Obtención y perfusión-descelularización de colgajos vascularizados porcinos en un biorreactor de perfusión personalizado

Resumen

El protocolo describe la obtención quirúrgica y la posterior descelularización de colgajos porcinos vascularizados mediante la perfusión de detergente dodecil sulfato de sodio a través de la vasculatura del colgajo en un biorreactor de perfusión personalizado.

Resumen

Los defectos de tejido blando de gran volumen conducen a déficits funcionales y pueden afectar en gran medida la calidad de vida del paciente. Aunque la reconstrucción quirúrgica se puede realizar mediante transferencia autóloga de colgajo libre o alotrasplante compuesto vascularizado (VCA), tales métodos también tienen desventajas. Problemas como la morbilidad del sitio donante y la disponibilidad de tejido limitan la transferencia autóloga de colgajo libre, mientras que la inmunosupresión es una limitación significativa de VCA. Los tejidos diseñados en cirugía reconstructiva utilizando métodos de descelularización/recelularización representan una posible solución. Los tejidos descelularizados se generan utilizando métodos que eliminan el material celular nativo al tiempo que preservan la microarquitectura de la matriz extracelular subyacente (ECM). Estos andamios acelulares pueden ser posteriormente recelularizados con células específicas del receptor.

Este protocolo detalla los métodos de adquisición y descelularización utilizados para lograr andamios acelulares en un modelo de cerdo. Además, también proporciona una descripción del diseño y la configuración del biorreactor de perfusión. Los colgajos incluyen el epiplón porcino, la fascia lata tensora y el antebrazo radial. La descelularización se realiza mediante perfusión ex vivo de detergente de dodecil sulfato de sodio (SDS) de baja concentración, seguido de un tratamiento con enzimas DNasa y esterilización con ácido peracético en un biorreactor de perfusión personalizado.

La descelularización tisular exitosa se caracteriza por una apariencia blanco-opaca de colgajos macroscópicamente. Los colgajos acelulares muestran la ausencia de núcleos en la tinción histológica y una reducción significativa en el contenido de ADN. Este protocolo se puede utilizar de manera eficiente para generar andamios de tejidos blandos descelularizados con ECM preservada y microarquitectura vascular. Tales andamios se pueden utilizar en estudios posteriores de recelularización y tienen el potencial de traducción clínica en cirugía reconstructiva.

Introducción

La lesión traumática y la extirpación del tumor pueden conducir a defectos grandes y complejos de tejidos blandos. Estos defectos pueden afectar la calidad de vida del paciente, causar pérdida de la función y provocar una discapacidad permanente. Si bien técnicas como la transferencia de colgajo de tejido autólogo se han practicado comúnmente, los problemas con la disponibilidad de colgajo y la morbilidad del sitio donante son limitaciones importantes ^1,2,3. El alotrasplante compuesto vascularizado (ACV) es una alternativa prometedora que transfiere tejidos compuestos, por ejemplo, músculo, piel, vasculatura, como una sola unidad a los receptores. Sin embargo, VCA requiere inmunosupresión a largo plazo, lo que conduce a toxicidad farmacológica, infecciones oportunistas y neoplasias malignas ^4,5,6.

Los andamios acelulares de ingeniería tisular son una solución potencial a estas limitaciones⁷. Los andamios de tejido acelular se pueden obtener utilizando métodos de descelularización, que eliminan el material celular de los tejidos nativos al tiempo que preservan la microarquitectura de la matriz extracelular subyacente (ECM). En contraste con el uso de materiales sintéticos en la ingeniería de tejidos, el uso de andamios derivados biológicamente ofrece un sustrato de ECM biomimético que permite la biocompatibilidad y el potencial para la traducción clínica⁸. Después de la descelularización, la posterior recelularización de andamios con células específicas del receptor puede generar tejidos funcionales, vascularizados y con poca o ninguna inmunogenicidad 9,10,11. Mediante el desarrollo de un protocolo eficaz para obtener tejidos acelulares utilizando técnicas de descelularización de perfusión, se puede diseñar una amplia gama de tipos de tejidos. A su vez, la construcción de esta técnica permite la aplicación a tejidos más complejos. Hasta la fecha, la descelularización por perfusión de tejidos blandos vascularizados se ha investigado utilizando tejidos vascularizados simples, como un colgajo fasciocutáneo de espesor total en roedores 12, porcinos¹³ y modelos humanos 14, así como músculo esquelético recto abdominal porcino¹⁵. Además, los tejidos vascularizados complejos también han sido descelularizados por perfusión, como se demostró en los modelos de oído porcino y humano ^16,17 y en los modelos de injerto de cara completa humana¹⁸.

