Imágenes simultáneas de la dinámica microglial y la actividad neuronal en ratones despiertos

Resumen

Aquí, describimos un protocolo que combina la inyección de virus adenoasociados con la implantación de ventana craneal para obtener imágenes simultáneas de la dinámica microglial y la actividad neuronal en ratones despiertos.

Resumen

Dado que las funciones cerebrales están bajo la influencia continua de las señales derivadas de los tejidos periféricos, es fundamental dilucidar cómo las células gliales en el cerebro detectan diversas condiciones biológicas en la periferia y transmiten las señales a las neuronas. La microglía, células inmunes en el cerebro, están involucradas en el desarrollo sináptico y la plasticidad. Por lo tanto, la contribución de la microglía a la construcción del circuito neural en respuesta al estado interno del cuerpo debe probarse críticamente mediante imágenes intravitales de la relación entre la dinámica microglial y la actividad neuronal.

Aquí, describimos una técnica para la obtención simultánea de imágenes de la dinámica microglial y la actividad neuronal en ratones despiertos. El virus adenoasociado que codifica R-CaMP, un indicador de calcio codificado por genes de la proteína de fluorescencia roja, se inyectó en la capa 2/3 de la corteza visual primaria en ratones transgénicos CX3CR1-EGFP que expresan EGFP en microglia. Después de la inyección viral, se instaló una ventana craneal en la superficie cerebral de la región inyectada. Las imágenes in vivo de dos fotones en ratones despiertos 4 semanas después de la cirugía demostraron que la actividad neuronal y la dinámica microglial podrían registrarse simultáneamente con una resolución temporal inferior a un segundo. Esta técnica puede descubrir la coordinación entre la dinámica microglial y la actividad neuronal, con la primera respondiendo a los estados inmunológicos periféricos y la segunda codificando los estados cerebrales internos.

Introducción

Cada vez hay más pruebas de que el estado interno del cuerpo influye constantemente en las funciones cerebrales de los animales 1,2,3,4,5. En consecuencia, para obtener una comprensión más profunda de las funciones cerebrales, es crucial dilucidar cómo las células gliales en el cerebro monitorean las condiciones biológicas en la periferia y transmiten la información a las neuronas.

La microglía, células inmunes en el cerebro, están involucradas en el desarrollo sináptico y la plasticidad, que esculpen las características de los circuitos neuronales en el cerebro 6,7,8,9. Por ejemplo, el trabajo pionero de Wake et al. demostró que los procesos microgliales hacen contacto con las sinapsis de una manera dependiente de la actividad neuronal en el neocórtex del ratón y que la isquemia artificial induce la pérdida de sinapsis después del contacto prolongado con la microglía¹⁰. Tremblay et al. encontraron que la alteración de la experiencia visual cambia la modalidad de interacción microglial con las sinapsis. Durante el período crítico en que el recambio de la columna dendrítica en la corteza visual primaria (V1) aumenta por la privación binocular, la adaptación a la oscuridad reduce la motilidad de los procesos microgliales y aumenta tanto su frecuencia de contacto con las hendiduras sinápticas como el número de inclusiones celulares en la microglía¹¹. Estos resultados sugieren que los procesos microgliales detectan la actividad neuronal y su entorno circundante para remodelar los circuitos neuronales. Además, un estudio reciente informó que la vigilancia microglial difiere entre condiciones despiertas y anestesiadas, lo que sugiere la importancia de los experimentos con ratones despiertos para investigar la comunicación neurona-microglía en condiciones fisiológicas¹².

