Un nuevo modelo de herida cutánea ovina ex vivo de alto rendimiento para probar antibióticos emergentes

Resumen

El protocolo describe un método paso a paso para establecer un modelo de piel herida ovina ex vivo infectado con Staphylococcus aureus. Este modelo de alto rendimiento simula mejor las infecciones in vivo en comparación con las técnicas microbiológicas convencionales y presenta a los investigadores una plataforma fisiológicamente relevante para probar la eficacia de los antimicrobianos emergentes.

Resumen

El desarrollo de antimicrobianos es un proceso costoso con tasas de éxito cada vez más bajas, lo que hace que una mayor inversión en la investigación de descubrimiento de antimicrobianos sea menos atractiva. El descubrimiento de fármacos antimicrobianos y su posterior comercialización pueden ser más lucrativos si se puede implementar un enfoque de fallar rápido y fallar barato dentro de las etapas de optimización de plomo donde los investigadores tienen un mayor control sobre el diseño y la formulación de medicamentos. En este artículo, se describe la configuración de un modelo de piel herida ovina ex vivo infectado con Staphylococcus aureus, que es simple, rentable, de alto rendimiento y reproducible. La fisiología bacteriana en el modelo imita que durante la infección la proliferación bacteriana depende de la capacidad del patógeno para dañar el tejido. El establecimiento de la infección de la herida se verifica mediante un aumento en los recuentos bacterianos viables en comparación con el inóculo. Este modelo se puede utilizar como plataforma para probar la eficacia de los antimicrobianos emergentes en la etapa de optimización de plomo. Se puede afirmar que la disponibilidad de este modelo proporcionará a los investigadores que desarrollan antimicrobianos un modelo de falla rápida y barata de falla, lo que ayudará a aumentar las tasas de éxito en ensayos posteriores con animales. El modelo también facilitará la reducción y el refinamiento del uso de animales para la investigación y, en última instancia, permitirá una traducción más rápida y rentable de nuevos antimicrobianos para infecciones de piel y tejidos blandos a la clínica.

Introducción

Las infecciones de la piel son un problema global importante, con grandes costos económicos para los proveedores de atención médica de todo el mundo. El desarrollo de resistencia a múltiples fármacos y la formación de biopelículas por patógenos juega un papel clave en la prevalencia de heridas que no cicatrizan 1,2,3,4. Como resultado de esto, las infecciones de la piel y los tejidos blandos son una de las razones más comunes para la hospitalización prolongada y el posterior reingreso⁵. Los retrasos en la cicatrización de heridas son costosos tanto para el paciente como para los proveedores de atención médica, y algunas estimaciones sugieren que alrededor de 6.5 millones de pacientes se ven afectados anualmente en los Estados Unidos. En el Reino Unido, las infecciones de la piel y las complicaciones asociadas resultan en aproximadamente 75,000 muertes anuales ^2,4,6.

Staphylococcus aureus (S. aureus) es un formidable patógeno de heridas frecuentemente aislado de heridas de pacientes ^2,7. La tasa de aparición de resistencia a múltiples fármacos aumentó drásticamente en la década de 2000. Durante este tiempo, alrededor del 60% de las infecciones bacterianas agudas de la piel y la estructura de la piel fueron positivas para S. aureus resistente a la meticilina ¹. El creciente número de cepas resistentes a múltiples fármacos entre Staphylococci, y de hecho otros patógenos, en las últimas 2 décadas indica una necesidad urgente para el rápido desarrollo de antibióticos con nuevos modos de acción que puedan superar la resistencia.

Sin embargo, desde principios de la década de 2000, los programas de descubrimiento de antibióticos han estado dominados por tiempos de desarrollo más largos y bajas tasas de éxito, con solo el 17% de los nuevos antibióticos ingresando a ensayos clínicos en los Estados Unidos logrando la aprobación del mercado⁸. Esto sugiere una disparidad entre los resultados de las pruebas in vitro de antibióticos emergentes y sus resultados clínicos. Se puede afirmar que esta disparidad se debe en gran medida a las diferencias en la fisiología bacteriana durante las infecciones in vivo y durante los métodos microbiológicos convencionales al probar la eficacia de los antibióticos en las etapas preclínicas in vitro . Por lo tanto, se necesitan nuevos métodos de laboratorio que sean más representativos de la fisiología bacteriana durante la infección para mejorar las tasas de éxito en los programas de descubrimiento de antibióticos.