Aquí, el protocolo describe la descelularización de colgajos libres vascularizados utilizando andamios de ECM derivados biológicamente. Presentamos la descelularización de tres colgajos clínicamente relevantes: 1) el epiplón, 2) el tensor de la fascia lata, y 3) el antebrazo radial, todos los cuales son representativos de los colgajos de caballo de batalla utilizados rutinariamente en cirugía reconstructiva y no han sido examinados previamente en estudios con animales en el contexto de la descelularización tisular. Estos colgajos de bioingeniería ofrecen una plataforma versátil y fácilmente disponible que tiene el potencial de aplicaciones clínicas para su uso en el campo de la reparación y reconstrucción de grandes defectos de tejidos blandos.

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Protocolo

Todos los procedimientos que involucran sujetos animales han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Red Universitaria de Salud (IACUC) y se realizan de acuerdo con el protocolo y los procedimientos del Centro de Recursos Animales de la Red Universitaria de Salud y las Pautas del Consejo Canadiense de Cuidado de Animales. Se utilizaron cinco cerdos de Yorkshire (35-50 kg; edad aproximada 12 semanas de edad) para todos los experimentos.

1. Fabricación de biorreactores de perfusión

1. Ver Figura 1 para todos los componentes utilizados en el biorreactor de perfusión. Para la fabricación de la cámara de tejido, utilice contenedores de cierre a presión de polipropileno disponibles comercialmente con tapas herméticas y herméticas que contengan un forro de sello de silicona. Asegúrese de que los contenedores sean compatibles con autoclave.
2. Perfore dos orificios de 1/4 a lo largo de los lados del recipiente y enhebra un segmento corto de tubo de silicona recubierto de platino L / S-16. Un tubo llevará el perfusión de entrada y el otro es para el flujo de salida.
3. Para el tubo de entrada, conecte un conector Luer macho en la parte interna que se utilizará para conectarse a la cánula de tejido. Conecte un conector Luer hembra en el extremo externo del tubo de entrada que se utilizará para conectarse a una llave de paso de tres vías.
4. Perfore un solo orificio de 1/4 en la tapa de la cámara y enhebra otro segmento corto de tubo de silicona recubierto de platino L / S-16. Este tubo servirá como salida de aire.
5. Haga el tubo de entrada y salida midiendo aproximadamente 50 cm de tubo de silicona recubierto de platino L / S-16. Conecte un extremo a un tubo amarillo de bomba de tres paradas y el otro extremo a una pipeta serológica estéril de 2 ml para transportar perfusato desde los depósitos de detergente a la cámara del biorreactor.
6. Autoclave todos los componentes (cámara y tubería) en envases estériles envueltos individualmente.

Figura 1: Fabricación del biorreactor de perfusión. El biorreactor de perfusión consiste en (A) una cámara de tejido de polipropileno plástico (B) con orificios laterales perforados para acomodar tubos de perfusión con tapa hermética al aire y al agua. (C) Las llaves de paso están unidas a la tubería para permitir la fijación de la tubería de perfusión que transporta los agentes de descelularización desde el depósito de detergente a los desechos en una sola pasada. (D) Se utilizan casetes de bomba compatibles para conectar el tubo de tres paradas a la bomba peristáltica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. Preparación de soluciones de descelularización