La imagen de calcio in vivo de dos fotones es una herramienta poderosa para el registro de la dinámica del calcio, que refleja el disparo neuronal en curso, en cientos de neuronas simultáneamente en un animal vivo^13,14,15. Las imágenes de calcio en las neuronas generalmente requieren una resolución temporal de más de unos pocos Hz para rastrear las respuestas neuronales rápidas^16,17. En contraste, estudios previos que rastrean la dinámica microglial han muestreado estructuras microgliales a una resolución temporal relativamente baja de menos de 0.1 Hz^18,19,20. Un estudio reciente aplicó imágenes simultáneas de dos fotones para comprender la comunicación neurona-microglía²¹. Sin embargo, todavía no está claro cómo los procesos microgliales dinámicos responden a la actividad neuronal circundante a una resolución temporal de más de unos pocos Hz en ratones despiertos. Para abordar este problema, describimos un método simultáneo de imágenes de dos fotones in vivo de actividad neuronal y dinámica microglial con una resolución temporal superior a 1 Hz en ratones despiertos. Este método nos permite lograr imágenes estables en ratones despiertos a una velocidad de fotogramas más alta (máximo, 30 Hz con el tamaño de fotograma de píxeles de 512 x 512 píxeles) y proporciona una forma más favorable de investigar el comportamiento de vigilancia de la microglía o su interacción con la actividad neuronal en ratones despiertos.

Protocolo

Todos los experimentos fueron aprobados por el Comité de Ética Animal y el Comité de Seguridad de Experimentos Recombinantes Genéticos de la Escuela de Graduados de Medicina y la Facultad de Medicina de la Universidad de Tokio, y se realizaron de acuerdo con sus directrices.

1. Preparación

1. Esterilizar todos los instrumentos y aparatos necesarios para la cirugía utilizando autoclave o etanol al 70%.
2. Preparación de pipetas de vidrio.
   1. Fije firmemente un capilar calibrado de 75 μL al soporte del extractor de micropipetas. Ajuste el extractor al programa con los parámetros recomendados como P (presión) = 500, CALOR = 680, EXTRACCIÓN = 30, VEL = 60, TIEMPO = 180.
   2. Después de terminar el programa (generalmente 4.5 a 5 s), el capilar se divide en dos pipetas de vidrio con colas estrechas. Luego, rompa la parte distal de las colas con pinzas para mantener el diámetro de la punta dentro de 30-50 μm. Para ello, rompe las colas 1 cm distales hasta el final de la parte biselada.
3. Para la craneotomía, prepare una ventana craneal pegando un disco de vidrio exterior más grande, de 4 mm de diámetro, 0.15 ± 0.02 mm de espesor, a un disco de vidrio interno más pequeño, de 2 mm de diámetro, 0.525 ± 0.075 mm de espesor, utilizando un reactivo de curado por luz UV (Figura 2A).