Los métodos actuales para estudiar infecciones de la piel incluyen estudios en animales vivos (por ejemplo, ratones), modelos de piel ex vivo (por ejemplo, porcinos) y modelos de piel de ingeniería tisular 3D (por ejemplo, humanos)9,10,11,12. Los estudios en animales vivos están estrictamente regulados y tienen un rendimiento relativamente bajo. En modelos animales, las heridas y la infección causan angustia significativa a los animales y plantean preocupaciones éticas. Los modelos de piel humana, ex vivo o diseñados con tejidos, requieren aprobación ética, cumplimiento de la legislación local y mundial (la Ley de Tejidos Humanos, la Declaración de Helsinki), y hay dificultades para adquirir tejidos, con algunas solicitudes que tardan años en cumplirse^13,14. Ambos tipos de modelos requieren mucha mano de obra y una experiencia significativa para garantizar el éxito experimental. Algunos modelos actuales de infección cutánea ex vivo requieren discos preinoculados y aditivos para el lecho de la herida para permitir la infección; Aunque estos modelos son increíblemente útiles, existen limitaciones en el proceso de infección ya que los aditivos limitan la utilización del lecho de la herida como fuente de nutrientes^10,15,16,17. El modelo descrito en este estudio no utiliza aditivos para el lecho de la herida, lo que garantiza que la patología de la infección y los recuentos celulares viables sean el resultado de la utilización directa del lecho de la herida como única fuente de nutrientes.

Dada la necesidad de nuevos métodos de laboratorio, se ha desarrollado un nuevo modelo ovino ex vivo de alto rendimiento de infecciones de la piel para su uso en la evaluación de la eficacia de los antibióticos emergentes. Los estudios de infección de la piel enfrentan muchos desafíos: altos costos, preocupaciones éticas y modelos que no muestran una imagen completa^20,21. Los modelos ex vivo y los modelos de explante 3D permiten una mejor visualización del proceso de la enfermedad y el impacto que los tratamientos pueden tener a partir de un modelo clínicamente más relevante. Aquí, se describe la configuración de un nuevo modelo de piel ovina, que es simple, reproducible y clínicamente relevante y tiene un alto rendimiento. La piel ovina fue elegida ya que las ovejas son uno de los grandes mamíferos comúnmente utilizados para modelar las respuestas a las infecciones in vivo. Además, están fácilmente disponibles en los mataderos, lo que garantiza un suministro constante de piel para la investigación, y sus canales no se escaldan, lo que garantiza una buena calidad del tejido. Este estudio utilizó S. aureus como patógeno ejemplar; Sin embargo, el modelo funciona bien con otros microorganismos.

Protocolo

Las cabezas de cordero del matadero R.B Elliott and Son se utilizaron como fuente de muestras de piel en este proyecto. Todos los corderos fueron sacrificados para su consumo como alimento. En lugar de descartar las cabezas, estas fueron reutilizadas para la investigación. No se requirió aprobación ética ya que el tejido se obtuvo de desechos desechados de mataderos.

1. Esterilización

1. Desinfectar las pinzas antes de recoger los cabezales tomando pinzas limpias y realizando la esterilización por calor seco en un horno a 200 °C durante 1 h. Autoclave toda la cristalería a 121 °C durante 15 min antes de su uso.
2. Llevar a cabo todo el trabajo descrito dentro de un gabinete de microbiología clase 2. Prepare todos los reactivos según las instrucciones del fabricante.

2. Recogida de muestras

1. En el matadero, los corderos Swaledale eran sacrificados aturdiendo, usando electricidad o una pistola de cerrojo cautivo, y se desangraban. Recoger las cabezas de cordero no más de 4 h después del sacrificio.