1. Preparar solución salina normal heparinizada (15 UI/ml) diluyendo 1,5 ml de solución madre de heparina 1000 UI/ml en 100 ml de solución salina normal.
2. Prepare una solución de dodecil sulfato de sodio (SDS) al 0,05% p/v añadiendo lentamente 9 g de polvo de SDS a 18 L de agua destilada-desionizada esterilizada en autoclave. Utilice una garrafa de polipropileno (PP) de gran volumen para acomodar la solución SDS. La solución está lista para su uso cuando está completamente disuelta. Conservar a temperatura ambiente.
3. Preparar la solución de trabajo DNase I. En primer lugar, reconstituir la DNasa I liofilizada a una concentración madre de 10 mg/ml con 5 mM de CaCl 2 en dH₂O estéril. Almacenar la solución madre reconstituida de DNasa I como alícuotas en un congelador de −20 °C hasta que esté lista para su uso. El día del uso, diluir la DNasa I 1:100 con Mg++(1,29 mM) y Ca⁺⁺⁽1,98 mM) en _dH2Oestéril hasta una concentración final de 0,1 mg/ml.
   NOTA: La actividad de DNasa se degradará a menos que se almacene congelada. Solo se debe usar una solución de DNasa de trabajo fresca para la digestión enzimática del ADN a temperatura ambiente.
4. Preparar 1x solución de PBS diluyendo 10x PBS stock 1:10 con agua estéril esterilizada en autoclave en un volumen final de 5 L en una garrafa de PP. Conservar a temperatura ambiente.
5. Preparar antibióticos/antimicóticos (A/A) al 1% en PBS. Diluir 100x antibióticos/antimicóticos 1:100 con solución estéril 1x PBS hasta un volumen final de 1 L. Almacenar a temperatura ambiente.
6. Preparar ácido peracético (PAA) al 0,1% (v/v) de etanol (PAA)/4% (v/v) (EtOH) añadiendo 3,13 mL de PAA + 40 mL de etanol al 100 % + 956 ml de dH₂O estéril. Llevar el volumen final a 1.000 ml y almacenar a temperatura ambiente.

3. Adquisición de colgajos porcinos

NOTA: Este es un procedimiento terminal. Se utilizó un cerdo para obtener las tres solapas. Sacrificar humanamente al animal después de la obtención de todos los colgajos.