2. Inyección de AAV

1. Preparación del aparato de inyección
   1. Coloque una pipeta de vidrio conectada a una jeringa Hamilton de 26 G a través de un tubo sobre un soporte de pipeta de un instrumento estereotáxico y, a continuación, incline el soporte para pipeta 60° anteriormente desde el eje vertical (Figura 1A, B).
   2. Llene la pipeta de vidrio, la jeringa y el tubo de conexión con parafina líquida. Coloque la jeringa en un microinyector.
2. Procedimiento quirúrgico
   NOTA: La siguiente cirugía se realizó en una cabina esterilizada. Se utilizó un microscopio estereoscópico para la cirugía si era necesario.
   1. Anestesiar un ratón CX3CR1-EGFP macho (información detallada en la Tabla de materiales) a las 7 a 8 semanas de edad (peso corporal 22-26 g) con isoflurano al 3% en una cámara estanca al gas. Después de 3 minutos, saque al ratón de la cámara cuando pierda el movimiento voluntario, excepto la respiración, y luego cambie a anestesia continua mediante un tubo nasal con isoflurano al 2%.
      NOTA: Se sabe que el isoflurano activa la microglía. Sin embargo, debido a que las imágenes se realizan 4 semanas después de la cirugía, no hay efecto del isoflurano en los ratones durante la obtención de imágenes. Aunque la anestesia con isoflurano se utiliza durante unos minutos cuando los ratones se colocan en el instrumento estereotáxico antes de la obtención de imágenes (paso 4.2.1), encontramos que el efecto de esta anestesia corta es insignificante.
   2. Durante la cirugía, mantenga el ratón caliente con una almohadilla térmica a 37 °C para evitar la hipotermia. Aplicar ungüento ocular en ambos ojos para prevenir la sequedad corneal y administrar una inyección de meloxicam, por vía subcutánea (5 mg/kg). Conecte el ratón a una barra auxiliar y, a continuación, fije el ratón en el instrumento estereotáxico con el lado dorsal hacia arriba.
   3. Ajuste la concentración de isoflurano a un porcentaje apropiado (1% -2%) durante la cirugía mientras monitorea la respiración y la frecuencia cardíaca. Retire el vello con crema depilatoria y desinfecte la cabeza varias veces con un exfoliante a base de yodo o clorhexidina y alcohol. Luego, inyecte 0.1 ml de lidocaína al 1% por vía subcutánea y aplique cortinas estériles para asegurar el sitio quirúrgico.
   4. Abra el cuero cabelludo a lo largo de la línea media con tijeras y haga la incisión de unos 2 cm de largo, para garantizar una buena exposición del cráneo por encima de la corteza visual primaria derecha. Después de la incisión del cuero cabelludo, irrigar la cabeza con solución salina durante todo el procedimiento para evitar que el cráneo y el cerebro expuestos se sequen.
   5. Retire el periostio del cráneo expuesto con fórceps. Perfore el cráneo en las coordenadas estereotáxicas: 3 mm lateral a la línea media, 0,5 mm anterior a la línea lambda, para crear un pequeño agujero con aproximadamente 0,5 mm de diámetro. Enjuague la sangre y los restos de tejido de la broca, si es necesario.
   6. Llenar la pipeta de vidrio con 1 μL de rAAV2/1-hSyn-R-CaMP1.07 utilizando el siguiente procedimiento a un título de 8,3 x 10¹² genomas vectoriales/ml²².
      1. Avance la jeringa para expulsar 1 μL de parafina líquida de la pipeta de vidrio. Coloque un trozo de película transparente, de aproximadamente 2 cm x 2 cm, sobre el cráneo expuesto del ratón y expulse una gota de 1 μL de solución AAV sobre la película utilizando un pipete.
      2. Coloque la punta de la pipeta de vidrio en la gota de solución AAV en la película y tire suavemente de la jeringa para aspirar la solución AAV. Después de la eyección, gire la llave de paso en forma de T para liberar la presión dentro del tubo y la pipeta de vidrio.
   7. Inserte la pipeta de vidrio a una profundidad de 500 μm desde la superficie cerebral a través del orificio creado en el paso 2.2.5 y, a continuación, inyecte 0,5 μL de solución de AAV utilizando el microinyector (figura 1C). Utilizar el caudal volumétrico de inyección de 2,0 μL/h; una inyección de 0,5 μL dura 15 min, y luego esperar 5 min.
   8. Después de la inyección, retire suavemente la pipeta de vidrio y enjuague la superficie cerebral con solución salina.

3. Implantación de ventana craneal

NOTA: La implantación de ventana craneal sigue a la inyección de AAV el mismo día.

