Estrategia glicómica basada en proteólisis inespecífica para glicoproteínas bacterianas

Resumen

Este estudio presenta un método para el análisis glicómico de glicoproteínas mediante una combinación de digestión, permetilación y análisis de espectrometría de masas de pronasa E. Este método es capaz de analizar todos los tipos de glicanos ligados a N, incluidos los N-glicanos bacterianos.

Resumen

La glicosilación de proteínas es una de las modificaciones postraduccionales más comunes y complejas. Se han desarrollado muchas técnicas para caracterizar las funciones específicas de los glicanos, la relación entre sus estructuras y su impacto en las funciones de las proteínas. Un método común para el análisis de glicanos es emplear la escisión de exoglicosidasa para liberar glicanos ligados a N de glicoproteínas o glicopéptidos utilizando péptido-N-glicosidasa F (PNGasa F). Sin embargo, los enlaces glicano-proteína en las bacterias son diferentes y no hay ninguna enzima disponible para liberar glicanos de las glicoproteínas bacterianas. Además, también se han descrito glicanos libres en células de mamíferos, bacterias, levaduras, plantas y peces. En este artículo, presentamos un método que puede caracterizar el sistema de glicosilación ligada a N en Campylobacter jejuni mediante la detección de glicanos libres y ligados a la asparagina (Asn) que no están unidos a sus proteínas objetivo. En este método, las proteínas totales de C. jejuni fueron digeridas por Pronase E con una mayor proporción de enzima a proteína (2:1-3:1) y un tiempo de incubación más largo (48-72 h). Los Asn-glicanos y glicanos libres resultantes se purificaron utilizando cartuchos de carbono grafítico poroso, permetilados y analizados por espectrometría de masas.

Introducción

La N-glicosilación de proteínas es una de las modificaciones postraduccionales más comunes y complejas en eucariotas¹. Los N-glicanos juegan un papel esencial en el plegamiento de proteínas y también tienen un impacto en la clasificación de proteínas en el tráfico biosintético². La espectrometría de masas ha sido ampliamente utilizada en el análisis de los glicanos liberados por la escisión de exoglicosidasa (glicómica). El resto de los péptidos desglicosilados (glicoproteómica) se han utilizado comúnmente para identificar las secuencias de péptidos glicosilados en eucariotas³. La identificación de glicanos ligados a N en Campylobacter jejuni sugirió que la N-glicosilación no se limita a los eucariotas 4,5,6,7,8. Sin embargo, en el caso de las bacterias, faltan exoglicosidasas o endoglicosidasas eficaces para liberar oligosacáridos para el análisis de glicanos.

Se ha desarrollado un enfoque alternativo para caracterizar los sitios de glicosilación y las estructuras de glicanos en las glicoproteínas, que se basa en el uso de la proteólisis inespecífica para digerir la columna vertebral de la mayoría de los péptidos y generar pseudooligosacáridos que solo contienen unos pocos aminoácidos. Se han utilizado diversas enzimas inespecíficas para generar pseudooligosacáridos y se ha encontrado que la Pronase E ofrece la digestión más eficiente y reproducible⁹. Hemos desarrollado una estrategia glicómica basada en Pronase E para analizar los N-glicanos^10,11 de C. jejuni. Los pseudooligosacáridos se analizaron directamente por espectrometría de masas por electroforesis capilar (CE-MS) y/o por espectrometría de masas de tiempo de vuelo por desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI-TOF MS) después de la permetilación.

Aquí, se describe un método universal para el análisis de glucómicos que utiliza la digestión y permetilación inespecíficas de Pronasa E para estudiar la glicosilación del patógeno de la mucosa C. jejuni. Este método es capaz de caracterizar glicanos ligados a N expresados por los sistemas eucariota y bacteriano y también es útil para identificar nuevos intermediarios en las vías de glicosilación ligadas a N.

Protocolo

1. Cultivo de C. jejuni 11168H y extracción de proteínas totales

NOTA: C. jejuni 11168H es un derivado clonal hipermóvil de NCTC 11168¹².