1. Cuidados preoperatorios
   1. Cerdos rápidos al menos 12 h antes de la cirugía. Sedar a los animales con ketamina (20 mg/kg intramuscular, IM), atropina (0,04 mg/kg IM) y midazolam (0,3 mg/kg IM).
   2. Inducir anestesia por inhalación de isoflurano al 5% a través de una máscara a un caudal de 22-44 mL/kg/min para inserción de línea periférica e intubación. Mantener la anestesia con isoflurano al 0,5%-2% a 22-44 mL/kg/min. Asegurar una profundidad adecuada de la anestesia comprobando la estabilidad hemodinámica y anotar la ausencia de reflejos palpebral/pedal de retirada o tono muscular de la mandíbula para denotar un nivel apropiado de anestésico administrado. Administrar remifentanilo intravenoso (10-20 μg/kg/h) a velocidad continua de infusión durante la cirugía para analgesia.
   3. Intubar al cerdo con un tubo endotraqueal apropiado (7-8 mm) y conectar el tubo a un ventilador ajustado a un volumen corriente de 8 ml/kg, PEEP de 5 cm H 2 0, FiO₂de 0,5 y frecuencia respiratoria de 14.
   4. Inserte un catéter de angiocate de 22 G en la vena del oído. Una vez que se obtiene el acceso intravenoso (IV), infundir solución salina normal caliente al 0,9% a 5-10 ml / kg / h durante todo el procedimiento para mantener la presión arterial media entre 60 mmHg y 90 mmHg.
   5. Controle continuamente la frecuencia cardíaca, la oximetría de pulso y el_CO2 espiratorio final. Evalúe la presión arterial y la temperatura corporal cada 5 minutos.
   6. Aplique ungüento para los ojos para prevenir la sequedad ocular mientras está bajo anestesia. Prepare todo el campo quirúrgico con povidona yodada. Cubra el campo quirúrgico con toallas estériles.
2. Colgajo Omental
   1. Colocar el cerdo en posición supina y realizar una laparotomía xifo-umbilical.
   2. Al entrar en el abdomen, moviliza la cefalada estomacal para visualizar el epiplón mayor. Coloque cuidadosamente el epiplón en el campo operatorio e identifique los vasos gastroepiploicos que corren a lo largo de la curvatura mayor del estómago (Figura 2A).
   3. Comience en el aspecto izquierdo de la curvatura mayor donde la arteria gastroepiploica izquierda se une a la arteria esplénica. Usando tijeras rectas de tenotomía de Stevens, esqueletizar tanto la arteria gastroepiploica izquierda como la vena. Ligate luego dividir ambos por separado usando lazos quirúrgicos o clips.
   4. Proceda a lo largo de la curvatura mayor del estómago de izquierda a derecha. Ligata y divide las ramas vasculares cortas que surgen del epiplón suministrando la mayor curvatura del estómago. Tenga cuidado de no lesionar el pedículo gastroepiploico principal del epiplón durante este paso.
   5. Continuar la movilización del epiplón mayor hasta que se encuentre la unión de los vasos gastroepiploicos derechos y la arteria gastroduodenal. Con clips o ataduras, ligar luego dividir la arteria gastroepiploica derecha y las venas por separado para liberar el colgajo omental.
   6. Una vez liberado, el epiplón se puede dividir a lo largo del medio en dos mitades, con cada mitad acompañada por una arteria y vena gastro-epiploica respectiva. Esto permite la obtención de dos colgajos libres de omental de una operación animal. Individualmente cannule los vasos gastro-epiploicos con una cánula 20-22 G y luego asegure con lazos de seda 3-0.
   7. Enjuague la solución salina heparinizada (15 UI/ml) en la cánula arterial gastroepiploica hasta que se observe un flujo venoso claro.
3. Colgajo tensor de fascia lata
   NOTA: El protocolo se basa en una descripción previa del colgajo de tensor porcino fascia lata por Haughey et ^al.19. La modificación se realiza para aislar solo la porción fascial del colgajo tensor de la fascia lata.
   1. Coloque el cerdo en la posición de decúbito lateral y afeite toda la extremidad posterior superior bilateralmente. Prepare y cubra utilizando los procedimientos estériles habituales.
   2. Marque el límite anterior del colgajo con una línea que se extiende desde la espina ilíaca superior anterior (ASIS) hacia la rótula lateral. La ubicación del pedículo es aproximadamente 6-8 cm del ASIS a lo largo de esta línea.
   3. Marque una línea posterior paralela aproximadamente de 8 cm a 10 cm desde la incisión anterior a lo largo del eje del fémur para incluir el ancho del colgajo. Marque el borde distal del colgajo en la rótula lateral.