1. Marque un círculo de 2,5 mm de diámetro en el cráneo, centrado 3 mm lateralmente de la lambda. Cree una ranura circular a lo largo de la marca en el cráneo perforando. Limpie los residuos, ya que pueden afectar negativamente la visibilidad del cráneo y aplique solución salina durante el proceso de perforación para evitar el calentamiento.
2. Para verificar si la profundidad de perforación en la ranura circular es suficiente para eliminar el fragmento central del cráneo, presione suavemente el cráneo central con fórceps. Si se mueve verticalmente con poca resistencia, la profundidad de perforación es suficiente.
3. Cuando el surco alcance suficiente profundidad, inserte la punta de los fórceps en la parte inferior del fragmento central del cráneo y levántelo y retírelo suavemente para exponer la superficie del cerebro (Figura 1D).
4. Con una aguja de 27 G, pinche y rasgue la duramadre en el borde de la superficie cerebral expuesta. Inserte la punta de los fórceps a través del orificio hecho en el borde de la duramadre. Sostenga la duramadre y despéguela para exponer la superficie del cerebro.
   NOTA: Si se produce sangrado, enjuague la superficie del cerebro con solución salina hasta que el sangrado se detenga.
5. Usando fórceps, disperse las fibras hemostáticas una por una en solución salina en un plato de 3,5 mm y luego coloque las fibras hemostáticas a lo largo de los márgenes del orificio en el que está presente la duramadre transectada.
6. Coloque una ventana craneal preparada en el paso 1.3 en la superficie cerebral expuesta y luego adhiérala al cráneo con pegamento instantáneo mientras presiona suavemente la ventana para que la ventana esté en contacto cercano con el cráneo.
7. Luego, aplique pegamento instantáneo a todo el cráneo expuesto y luego coloque cuidadosamente una placa de cabeza en el cráneo para que la ventana se ubique en el centro del orificio cuadrado de la placa de cabeza (Figura 2C). Asegúrese de que la superficie de la placa principal sea paralela a la superficie de la ventana de vidrio.
8. Después de que el pegamento se haya endurecido lo suficiente, aplique cemento dental en el cráneo expuesto para reforzar la unión entre la cabeza y la placa de la cabeza (Figura 2).
   NOTA: Si los experimentos incluyen la presentación de estímulos visuales a ratones, se debe evitar la luz parásita en el área de imágenes. Es recomendable ennegrecer el cemento mezclándolo con el carbón activado para la reducción de la reflexión de la luz.
9. Retire el ratón de la anestesia después de que el cemento se haya endurecido lo suficiente (aproximadamente 20 minutos). Luego, coloque al ratón en una nueva jaula para recuperarse solo.
10. Después de confirmar su conciencia y movimiento voluntario, lo que indica una recuperación completa, vuelva a colocar el mouse en la jaula de la casa. Durante la recuperación, administre una segunda dosis, o más si es necesario, de meloxicam (una vez cada 24 horas durante 1-3 días) si se producen comportamientos obvios que indican dolor.

