Aislamiento y análisis de vesículas extracelulares trazables y funcionalizadas a partir del plasma y tejidos sólidos

Resumen

El presente protocolo describe un método para extraer vesículas extracelulares de la sangre periférica y tejidos sólidos con el posterior perfil de antígenos de superficie y cargas de proteínas.

Resumen

Las vesículas extracelulares (EV) circulantes y residentes en tejidos representan objetivos prometedores como nuevos biomarcadores teranósticos, y emergen como actores importantes en el mantenimiento de la homeostasis del organismo y la progresión de un amplio espectro de enfermedades. Si bien la investigación actual se centra en la caracterización de exosomas endógenos con origen endosomal, las microvesículas que brotan de la membrana plasmática han ganado cada vez más atención en la salud y la enfermedad, que se caracterizan por una gran cantidad de moléculas de superficie que recapitulan la firma de membrana de las células madre. Aquí, se presenta un procedimiento reproducible basado en la centrifugación diferencial para extraer y caracterizar EVs del plasma y tejidos sólidos, como el hueso. El protocolo describe además el perfil posterior de antígenos de superficie y cargas de proteínas de EV, que por lo tanto son trazables para sus derivaciones e identificados con componentes relacionados con la función potencial. Este método será útil para el análisis correlativo, funcional y mecanicista de EV en estudios biológicos, fisiológicos y patológicos.

Introducción

Se han propuesto vesículas extracelulares (EV) para definir estructuras extracelulares liberadas por la bicapa lipídica liberada por células¹, que desempeñan un papel importante en diversos eventos fisiológicos y patológicos². Los EV liberados por las células sanas se pueden dividir ampliamente en dos categorías principales, a saber, exosomas (o EV pequeños) formados a través de una vía de tráfico endocítico intracelular³ y microvesículas (o EV grandes) desarrolladas por la gemación externa de la membrana plasmática de la célula⁴. Mientras que muchos estudios se centran en ....

Protocolo

Los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las Directrices del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Cuarta Universidad Médica Militar y las directrices de ARRIVE. Para el presente estudio, se utilizaron ratones C57Bl/6 de 8 semanas de edad (sin preferencia por hembras o machos). Los pasos involucrados en el aislamiento de EV de plasma y tejido se ilustran en la Figura 1. El plasma se toma como un representante para describir el procedimiento de aislamiento EV de los fluidos corporales. El hueso maxilar se toma como representante para explicar el procedimiento de aislamiento EV de los tejidos sólidos.

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Resultados

De acuerdo con el flujo de trabajo experimental, los EV se pueden extraer de la sangre periférica y los tejidos sólidos (Figura 1). El hueso maxilar de un ratón de 8 semanas es de aproximadamente 0,1 ± 0,05 g, y se pueden recolectar aproximadamente 300 μL de plasma del ratón. Siguiendo los pasos del protocolo, se pueden recolectar 0,3 mg y 3 μg de EV, respectivamente. Según lo analizado por TEM y NTA, las características morfológicas típicas de los EV son vesículas de membrana re.......

Discusión

Al estudiar las características, el destino y la función de los vehículos eléctricos, es crucial aislar los vehículos eléctricos con alto rendimiento y baja contaminación. Existen varios métodos para extraer EVs, como la centrifugación por gradiente de densidad (DGC), la cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) y los ensayos de inmunocaptura ^4,20. Aquí, se utilizó uno de los métodos más utilizados, la centrifugación diferencial; las ventajas de.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% paraformaldehyde	Biosharp	143174	Transmission electron microscope
Alexa fluor 488 anti-goat secondary antibody	Yeason	34306ES60	Flow cytometry
Alexa fluor 488 anti-rabbit secondary antibody	Invitrogen	A11008	Flow cytometry
Anti-CD18 antibody	Abcam	ab131044	Flow cytometry
Anti-CD81 antibody	Abcam	ab109201	Western blot
anti-CD9 antibody	Huabio	ET1601-9	Western blot
Anti-Mitofilin antibody	Abcam	ab110329	Western blot
APOA1 Rabbit pAb	Abclone	A14211	Western blot
BCA protein assay kit	TIANGEN	PA115	Western blot
BLUeye Prestained Protein Ladder	Sigma-Aldrich	94964-500UL	Western blot
Bovine serum albumin	MP Biomedical	218072801	Western blot
Caveolin-1 antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-53564	Western blot
CellMask Orange plasma membrane stain	Invitrogen	C10045	Flow cytometry
Chemiluminescence	Amersham Biosciences	N/A	Western blot
Curved operating scissor	JZ Surgical Instrument	J21040	EV isolation
Electronic balance	Zhi Ke	ZK-DST	EV isolation
Epoch spectrophotometer	BioTek	N/A	Western blot
Eppendorf tubes	Eppendorf	3810X	EV isolation
Flotillin-1 antibody	PTM BIO	PTM-5369	Western blot
Gel imaging system	Tanon	4600	Western blot
Golgin84	Novus	nbp1-83352	Western blot
Grids - Formvar/Carbon Coated - Copper 200 mesh	Polysciences	24915	Transmission electron microscope
Heparin Solution	StemCell	7980	EV isolation
Liberase Research Grade	Sigma-Aldrich	5401127001	EV isolation
Microscopic tweezer	JZ Surgical Instrument	JD1020	EV isolation
NovoCyte flow cytometer	ACEA	N/A	Flow cytometry
Omni-PAGE Hepes-Tris Gels Hepes 4~20%, 10 wells	Epizyme	LK206	Western blot
OSCAR(D-19) antibody	Santa Cruz Biotechnology	SC-34235	Flow cytometry
PBS (2x)	ZHHC	PW013	Western blot
Pentobarbital sodium	Sigma-Aldrich	57-33-0	Anesthetization
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	Jacson	115-035-003	Western blot
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jacson	111-035-003	Western blot
Phosphotungstic acid	RHAWN	12501-23-4	Transmission electron microscope
PKM2(d78a4) xp rabbit  mab	Cell Signaling	4053t	Western blot
Polyethylene (PE) film	Xiang yi	200150055	Transmission electron microscope
Polyvinylidene fluoride membranes	Roche	3010040001	Western blot
Protease inhibitors	Roche	4693132001	Western blot
Recombinant anti-PGD antibody	Abcam	ab129199	Western blot
RIPA lysis buffer	Beyotime	P0013	Western blot
SDS-PAGE loading buffer (5x)	Cwbio	CW0027S	Western blot
Size beads	Invitrogen	F13839	Flow cytometry
Tabletop High-Speed Micro Centrifuges	Hitachi	CT15E	EV isolation
Transmission electron microscope	HITACHI	H-7650	Transmission electron microscope
Tween-20	MP Biomedicals	19472	Western blot
Vortex Mixer Genie	Scientific Industries	SI0425	EV isolation
ZetaView BASIC NTA - Nanoparticle Tracking Video Microscope PMX-120	Particle Metrix	N/A	Nanoparticle tracking analysis
α-Actinin-4 Rabbit mAb	Abclone	A3379	Western blot
β-actin	Cwbio	CW0096M	Western blot