   4. Comience la disección en el margen distal en la rótula con una incisión aguda de la piel con un bisturí. Profundice la incisión de la piel con cauterio a través del tejido subcutáneo hasta que se encuentre la fascia que recubre el recto femoral.
   5. Continúe las incisiones cutáneas hacia el ASIS a lo largo de los límites anteriores y posteriores marcados descritos anteriormente. Para aislar solo el colgajo fascial, retire el componente de la piel suprayacente de la capa fascial subyacente. Ligate o cauterizar cualquier pequeño vaso perforante a la piel.
   6. Regrese al borde distal del colgajo e incise la fascia profunda para permitir la movilización del músculo vasto lateral subyacente. Movilizar la fascia hacia el ASIS.
   7. Durante la movilización, identificar el pedículo vascular que emerge entre los músculos vasto lateral y recto femoral (Figura 2B). Tenga cuidado de evitar la tracción excesiva para no lesionar los vasos pediculares.
   8. Diseccionar el aspecto proximal del ASIS mientras protege el pedículo vascular. Diseccionar hasta que el colgajo esté suficientemente movilizado alrededor de su pedículo.
   9. Traza el pedículo hacia los vasos femorales profundos. Esqueletizar tanto la arteria femoral circunfleja lateral como la vena que suministra el colgajo fascial. Ligate luego divide ambos vasos proximalmente donde se unen a los vasos femorales profundos.
   10. Canular los vasos pediculares individualmente con angiocatéteres de 20 G a 24 G, asegurados con lazos de seda 3-0. Enjuague la solución salina heparinizada (15 UI/ml) en la cánula arterial del colgajo hasta que se observe una salida venosa clara.
4. Colgajo radial del antebrazo
   NOTA: El siguiente protocolo se basa en una descripción publicada del modelo de colgajo radial de antebrazo porcino por Khachatryan et ^al.20.
   1. Coloque el cerdo en la mesa de operaciones en la posición de decúbito lateral. Coloque la extremidad anterior dependiente dentro del campo operatorio.
   2. Marque un cuadrado de colgajo de piel de aproximadamente 3 cm x 3 cm en el antebrazo radial. Dibuje una línea entre el punto medio del margen del colgajo proximal y la fosa antecubital para denotar el curso aproximado del pedículo de la arteria radial. Confirmar el curso arterial con palpación.
      NOTA: En el modelo porcino, los vasos radiales están ubicados relativamente más profundos que en los humanos. Su ubicación es entre el flexor radial del carpo y el braquiorradial.
   3. Incide la piel con un bisturí en la cara distal con una profundidad hasta la fascia antebraquial. Disección contundente con tijeras de tenotomía hasta encontrar la arteria radial distal y sus dos venas comitantes. Ligate la arteria y las venas con lazos quirúrgicos individualmente y dividir.
   4. Continúe las incisiones cutáneas en los márgenes radial y cubital del cuadrado marcado de la piel. Movilice el colgajo del hueso radial subyacente con una cuchilla quirúrgica que proceda de una dirección radial a cubital mientras también eleva el colgajo de piel proximalmente hacia la fosa antecubital.
      NOTA: Mantenga un plano de disección subfascial para asegurarse de que el pedículo de la arteria radial permanezca asociado con la capa cutánea suprayacente.
   5. En el margen proximal, retraiga el espacio entre el braquiorradial y el flexor radial del carpo con un retractor autoretenedor para exponer la arteria radial proximal y sus venas comitantes (Figura 2C).
   6. Usando tijeras de tenotomía, esqueletizar la arteria radial y las venas comitantes proximalmente en la fosa antecubital donde se unen a la arteria braquial y las venas, respectivamente. Diseccionar los vasos de los tejidos fibrograsos circundantes para lograr una longitud pedicular suficiente de aproximadamente 5-6 cm. Ligate y divide la arteria y las venas por separado para liberar el colgajo radial del antebrazo.
   7. Canular los vasos pediculares con angiocatéteres de 20 G a 24 G, asegurados con lazos de seda 3-0. Enjuague la solución salina heparinizada (15 UI/ml) en la cánula arterial del colgajo hasta que se observe una salida venosa clara.
   8. Después de la obtención del colgajo, mantener los colgajos en solución salina fría a 4 °C hasta que estén listos para la descelularización. Bajo anestesia profunda con isoflurano, sacrificar a los animales con una inyección intravenosa de cloruro de potasio (100 mg/kg IV). Confirmar la muerte por la ausencia de signos vitales.