4. Imágenes in vivo de dos fotones de la microglía y la dinámica neuronal del calcio

1. Habituación de ratones al aparato microscópico
   1. Tres semanas después de la cirugía, inducir anestesia en el ratón con isoflurano al 3% y colocar el ratón bajo la lente objetivo 25x de un microscopio de dos fotones utilizando un instrumento estereotáxico hecho a medida (Figura 3C). Para la configuración aquí, el mouse se coloca en la parte superior de una cinta de correr y se le permite funcionar libremente.
   2. Aproximadamente 10 minutos después, retire el mouse de la etapa de microscopio y devuélvalo a la jaula de la casa. Repita la habituación al menos 3 veces cada día alterno antes de la adquisición de imágenes de dos fotones.
2. Adquisición de imágenes de dos fotones
   NOTA: Recomendamos realizar la adquisición de imágenes más de 4 semanas después de la cirugía, ya que la activación microglial regresa gradualmente al nivel basal.
   1. Como en el paso 4.1, inducir la anestesia en el ratón con isoflurano al 3% y colocar el ratón bajo la lente objetiva del microscopio de dos fotones utilizando un instrumento estereotáxico hecho a medida.
   2. Instale el dispositivo de sombreado hecho a medida y un monitor LCD para la estimulación visual como se describe a continuación (Figura 3D).
      1. Coloque la lente para enfocar la superficie del cerebro y, a continuación, establezca esta posición de la lente como la posición Z original. Mantenga constantes las coordenadas x-y y eleve la lente del objetivo; Retire el ratón y el instrumento estereotáxico de la lente del objetivo y de la cinta de correr.
      2. Coloque un dispositivo de sombreado en la parte superior de la placa principal con silicona, que se ennegrece mezclándola con polvo de carbón, y asegúrese de que el espacio entre la placa principal y el dispositivo de sombreado esté bien sellado.
      3. Llene el dispositivo de sombreado con agua destilada y luego fije el mouse y el marco estereotáxico nuevamente debajo del objetivo y en la cinta de correr. Restablezca cuidadosamente el plano focal en la superficie del cerebro, verificando la profundidad de la lente del objetivo.
         NOTA: Para evitar el riesgo de dañar la lente del objetivo, establezca primero las coordenadas xyz y, a continuación, aplique el dispositivo de sombreado de la lente del objetivo. También es razonable instalar primero la cubierta y luego ajustar las coordenadas, pero es necesario un manejo cauteloso para esta opción.
      4. Cubra la lente del objetivo con papel de aluminio negro para evitar la contaminación lumínica del monitor LCD utilizado para la estimulación visual a través de la lente del objetivo (Figura 3D). Coloque un monitor LCD de 10 pulgadas a 12,5 cm delante de los ojos del ratón para presentar estímulos visuales (Figura 3D).
   3. Configure los filtros de recolección de emisiones de fluorescencia para fluorescencia EGFP (filtro de emisión 525/50 nm) y fluorescencia R-CaMP (filtro de emisión 593/46 nm) y la longitud de onda de excitación hasta 1.000 nm. Adquiera imágenes con una resolución espacial de 0,25 μm/píxel utilizando un objetivo de 25x 1,1 NA y PMT GaAsP.
   4. Encuentre la región de imagen en la que las neuronas R-CaMP (+) y la microglía EGFP (+) se pueden visualizar simultáneamente en la capa 2/3. Para esta configuración, los datos obtenidos en la Figura 4 y el Video 1 estaban a una profundidad de 100 μm desde la superficie pial, utilizando una vista previa de imagen en vivo. Mantenga la potencia del láser de excitación lo más baja posible para evitar el fotoblanqueo y el daño causado por el aumento de la temperatura local en la región de imágenes.
   5. Adquiera imágenes a la velocidad de fotogramas de 30 Hz. Simultáneamente con la adquisición de la imagen, presente un estímulo visual de deriva a 100% de contraste, 1.5 Hz, 0.04 ciclos por grado en 12 direcciones a 6 orientaciones de 0° a 150° en pasos de 30° al mouse¹⁷.
   6. Después de la adquisición de la imagen, retire el mouse de la etapa de microscopio, separe el dispositivo de sombreado y el instrumento estereotáxico del mouse y devuelva el mouse a su jaula doméstica.
3. Registro de datos
   1. Convierta y guarde los datos de imagen adquiridos (formato nd2 en este caso) como una serie de archivos de imagen tiff para cada canal de color, utilizando Fiji o el software suministrado con el microscopio.
   2. Aplique Turboreg, un complemento de Fiji, para realizar el registro con modo = traducción. Utilice la imagen promediada como imagen de referencia con los archivos de imagen tiff del canal EGFP.
   3. Realice el siguiente procesamiento para cada fotograma con MATLAB.
      NOTA: Aunque MATLAB se utiliza en el siguiente procesamiento, la descripción se centra principalmente en la intención de cada paso para que los datos puedan ser analizados por otro software de programación como Python.
      1. Utilice la función imread para leer dos imágenes tiff EGFP antes y después del registro del mismo fotograma, respectivamente. Utilice la función imread para leer la imagen tiff R-CaMP del mismo fotograma.
      2. Utilice la función normcorr2 para calcular la función de correlación entre las variables vectorizadas de las dos imágenes GFP leídas en el paso 4.3.3.1.
      3. Utilice la función max para detectar el índice lineal con la correlación cruzada más alta de la función de correlación y, a continuación, utilice la función ind2sub para calcular la posición de movimiento de la imagen registrada a partir de su imagen original.
      4. Utilice la función imwarp para traducir la imagen R-CaMP a la posición calculada en el paso 4.3.3.3 y, a continuación, utilice la función imwrite para guardar la imagen registrada de R-CaMP.
4. Generación de trazas de calcio
   1. Realice el siguiente procesamiento con MATLAB. Utilice la función imread para leer todas las imágenes tiff R-CaMP registradas generadas en el paso 4.3.3.4. Si las imágenes registradas ya se han cargado como una variable en el espacio de trabajo, omita este paso.
   2. Utilice la función media para generar una imagen de proyección temporal. Utilice la función imshow para mostrar la imagen promediada como una figura; Utilice la función ROIPOLY para generar una máscara de ROI binaria de la estructura objetivo (columna dendrítica en estos datos).
   3. Usando la función media con las imágenes obtenidas multiplicando la máscara binaria con imágenes de cada fotograma como variables de entrada, calcule la intensidad de fluorescencia promediada dentro del ROI para cada fotograma.
   4. Como se describió anteriormente¹⁷, a la variable obtenida en el paso 4.4.3, aplique el filtro de frecuencia de valor de mantequilla en el corte = 1.6 s, para cortar el ruido de alta frecuencia, y luego aplique el filtro mediano deslizante en la ventana de tiempo = 200 s, para cortar el ruido de baja frecuencia.