1. Inicie el cultivo celular rehidratando el pellet celular (aproximadamente 0,15 g, NCTC) con aproximadamente 5 mL de medio de cultivo Mueller-Hinton. Use varias gotas del tubo de caldo primario para inocular una placa de agar Mueller-Hinton. Incubar a 37 °C durante 18 h bajo una atmósfera microaerófila, es decir, 5% de_O2, 10% de CO₂ y 85% de_N2.
2. Coseche el césped bacteriano con 1 ml de caldo Brain Heart Infusion (BHI). Diluir la cosecha hasta alcanzar aproximadamente 1 x 10⁵ c.f.u./mL con caldo BHI. Cultive las células durante 18 h con agitación (100 rpm) en una atmósfera microaerófila a 37 °C.
3. Enfriar las celdas colocando las placas en hielo durante 10 min y recolectar las celdas por centrifugación (4.500 x g a 4 °C). Deseche el sobrenadante y lave las células 2 veces en 3 L de Tris-HCl 0,1 M helado (pH 7,8).
4. Resuspender las células (10,^8-10,¹¹ células de C. jejuni) en 8 mL de Tris-HCl 0,1 M helado (pH 7,8) y lisar por sonicación (Tabla de materiales). Realice la sonicación de la siguiente manera: 4 s de pulso, 1 s de apagado, 1 min cada vez y tres veces en total. 
5. Centrifugar a 9.500 x g durante 45 min a 4 °C y transferir el sobrenadante a otro tubo. Diálisar las proteínas del sobrenadante 2x frente a 0,1 M de Tris-HCl (pH 7,5) a 4 °C durante 3 h.
6. Determine las concentraciones de proteínas con un ensayo de proteínas disponible en el mercado¹³ (debe estar en un rango de 4 a 6 μg/μL).
7. Disolver 1 mg de proteínas en 1 mL de tampón Tris-HCl 0,1 M (pH 7,5) y añadir 2,5 mg de Pronase E a la solución. Incubar a 37 °C durante 48 h, seguido de hervir la solución a 100 °C durante 5 min para desactivar la enzima.
8. Guarde la solución de digestión de proteínas a -80 °C para su uso posterior.

2. Purificación mediante carbono grafítico poroso (PGC)

1. Active los cartuchos de PGC (100 mg, 5 mL) añadiendo 1 mL de acetonitrilo (ACN) al 80 % (v/v) que contenga ácido trifluoacético (TFA) al 0,1 % y repita 2 veces.
2. Lave el cartucho PGC con 1 mL de agua 3 veces.
3. Cargue la digestión de Pronase E de 1 mg de proteína en PGC (el volumen depende de la concentración de proteína).
4. Lave el cartucho 3 veces con 1 ml de agua cada vez para eliminar las sales.
5. Eluir asnglicanos con 1 mL de 25% de ACN en 0,1 % de TFA, seguido de 1 mL de 50% de ACN en 0,1 % de TFA.
6. Agrupe ambas fracciones y seque las muestras con el concentrador de vacío refrigerado (Tabla de Materiales) para su posterior procesamiento.
   NOTA: Utilice disolventes de grado MS para la purificación de asnglicanos.

3. Permetilación de asn-glicanos

1. Solubilizar asnglicanos secos con 100 μL de dimetilsulfóxido (DMSO) en un tubo de 1,5 mL.
2. Prepare la suspensión de DMSO-NaOH mezclando dos gránulos de NaOH con 2 mL de DMSO. Añadir 200 μL de suspensión de DMSO-NaOH y 100 μL de yoduro de metilo a la muestra.
3. Tape bien el tubo y revuelva a 3.000 rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente con un mezclador de vórtice.
4. Apague la permetilación agregando 1 mL de agua.
5. Añadir 1 mL de cloroformo y vórtice durante 1 min para extraer los Asn-glicanos permetilados.
6. Centrífuga a 9.000 x g durante 3 min. Retire el sobrenadante y mantenga la fase inferior de cloroformo con asn-glicanos permetilados.
7. Lavar la capa orgánica añadiendo 1 mL de agua con vórtice durante 1 min. Centrifugar a 9.000 x g durante 3 min y eliminar el sobrenadante. Repita 2 veces.
8. Coloque la fase orgánica en una campana extractora y déjela secar con un chorro de nitrógeno a temperatura ambiente.
9. Almacene los asnglicanos permetilados a -80 °C para el análisis de espectrometría de masas.

