos.

3. Imágenes de microscopio electrónico de barrido (SEM)

1. Deposite PLGA-HOPM en la etapa de muestra de SEM (consulte la Tabla de materiales) en RT y coloque la etapa de muestra en la celda de pulverización catódica del magnetrón. Encienda el transformador y el magnetrón uno por uno. Introduzca la muestra en el SEM después de haber sido pulverizada con oro durante 1 min.
2. Obtenga las imágenes SEM ajustando la tensión de aceleración a 5 kV.
3. Además, cuantifique el tamaño de partícula de PLGA-HOPM utilizando 100 PM en el campo variable de las imágenes SEM. Mida el resultado representativo para cuantificar la distribución del tamaño de poro.
   1. Abra los gráficos con la imagen J y use la "línea recta" para que coincida con la barra de escala de la imagen SEM, lo que hace que el software identifique píxeles a longitud.
   2. Haga clic en analizar > establecer escala, establezca la "distancia conocida" en la barra de escala de la imagen SEM y haga clic en global > Aceptar.
   3. Haga clic en analizar > Herramientas > gestor de ROI... para medir el tamaño de poro o partícula de los PM de PLGA y haga clic en añadirlo. Mida el número de muestras en función del requisito.
   4. Haga clic en Medir para obtener los datos cuantitativos de los gráficos para su posterior cálculo.

4. Cultivo celular e imágenes de fluorescencia

NOTA: Para el presente trabajo se utilizaron células madre mesenquimales de médula ósea de rata (BMSC). Las células se obtuvieron de una fuente comercial (ver Tabla de materiales).

1. Cultive las células en el medio Eagle modificado de Dulbecco suplementado con L-glutamina (DMEM / F-12), 10% (v / v) de suero bovino fetal y 1% de penicilina / estreptomicina. Incubar las células a 37 °C y 5% de_CO2.
2. Pasar las BMSC de rata en una proporción de 1:2 después de alcanzar el 90% de confluencia.
3. Realice la adhesión celular siguiendo los pasos a continuación.
   1. Incubar los PLGA-HOPM con alcohol etílico (5 mL, 70%, v/v) y centrifugar a 500 x g durante 10 min a RT para esterilizar.
   2. Lave dos veces los PLGA-HOPM esterilizados con una solución tampón de fosfato.
   3. Incubar los HOPM (cinco en número) con la suspensión celular (5 mL, 1 x 10⁵ células/mL) en un tubo centrífugo estéril (50 mL) bajo cultivo dinámico para la adhesión de BMSC a PLGA-HOPMs.
   4. Realice el cultivo dinámico en un agitador aséptico termostático (37 °C, 90 rpm) colocando un tubo centrífugo sellado de 50 ml en el agitador (consulte la Tabla de materiales).
      NOTA: El cultivo dinámico tiene la intención de mejorar la tasa de adherencia de BMSC en los andamios, en lugar de incubar directamente las PM y las células en la placa de plástico. Las células y los PM PLGA se agregan a un tubo de centrífuga estéril de 50 ml, incubando el tubo en un agitador aséptico termostático (37 ° C, 90 rpm) y cambiando el medio cada 2 días.
4. Realice el ensayo de doble tinción vivo y muerto.
   1. Enjuague tres veces las PM cargadas de células para liberar BMSC sin apego a los PLGA-HOPM.
   2. Coloque los PM cargados de celdas en la placa con fondo de vidrio de 35 mm. Agregue 1 ml de tampón de tinción (consulte la Tabla de materiales), incluyendo 1 μL de calceína-AM y yoduro de propidio (PI), respectivamente, a la muestra prelavada con PBS.
   3. Evalúe las muestras mediante microscopía de barrido láser confocal (consulte la Tabla de materiales). Encienda la luz de excitación de 488 nm y 552 nm en el detector correspondiente. Para el análisis de superposición z, establezca el ancho z para capturar las diferentes capas de la muestra mediante el movimiento del eje z del microscopio.
      NOTA: Vale la pena señalar que las otras tinciones se pueden emplear adecuadamente para el análisis.