Resultados

Realizamos la inyección de AAV y la implantación de ventana craneal en V1 de un ratón transgénico CX3XR1-EGFP de 8 semanas de edad como se describe en este protocolo. Cuatro semanas después de la cirugía, realizamos imágenes simultáneas in vivo de dos fotones de la actividad neuronal basada en R-CaMP y la dinámica microglial en la capa 2/3 de V1 (Figura 4 y Video 1). Durante la toma de imágenes, el ratón se colocó en una cinta de correr y se le permitió correr libremente. Las imágenes se adquirieron a una velocidad de fotogramas de 30 Hz con una resolución espacial de 0,25 μm/píxel utilizando un objetivo de 25x, 1,1 NA y PMT de GaAsP. Tanto EGFP como R-CaMP se excitaron a una longitud de onda de 1.000 nm, y la fluorescencia EGFP (filtro de emisión de 525/50 nm) y la fluorescencia R-CaMP (filtro de emisión de 593/46 nm) se recogieron simultáneamente. Después del registro de los datos adquiridos para minimizar los artefactos de movimiento, cada cuatro fotogramas se promediaron en un fotograma para reducir el ruido de fondo. Se presentaron estímulos visuales de rejilla al ratón y se analizaron las respuestas visuales de las neuronas y las espinas dendríticas individuales (Figura 4D). Los procesos microgliales mostraron una dinámica rápida y cambiaron su morfología en 10 s (Figura 4E y Video 1). Como se detalla en la sección Discusión, cuando falló la inyección de AAV, no se pudo detectar la expresión de R-CaMP. Si la cirugía no fue exitosa, no se pudieron observar las señales de EGFP y R-CaMP.

Figura 1: Inyección de AAV . (A) Se conectó una pipeta de vidrio a una jeringa Hamilton de 26 G utilizando un tubo de silicona. (B) La configuración para la inyección de AAV. (C) La solución de AAV se inyectó a través de la pipeta de vidrio inclinada 60° anteriormente desde el eje vertical. (D) Diagrama esquemático del procedimiento de cráneo abierto (descrito en el paso 3.3). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Ventana craneal y placa frontal . (A) Diagrama esquemático de implantación de ventana craneal. (B) Se utilizaron placas de cabeza hechas a medida. Para obtener imágenes en el hemisferio derecho, se debe usar el brazo más corto en el lado derecho. (C) Vista dorsal de un ratón con una ventana craneal y una placa de cabeza implantada. (D) Vista de gran aumento de la ventana craneal que se muestra en la Figura 2C. (E) Vista dorsal de un ratón fijado con el instrumento estereotáxico hecho a medida. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: La configuración para imágenes in vivo de dos fotones. (A) Vista dorsal del dispositivo de sombreado. (B) Vista lateral del dispositivo de sombreado. (C) Vista de un ratón con el dispositivo de sombreado en la placa de la cabeza debajo de la lente del objetivo. El ratón se coloca en la cinta de correr. (D) Ver bajo el microscopio de excitación de dos fotones. Un monitor que presenta estímulos visuales se coloca en el lado derecho de la figura. La lente del objetivo está cubierta con el dispositivo de sombreado y papel de aluminio negro para evitar que la luz del monitor llegue a la lente del objetivo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Dinámica microglial y respuestas visuales en una columna dendrítica. (A-C) Imágenes promediadas en el tiempo de microglía EGFP (+) y neuronas R-CaMP (+) en la capa 2/3 de V1 en un ratón transgénico CX3XR1-EGFP de 12 semanas de edad. La intensidad de la señal en cada canal se normalizó de forma independiente. (D) Respuestas visuales en una columna dendrítica. Los diagramas de rayas con flechas negras indican la dirección de los estímulos de rejilla presentados en el tiempo indicado por columnas grises. En las trazas de calcio, las líneas grises indican respuestas individuales, y una línea negra indica su promedio. En el recuadro derecho, una punta de flecha amarilla indica la columna dendrítica en la que se generó la región de interés (ROI) para adquirir las trazas de calcio. (E) El proceso microglial (punta de flecha cian) mostró una rápida retracción en 10 s. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Video 1: Imágenes de dos fotones de la actividad neuronal y la dinámica microglial. Datos de imágenes de microglía EGFP(+) y neuronas R-CaMP(+) en la capa 2/3 de V1 en un ratón transgénico CX3XR1-EGFP de 12 semanas de edad. En el lado izquierdo de la película, magenta indica R-CaMP en las neuronas, y el verde indica EGFP en la microglía. El centro de la película corresponde a la señal EGFP, y el lado derecho corresponde a la señal R-CaMP. La intensidad de la señal en cada canal se normalizó de forma independiente. La velocidad de fotogramas de la película es 40 veces más rápida que la velocidad real. Barra de escala = 10 μm Haga clic aquí para descargar este video.