Figura 2: Obtención de tres colgajos vascularizados porcinos . (A) Epiplón. Las arterias gastroepiploicas derecha (i) e izquierda (ii) están canuladas en el colgajo omental (iii). (B) Fascia tensorial lata. El pedículo del colgajo (iv) es la rama ascendente de la arteria circunfleja femoral lateral (v). (C) Colgajo radial del antebrazo. La obtención del colgajo radial del antebrazo (vi) se basa en la arteria radial y la vena comitantes (vii) como el pedículo vascular (NOTA: se omitieron las cortinas con fines de demostración). Barras de escala: 3 cm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

4. Configuración del sistema de descelularización

1. Ensamble la cámara de tejido con colgajos en condiciones estériles en un gabinete de bioseguridad de flujo laminar.
2. Conecte una llave de paso de tres vías a los puertos de entrada y salida del biorreactor. Conecte un filtro de 0,2 μm al puerto de ventilación de la tapa de la cámara de tejido. Prepare el tubo de entrada con solución salina heparinizada estéril para eliminar las burbujas de aire.
3. Coloque las solapas en la cámara. Usando hemostáticos estériles, conecte las aletas al tubo de entrada utilizando el conector Luer macho. Atornille la cánula arterial respectiva de cada colgajo en el Luer macho y asegúrese de un sellado hermético.
4. Enjuague la solución salina heparinizada a través de la llave de paso para verificar que la conexión Luer no tenga fugas y que las aletas se puedan perfundir con evidencia de flujo venoso. Cierre la tapa de la cámara de tejido.
5. Conecte el tubo de entrada con un tubo de bomba amarillo de tres paradas a la llave de paso de entrada de la cámara de tejido. Además, conecte un transductor de sensor de presión en línea a la llave de paso de tres vías de entrada para permitir el monitoreo de la presión de perfusión.
6. Encienda la bomba peristáltica de entrada. En la pantalla inicial, vaya a la tercera pestaña con la tecla de flecha para ajustar el ID del tubo a 1,85 mm. A continuación, continúe con la segunda pestaña para establecer la velocidad de perfusión. Velocidad de entrada como modo de entrega y ajustada a 2 mL/min. Asegúrese de que la dirección del flujo sea correcta como se muestra en la pantalla. Cargue el tubo de la bomba de tres topes en la bomba peristáltica con un cassette compatible.
7. Repita el procedimiento para la bomba peristáltica de salida similar al anterior. Ajuste el ajuste de la bomba de salida a una velocidad de 4 ml/min. Conecte el tubo de salida con un tubo amarillo de bomba de tres paradas a la llave de paso de salida de la cámara de tejido. Cargue el tubo de la bomba de tres topes en la bomba peristáltica con un cassette compatible. Inicie el flujo para ambas bombas presionando el botón de encendido .
   NOTA: La mayor velocidad de la bomba de salida es una medida de seguridad crucial para evitar el desbordamiento de la cámara de tejido, asegurando que el flujo de salida de la cámara siempre exceda el flujo de entrada durante el curso de la descelularización. Toda la configuración de descelularización ensamblada se representa en la Figura 3.

Figura 3: Sistema de descelularización de perfusión ensamblado. (A) Esquema del sistema de descelularización de perfusión. El tubo de entrada transporta perfusato desde el depósito de detergente a la cámara de tejido de una sola pasada con monitoreo del sensor de presión. El tubo de salida elimina el perfusión activamente de la cámara de tejido en el contenedor de residuos. Las flechas negras denotan la dirección del flujo de perfusión. Se utiliza una bomba peristáltica con la bomba izquierda para controlar el flujo de entrada. El flujo de salida se elimina activamente utilizando una segunda bomba peristáltica a través del tubo respectivo. Figura creada con BioRender.com. (B) Fotografía del sistema de descelularización de perfusión montado en la mesa de trabajo con la bomba peristáltica de entrada (i) conectada a las cámaras de tejido (ii) y luego la bomba peristáltica de salida (iii). La presión de perfusión de entrada se controla con un sensor de presión en línea (iv) antes de ingresar a la cámara de tejido. Aquí, tres aletas se descelularizan en paralelo. Tanto el detergente como los depósitos de residuos están debajo de la mesa de trabajo y no están fotografiados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