3. Preparación de los cabezales

1. Desinfecte la sección de la frente del cordero vertiendo aproximadamente 100 ml de solución de dióxido de cloro de 200 ppm en el área de la muestra. Afeite la sección de la frente del cabezal con cortapelos eléctricos y lave el área con 200 ml de solución de dióxido de cloro de 200 ppm.
2. Limpie el área con etanol y rollo azul y cubra el área de muestra con crema depilatoria durante 35 minutos. Raspa suavemente la crema depilatoria con una herramienta de raspado y evalúa el área de la muestra. Si queda una cantidad significativa de vello, repita el proceso de depilación.
3. Use otros 200 ml de solución de dióxido de cloro para enjuagar el área, y luego enjuague con etanol y limpie con un rollo azul.
4. Con un punzón de biopsia estéril de 8 mm, extraiga muestras de piel de 8 mm del área preparada. Retire las muestras con fórceps estériles y un bisturí de 15 hojas, asegurándose de que se elimine toda la grasa cutánea.
5. Coloque las muestras en un frasco estéril de 0,5 L lleno de solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) y luego transfiéralas a tubos estériles de 50 ml con 50 ml de solución de dióxido de cloro de 200 ppm, invierta dos veces y deje esterilizar durante 30 minutos.
6. Retire las muestras de la solución de dióxido de cloro y lávelas colocándolas en un tubo de 50 ml lleno de 40 ml de PBS estéril. Una vez lavada, coloque cada muestra de piel individual en un pocillo separado de una placa de 24 pocillos.
7. Añadir 350 μL de medio precalentado manteniendo la muestra en la interfaz aire-líquido. La composición de los medios es la siguiente: medios MK (Medio 199 con sales de Hanks, L-glutamato y 1,75 mg/ml de bicarbonato de sodio) y F12 de Ham en una proporción de 1:1, con FBS añadido (10% v/v), EGF (10 ng/mL), insulina (5 μg/mL), penicilina-estreptomicina (100 U/mL) y anfotericina B (2,5 μg/mL).
8. Selle las placas de 24 pocillos con un sello de placa permeable al gas e incube a 37 °C en una incubadora de tejidos humidificada al 5% de_CO2 durante un máximo de 24 h.

4. Mantenimiento de muestras de piel

1. Después de la incubación, retirar el medio de cultivo y enjuagar las muestras en 500 μL de PBS estéril. Añadir medios libres de antibióticos a cada muestra e incubar a 37 °C en una incubadora de tejido humidificada al 5% de_CO2 durante 24 h para eliminar los antibióticos residuales de la muestra.
2. Si se desarrolla turbidez o infección fúngica en los medios libres de antibióticos después de 24 h, deseche la muestra.

5. Preparación del inóculo

1. Prepare un tubo de 50 ml con 10 ml de caldo de soja tríptico estéril. Tome una placa de agar fresco de S. aureus y use un hisopo para transferir varias colonias al caldo. Incubar durante 18 h a 37 °C a 150 rpm.
2. Centrifugadora a 4.000 x g durante 3 min. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en 10 ml de PBS estéril. Repita dos veces para asegurar un lavado adecuado de las celdas.
3. Ajustar el inóculo a 0,6 OD₆₀₀ en PBS estéril. Confirme la carga de inóculo realizando un recuento manual viable de placas.

6. Infección de muestras de piel

1. Prepare una placa fresca de 24 pocillos con 400 μL de medios libres de antibióticos precalentados y agregue los insertos de 24 pocillos utilizando pinzas estériles.
2. Retire el medio de las muestras de piel, lave con 500 μL de PBS estéril y retire el lavado. Use fórceps estériles para sostener suavemente la muestra en el fondo del pozo.
3. Use una biopsia por punción de 4 mm para hacer un colgajo central de la herida, perforando hasta una profundidad aproximada de 1-2 mm. Luego, use un bisturí de 15 hojas y pinzas de tejido allis dentadas estériles para eliminar la capa superior del colgajo de la herida. La variabilidad en las dimensiones de la herida puede afectar el resultado de la infección y las unidades formadoras de colonias de punto final (UFC).
4. Una vez que todas las muestras hayan sido heridas, transfiéralas a los insertos de 24 pocillos utilizando fórceps estériles. Pipetear 15 μL del inóculo bacteriano en el lecho de la herida. A continuación, incubar durante 24 h a 37 °C en una incubadora de tejidos humidificada al 5% de_CO2 .
5. Si son necesarios períodos de incubación más largos, retire el medio y reemplácelo con medios nuevos cada 24 h e incube en las mismas condiciones.