Resultados

Basándose en trabajos previos que optimizaron los parámetros principales¹, PLGA se disolvió en el disolvente DCM evaporable. La emulsión primaria de W/O se preparó homogeneizando con gelatina bajo tratamiento de sonda ultrasónica. La estructura fluídica de coflujo personalizada se ensambló de manera simplista, en la que se empleó una jeringa para introducir los flujos constantemente. Además, se llevaron a cabo suficientes procedimientos de enjuague para eliminar el PVA y la gelatina de l...

Discusión

Este artículo describe una estrategia eficiente para fabricar arquitecturas basadas en PLGA, a saber, los PLGA-HOPM. Cabe señalar que se deben tomar varios pasos críticos con cuidado, incluida la evitación de la volatilización del disolvente de PLGA y el ajuste suave de la potencia ultrasónica a la posición objetivo durante la preparación de la emulsión. Además, la salida de líquido de la jeringa de 20 ml se puede ajustar hasta cierto punto para resolver la separación de fases de los precursores emulsionados....

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Centrifuge tube	Solarbio, Beijing, China		5 mL & 50 mL (sterility)
Confocal laser scanning microscopy	Leica, Wetzlar, Germany		TCS SP8
Dichloromethane	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd, Shanghai, China	20161110	Research Grade
Dispensing needle	Kindly, Shanghai, China		26 G, ID: 250 μm, OD: 460 μm
DMEM/F-12	Gibco; Life Technologies Corporation, Calsbad, USA	15400054	DMEM/F-12 50/50, 1x (Dulbecco's Mod. Of Eagle's Medium/Ham's F12 50/50 Mix) with L-glutamine
Ethyl alcohol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd, Shanghai, China	20210918	Research Grade
Ethyl-enediaminetetraacetic acid (EDTA)-trypsin	Biological Industries, Kibbutz Beit-Haemek, Isra		Trypsin (0.25%), EDTA (0.02%)
Fetal bovine serum (FBS)	Biological Industries, Kibbutz Beit-Haemek, Isra		Research Grade
Freeze drier	Bilon, Shanghai, China		FD-1B-50
Gelatin	Sigma-Aldrich Co. Ltd, St. Louis, USA	lot# SZBF2870V	From porcine skin, Type A
Glass bottom plate	Biosharp, Hefei, China		BS-15-GJM, 35 mm
Glass capillary	Huaou, Jiangsu, China		0.9-1.1 × 120 mm
Incubator shaker	Zhicheng, Shanghai, China	ZWYR-200D
Live dead kit cell imaging kit	Solarbio, Beijing, China	60421211112	Green fluorescence in live cells (ex/em 488 nm/515 nm). Red fluorescence in dead cells (ex/em 570 nm/602 nm)
Low-speed centrifuge	Xiangyi, Hunan, China		TD5A
Magnetron sputter	Riye electric Co. Ltd, Suzhou, China	MSP-2S
Microflow injection pump	Harvard Apparatus, Holliston, USA		Harvard Pump 11 Plus
Penicillin-streptomycin	Biological Industries, Kibbutz Beit-Haemek, Isra	2135250	Research Grade
Phosphate buffered saline (PBS)	Servicebio Technology Co.,Ltd. Wuhan, China	GP21090181556	PBS 1x, culture grade, no Calcium, no Magnesium
Poly(lactic-co-glycolic acid)	Sigma-Aldrich Co. Ltd, St. Louis, USA	lot# MKCF9651	66–107 kDa, lactide:glycolide 75:25
Poly(vinyl alcohol)	Sigma-Aldrich Co. Ltd, St. Louis, USA	lot# MKCK4266	13-13 kDa, 98% Hydrolyzed
PVC tube	Shenchen, Shanghai, China		Inner diameter, ID: 1 mm
Rat bone marrow mesenchyml stem cells	Procell, Wuhan, China
Scanning electron microscope	Phenom pure, Eindhoven, Netherlands		Set acceleration voltage at 5 kV
Syrine for medical purpose	Kindly, Shanghai, China		5 mL & 50 mL (with the needle)
Temperature water bath	Mingxiang, Shenzhen, China		36 W
Transformer	Riye electric Co. Ltd, Suzhou, China	SZ-2KVA
Ultrasonic cell breaker	JY 92-IID, Scientz, Ningbo, China		JY 92-IID
UV curing glue	Zhuolide, Foshan, China		D-3100