5. Descelularización de colgajos porcinos

1. Lleve a cabo todos los pasos siguientes para la descelularización por perfusión a temperatura ambiente. Para un resumen de las tasas y duraciones de perfusión, véase la Tabla 1. Comience la perfusión de solución salina heparinizada a 2 ml / min usando una bomba peristáltica y perfunda los colgajos con solución salina heparinizada en la cámara del tejido durante 15 minutos para eliminar cualquier coágulo de sangre retenido.
2. Al finalizar la perfusión salina heparinizada, aspire la solución salina residual en la cámara del tejido. Llene la cámara de tejido con aproximadamente 500 ml de solución de descelularización SDS para sumergir suficientemente el colgajo.
3. Transfiera el tubo de entrada a la solución de descelularización SDS y perfunda el tejido a 2 ml / min. La duración de la perfusión varía dependiendo del colgajo; perfundir SDS durante 2 días para el epiplón, 3 días para la fascia tensorial y 5 días para el colgajo fascio-cutáneo radial del antebrazo.
4. Al finalizar la descelularización de SDS, aspire el perfusión de SDS existente contenido dentro de la cámara de tejido. Transfiera el tubo de entrada a 1x solución de PBS y perfunda las aletas durante 1 día a 2 ml / min.
5. Retire la solución PBS anterior y transfiera el tubo de entrada a la solución de trabajo DNasa. Perfundir durante 2 h a 2 mL/min. Retire la solución de DNasa de la cámara de tejido y coloque el tubo de entrada en 1x solución de PBS. Sumergir los tejidos con 1x solución de PBS en la cámara y perfundir 1x solución de PBS durante 1 día a 2 mL/min.
6. Esterilizar los colgajos con solución PAA/EtOH. Transfiera el tubo de entrada a PAA/EtOH en solución de_dH2Oy sumerja los tejidos en la misma solución. Perfundir PAA/EtOH a 2 mL/min durante 3 h. Una vez que se complete la esterilización PAA/EtOH, desconecte el tubo de las llaves de paso de tres vías.
7. Retire los colgajos utilizando una técnica aséptica y coloque los instrumentos estériles en PBS que contengan 1% de antibióticos/antimicóticos (A/A). Sumerja las aletas con PBS + 1% A/A durante 15 minutos en dos lavados separados para neutralizar completamente el ácido residual. Mantener los colgajos en PBS + 1% A/A a 4 °C hasta que estén listos para la recelularización.
8. Verifique la esterilidad de los andamios realizando un cultivo de hisopo en placas de agar y examine el crecimiento microbiano. Inocular las placas de agar con hisopos tomados de cada superficie del colgajo. Cultivar las placas de agar a 37 °C durante un máximo de 2 semanas. La esterilidad se demuestra por la ausencia de crecimiento de colonias microbianas.

Tabla 1: Resumen de los parámetros del protocolo de perfusión-descelularización. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

6. Evaluación de la descelularización

1. Usando una biopsia por punción, obtenga muestras de 3 mm a 10 mm de espesor de los colgajos.
2. Para histología, fijar biopsias en casetes histológicos en formalina tamponada normal durante 24 h a temperatura ambiente.
3. Lave los casetes de biopsia en agua o PBS durante 15 minutos y luego colóquelos en etanol al 70% hasta que estén listos para el procesamiento de tejidos. Procese los casetes en un procesador de tejidos de acuerdo con los protocolos estándar.
4. Incruste las biopsias en parafina, permitiendo que la cera se solidifique durante 10-15 minutos en una placa fría. Sección de bloques de parafina en un micrótomo de hasta 5 μm de espesor. Manche los portaobjetos con hematoxilina y eosina (H&E) de acuerdo con los protocolos estándar. Imagen de los portaobjetos de tejido con microscopía óptica.
5. Para la cuantificación del contenido de ADN, obtener el peso seco de las biopsias de tejido después del secado nocturno del tejido en un horno a 60 °C. Digerir las muestras en un tampón de extracción de papaína a 65 °C durante la noche. Centrifugar las muestras digeridas a 10.000 x g y transferir el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga nuevo. Evalúe el contenido de ADN con un kit de extracción de ADN comercial según las instrucciones del fabricante.

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Resultados

Este protocolo para descelularizar colgajos porcinos vascularizados se basa en la perfusión de un detergente de base iónica, SDS, a través de la vasculatura del colgajo en un biorreactor de perfusión personalizado. Antes de la descelularización, se adquirieron tres colgajos vascularizados en un modelo porcino y se canularon de acuerdo con sus principales vasos suministradores. Las aletas se enjuagaron inmediatamente después de la adquisición para mantener una vasculatura patentada y perfusible para permitir una de...