7. Determinación de la carga bacteriana

1. Retire los medios del fondo de los pozos. Con pinzas estériles, transfiera cada muestra a un tubo separado de 50 ml lleno de 1 ml de PBS estéril.
2. Utilice un homogeneizador de punta fina para homogeneizar la superficie de la muestra. Tenga cuidado de asegurarse de que el lecho de la herida esté en contacto directo con la punta del homogeneizador.
3. Homogeneizar cada muestra durante 35 s a medio/alto. El homogeneizador separa las bacterias de la superficie del lecho de la herida para permitir la enumeración de la carga bacteriana.
4. Una vez procesadas todas las muestras, vortex cada muestra, a su vez, antes del pipeteo. Esto es para asegurar que el homogeneizado bacteriano se mezcle.
5. Pipetear 20 μL de homogeneizado de vórtice en el pocillo correspondiente de una placa de 96 pocillos que contenga 180 μL de PBS estéril.
6. Diluir en serie cada homogeneizado de muestra a 1 x 10⁻⁷ y pipetear 10 μL del homogeneizado diluido en una placa tríptica de agar de soja por triplicado.
7. Incubar la placa de agar durante 18 h a 37 °C. Luego, cuente el número de colonias para determinar la UFC para cada muestra.

Resultados

La identificación de una ruta para esterilizar la piel antes de establecer el modelo de infección de la herida fue un desafío. El desafío consistía en esterilizar la piel sin dañar las diferentes capas de la piel, lo que puede tener consecuencias no deseadas en el resultado de la infección. Para identificar un régimen de esterilización apropiado, se probaron diferentes tratamientos durante diferentes períodos de tiempo, como se describe en la Tabla 1. La contaminación se registró como el desa...

Discusión

El desarrollo de antimicrobianos es una empresa importante pero costosa que se estima que costará alrededor de $ 1 mil millones y tardará alrededor de 15 años en completarse. Más del 90% del descubrimiento de fármacos antimicrobianos y los estudios preclínicos de eficacia de fármacos antimicrobianos son llevados a cabo por investigadores académicos y pequeñas y medianas empresas con menos de 50 empleados²². Estos equipos están muy limitados financieramente, lo que hace que el fracaso de ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
24 Well Companion Plate	SLS	353504
4 mm Biopsy Punch	Williams Medical	D7484
50 ml centrifuge tubes	Fisher Scientific	10788561
8 mm Biopsy Punch	Williams Medical	D7488
Amphotericin B solution, sterile	Sigma	A2942
Colour Pro Style Cordless Hair Clipper	Wahl	9639-2117X	Hair Clippers
Dual Oven Incubator	SLS	OVe1020	Sterilising oven
Epidermal growth factor	SLS	E5036-200UG
Ethanol	Honeywell	458600-2.5L
F12 HAM	Sigma	N4888
Foetal bovine serum	Labtech International	CA-115/500
Forceps	Fisher Scientific	15307805
Hair Removal Cream	Veet	Not applicable
Heracell VIOS 160i	Thermo Scientific	15373212	Tissue culture incubator
Heraeus Megafuge 16R	VWR	521-2242	Centrifuge
Homogenizer 220, Handheld	Fisher Scientific	15575809
Homogenizer 220, plastic blending cones	Fisher Scientific	15585819
Insert Individual 24 well 0.4um membrane	VWR International	353095
Insulin, recombinant Human	SLS	91077C-1G
Medium 199 (MK media)	Sigma	M0393
Microplate, cell culture Costar 96 well	Fisher Scientific	10687551
Multitron	Infors	Not applicable	Bacterial incubator
PBS tablets	Sigma	P4417-100TAB
Penicillin-Streptomycin	SLS	P0781
Plate seals	Fisher Scientific	ESI-B-100
Safe 2020	Fisher Scientific	1284804	Class II microbiology safety cabinet
Scalpel blade number 15	Fisher Scientific	O305
Scalpel Swann Morton	Fisher Scientific	11849002
Sodium bicarbonate	Sigma	S5761-1KG
Toothed Allis Tissue Forceps	Rocialle	RSPU500-322
Tryptic Soy Agar	Merck Life Science UK Limited	14432-500G-F
Tryptic Soy Broth	Merck Life Science UK Limited	41298-500G-F
Vimoba Tablets	Quip Labs	VMTAB75BX