4. Espectrometría de masas de ionización por electrospray (ESI-MS) y análisis ESI-MS/MS

1. Disolver los asnglicanos permetilados en 20 μL de 2-propanol al 50% en agua (v/v).
2. Realice el análisis CE-ESI-MS utilizando un capilar de sílice fundida desnudo de 90 cm con un flujo de vaina de 2-propanol del 50% en agua a 1 μL/min.
   NOTA: CE-MS es un sistema que combina electroforesis capilar (CE) y espectrometría de masas. CE separa los iones en función de su movilidad iónica. En este protocolo, se emplea el sistema CE para introducir un volumen mínimo de muestras y realizar la desalinización en línea.
3. Ajuste el voltaje ESI a 5 kV en modo positivo.
4. Cargue muestras de asnglicanos permetilados a 500 mbar durante 0,2 min, lo que corresponde a aproximadamente 100 nL.
5. Adquiera datos de MS utilizando un espectrómetro de masas (Tabla de Materiales) utilizando los siguientes parámetros de adquisición.
   1. Para MS completa, establezca el tiempo de permanencia en 2,0 ms por paso de 0,1 m/z unidad. En los experimentos MS² y MS³ con escaneo iónico de producto (EPI) mejorado, establezca la velocidad de escaneo en 4.000 Da/s, con reventado Q0. Establezca el tiempo de relleno de la trampa como Dinámico y la resolución de Q1 como Unidad. Para experimentos MS³ , establezca el coeficiente de excitación para asegurarse de que solo se seleccione el pico monoisotópico para un solo precursor cargado. Ajuste los tiempos de excitación a 100 ms.

5. Análisis de glicanos permetilados por MALDI-TOF MS

1. Disolver los asnglicanos permetilados en 10 μL de metanol/agua al 50% (v/v).
2. Mezclar 1 μL de Asnglicanos disueltos con 2 μL de solución de ácido 2,5-dihidroxibenzoico (10 mg/mL en acetonitrilo al 50%/agua (v/v)).
3. Agregue 1 μL de muestra mezclada a una placa MALDI de 384 pocillos y espere hasta que la muestra esté completamente seca.
4. Inserte la placa en el espectrómetro de masas MALDI-TOF equipado con un láser de nitrógeno pulsado (337 nm). Ajuste el voltaje de aceleración a 20 kV en el modo positivo.
5. Ajuste la potencia del láser a una escala arbitraria de 6.000 y adquiera datos en modo reflector positivo de m/z 1.000 a 5.000.

Resultados

El método basado en la combinación de digestión y permetilación de pronasa E se aplicó al análisis de N-glicanos a partir de extractos de proteínas totales de C. jejuni 11168H. En la Figura 1 se muestra un diagrama de flujo del procedimiento experimental. En la digestión típica, la proporción de enzima a glicoproteína se estableció entre 1:100 y 1:20. Aquí, la relación de Pronase E a proteína se incrementó a 2:1-3:1 y se empleó una ...

Discusión

Hay dos pasos críticos en el protocolo para la implementación de esta estrategia universal de glicomicia. El primer paso crítico es la finalización de la digestión de los gases de escape. Este método depende en gran medida de la finalización de la digestión de Pronase E. Por lo tanto, es esencial utilizar un tiempo de digestión prolongado y una alta proporción de enzimas a proteínas. Por lo general, se sugiere utilizar una proporción de 2:1-3:1 para Pronase E/proteína, y un ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,5-dihydroxybenzoic acid (DHB),	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)	149357
2-Propanol	Fisher Scientific( Ottawa, Ontario,Canada)	AA22906K7
4000 Q-Trap	AB Sciex (Concord, Canada)		Mass spectrometer
4800 MALDI-TOF/TOF	Applied Biosystems (Foster City, CA)		Mass spectrometer
acetonitrile (ACN)	Fisher Scientific( Ottawa, Ontario,Canada)	A996-4
Brain Heart Infusion (BHI) broth	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)	5121
C18 Sep-Pak cartridges	Waters (Milford, MA).	WAT036945
chloroform	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)	CX1054
Difco	Fisher Science (Ottawa, Ontario,Canada)	DF0037-17-8	Fisher Science
dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)	276855
Eppendorf tube	Diamed (Missisauga, Ontario,Canada)	SPE155-N
glacial acetic acid	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)	A6283
methanol	Fisher Scientific, Ottawa, Ontario,Canada)	A544-4
methyl iodide	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)	289566
PGC cartridge	Thermo Scientific(Waltham,MA)	60106-303	Porous graphitic carbon
Pronase E	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)	7433-2
Protein Assay Kit	Bio-rad (Mississauga, Ontario, Canada)	5000001
Refrigerated vacuum concentrator	Thermo Scientific(Waltham,MA)	SRF110P2-230
sodium hydroxide	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)	367176
Sonicator Ultrasonic Processor	Mandel Scientific (Guelph, Ontario,Canada)	XL 2020
Trifluoacetic acid (TFA)	Fisher Scientific( Ottawa, Ontario,Canada)	A11650
Tris-HCl	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)	T3253