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Discusión

El protocolo propuesto utiliza la perfusión de SDS de baja concentración para descelularizar una gama de colgajos derivados de porcinos. Con este procedimiento, el epiplón acelular, el tensor de la fascia lata y los colgajos radiales del antebrazo se pueden descelularizar con éxito utilizando un protocolo que favorece la baja concentración de SDS. Los experimentos preliminares de optimización han determinado que la SDS a una concentración baja (0,05%) entre 2 días y 5 días es capaz de eliminar material celular p...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 µm pore Acrodisk Filter	VWR	CA28143-310
0.9 % Sodium Chloride Solution (Normal Saline)	Baxter	JF7123
20 L Polypropylene Carboy	Cole-Parmer	RK-62507-20
3-0 Sofsilk Nonabsorbable Surgical Tie	Covidien	LS639
3-way Stopcock	Cole-Parmer	UZ-30600-04
Adson Forceps	Fine Science Tools	11027-12
Antibiotic-Antimycotic Solution, 100X	Wisent	450-115-EL
Atropine Sulphate 15 mg/30ml	Rafter 8 Products	238481
BD Angiocath 20-Gauge	VWR	BD381134
BD Angiocath 22-Gauge	VWR	BD381123
BD Angiocath 24-Gauge	VWR	BD381112
Calcium Chloride	Sigma-Aldrich	C4901	DNAse Co-factor
DNase I from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	DN25
DNA assay (Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit)	Invitrogen	P7589
DPBS, 10X	Wisent	311-415-CL	without Ca++/Mg++
Halsted-Mosquito Hemostat	Fine Science Tools	13008-12
Heparin, 1000 I.U./mL	Leo Pharma A/S	453811
Ketamine Hydrochloride  5000 mg/50 ml	Bimeda-MTC Animal Health Inc.	612316
Ismatec Pump Tygon 3-Stop Tubing	Cole-Parmer	RK-96450-40	Internal Diameter:  1.85 mm
Ismatec REGLO 4-Channel Pump	Cole-Parmer	78001-78
Ismatec Tubing Cassettes	Cole-Parmer	RK-78016-98
Isoflurane 99.9%, 250 ml	Pharmaceutical Partners of Canada Inc.	2231929
LB Agar Lennox	Bioshop Canada	LBL406.500	Sterility testing agar plates
Magnesium Sulfate	Sigma-Aldrich	M7506	DNAse Co-factor
Masterflex L/S 16 Tubing	Cole-Parmer	RK-96410-16
Midazolam 50 mg/10 ml	Pharmaceutical Partners of Canada Inc.	2242905
Monopolar Cautery Pencil	Valleylab	E2100
Normal Buffered Formalin, 10%	Sigma-Aldrich	HT501128
N°11 scalpel blade	Swann Morton	303
Papain from papaya latex	Sigma-Aldrich	P3125
Peracetic Acid	Sigma-Aldrich	269336
Plastic Barbed Connector for 1/4" to 1/8" Tube ID	McMaster-Carr	5117K61
Plastic Barbed Tube 90° Elbow Connectors	McMaster-Carr	5117K76
Plastic Quick-Turn Tube Plugs	McMaster-Carr	51525K143	Male Luer
Plastic Quick-Turn Tube Sockets	McMaster-Carr	51525K293	Female Luer
Punch Biopsy Tool	Integra Miltex	3332
Potassium Chloride 40 mEq/20 ml	Hospira Healthcare Corporation	37869
Povidone-Iodine, 10%	Rougier	833133
Serological Pipet, 2mL	Fisher Science	13-678-27D
Snap Lid Airtight Containers	SnapLock	142-3941-4
Sodium Dodecyl Sulfate Powder	Sigma-Aldrich	L4509
Surgical Metal Ligation Clips, Small	Teleflex	001200
Stevens Tenotomy Scissors, 115 mm, straight	B. Braun	BC004R
TruWave Pressure Monitoring Set	Edwards Lifesciences	PX260