Discusión

Describimos el protocolo de inyección de AAV y craneotomía para imágenes simultáneas de la dinámica microglial y la actividad neuronal en ratones despiertos, así como el procesamiento de datos. Esta técnica puede descubrir la coordinación entre la dinámica microglial y la actividad neuronal en escalas de tiempo que van desde subsegundos hasta decenas de segundos.

El protocolo de cirugía implica varios pasos técnicamente exigentes. La inyección de AAV es uno de los pasos críticos. La inyección fallida de AAV puede causar una reducción significativa en la expresión de R-CaMP. Hay dos razones principales: pipetas de vidrio obstruidas y daño tisular. La obstrucción de las pipetas de vidrio reduce o bloquea completamente la expulsión de la solución AAV. Esta situación se puede evitar coloreando la solución AAV con un tinte como verde rápido y confirmando visualmente el éxito de la inyección. El daño tisular causado por la inyección de AAV impide la expresión génica exógena cerca del centro del sitio de inyección. Es probable que el daño inducido por la inyección de AAV sea causado por un aumento repentino en el flujo de salida de la punta de la pipeta de vidrio después de la acumulación de la presión dentro de la pipeta. Por lo tanto, la salida de la solución de AAV de la pipeta de vidrio debe ser constante durante la inyección. La selección de pipetas de vidrio con un diámetro ligeramente más ancho en sus puntas resolvería este problema. En la implantación de ventana craneal, la velocidad de la cirugía es crítica. Si la cirugía toma demasiado tiempo, el tejido cerebral puede dañarse gravemente. En consecuencia, la práctica repetida es necesaria para garantizar la velocidad y la suavidad de la cirugía. Además, durante las 4 semanas desde la cirugía hasta la imagen, la calidad de las imágenes puede ser reducida por la regeneración tisular entre la ventana craneal y el tejido cerebral por el método convencional¹⁷. El método aquí supera este problema mediante la aplicación de vidrios gruesos para el disco de vidrio interior de las ventanas craneales para inhibir la regeneración de tejidos y mantener la ventana despejada. En el sistema descrito aquí, este efecto fue evidente mediante el uso de un disco de vidrio interior con un espesor de 0,525 ± 0,075 μm.

El método se puede aplicar con éxito a ratones mayores de 4 semanas, pero la aplicación a ratones más jóvenes puede ser problemática. En ratones jóvenes, el cráneo muestra un crecimiento rápido y prominente, lo que induce un desajuste entre el hueso craneal y la ventana de vidrio.

En algunos estudios de vanguardia, se utilizaron imágenes in vivo de dos fotones para estudiar las interacciones microglia-neurona 12,21,23. Especialmente en el trabajo pionero de Merlini et al., realizaron imágenes simultáneas in vivo de la dinámica microglial y la actividad neuronal dentro de los cuerpos celulares²¹. En este método, mediante el uso de vidrios interiores más gruesos para ventanas craneales, podríamos suprimir artefactos de movimiento en la orientación de profundidad y lograr la medición estable de la actividad neuronal en microestructuras, como las espinas dendríticas. Este método ayudaría a investigar las interacciones del proceso sinapsis-microglial en ratones despiertos.

Recientemente, un estudio in vitro demostró que los procesos microgliales delgados similares a filopodios tienen una motilidad más rápida que los procesos gruesos, lo que sugiere la importancia de su motilidad más rápida en la vigilancia¹⁹. El sistema aquí puede rastrear la motilidad de procesos microgliales delgados con una resolución temporal de menos de un segundo a unas pocas decenas de segundos. Esta propiedad ayuda a dilucidar el significado funcional de su motilidad para la vigilancia in vivo.

En el futuro, la combinación de esta técnica de imagen con intervenciones, como la optogenética²⁴ o la quimiogenética²⁵, aplicadas a circuitos neuronales locales o conexiones neuronales interregionales arrojaría luz sobre nuevas funciones microgliales en el desarrollo sináptico y la plasticidad que esculpen las características de los circuitos neuronales. Además, una mayor integración de las imágenes, la intervención y las tareas conductuales contribuiría a revelar la coordinación de la microglía y las neuronas subyacentes a comportamientos específicos.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
10-inch LCD monitor	EIZO	DuraVision FDX1003	For presenting grating visual stimuli
26G Hamilton syringe	Hamilton	701N
27G needle	Terumo	NN-2719S
AAV-hSyn-R-CAMP1.07	N/A	N/A	Kindly gifted from Prof. Matsuzaki's laboratory
Activated charcoal powder	Nacalai tesque	07909-65
Black aluminum foil	THORLABS	BKF12
CX3CR1-EGFP mouse	Jackson laboratory	IMSR_JAX: 005582	CX3CR-1EGFP/+ knock-in/knock-out mice expressing EGFP in microglia in the brain under the control of the endogenous Cx3cr1 locus.
DENT SILICONE-V	Shofu Inc	N/A	For the attachment of a shading device to a head-plate
Dental cement (quick resin, liquid)	Shofu Inc	N/A	AB
Dental cement(quick resin, powder)	Shofu Inc	N/A	B Color 3
Drill	Toyo Associates	HP-200
Glass capillary pipette	Drummond Scientific Company	2-000-075
Glass disc (large)	Matsunami	N/A	4mm in diameter, 0.15±0.02mm in thickness
Glass disc (small)	Matsunami	N/A	2mm in diameter, 0.525±0.075mm in thickness
Head-plate	Customized	N/A	Material: SUS304, thickness: 0.5mm, see Figure2B for the shape
Hemostatic fiber	Davol Inc	1010090
ImageJ Fiji software		Free software	For data registration
Instant glue (Aron alpha)	Daiichi Sankyo	N/A
Isoflurane	Pfizer	N/A
Lidocaine	Astrazeneca	N/A
MATLAB 2017b	MathWorks	N/A	For data registration and processing
Meloxicam	Tokyo Chemical Industry	M1959
Microinjector	KD scienfitic	KDS-100
Micropipette puller	Sutter Instrument Company	P-97
Multi-photon excitation microscope	NIKON	N/A	The commercial name is "A1MP+".
Objective lens	NIKON	N/A	The commercial name is "CFI75 apochromat 25xC W".
Paraffin Liquid	Nacalai tesque	26132-35
Psychtoolbox		Free software	For presenting grating visual stimuli
Shading device	Customized	N/A
Stereomicroscope	Leica	M165 FC
Stereotaxic instrument	Narishige Scientific Instrument	SR-611	For the surgery
Stereotaxic instrument	Customized	N/A	For fixing mice under the two-photon microscope
Stopcock	ISIS	VXB1079
Surgical silk	Ethicon	K881H
Treadmill	Customized	N/A
UV light curing agent	Norland Products Inc	NOA 65
Vaporizer	Penlon	Sigma Delta	Anesthetic machine