Selección in vitro de aptámeros para diferenciar virus infecciosos de virus no infecciosos

Resumen

Proporcionamos un protocolo que generalmente se puede aplicar para seleccionar aptámeros que se unen solo a virus infecciosos y no a virus que se han vuelto no infecciosos mediante un método de desinfección o a cualquier otro virus similar. Esto abre la posibilidad de determinar el estado de infectividad en pruebas portátiles y rápidas.

Resumen

Las infecciones por virus tienen un gran impacto en la sociedad; La mayoría de los métodos de detección tienen dificultades para determinar si un virus detectado es infeccioso, lo que provoca retrasos en el tratamiento y una mayor propagación del virus. El desarrollo de nuevos sensores que puedan informar sobre la infectabilidad de muestras clínicas o ambientales enfrentará este desafío no cumplido. Sin embargo, muy pocos métodos pueden obtener moléculas de detección que puedan reconocer un virus infeccioso intacto y diferenciarlo del mismo virus que se ha vuelto no inactivo por métodos de desinfección. Aquí, describimos un protocolo para seleccionar aptámeros que puedan distinguir virus infecciosos de virus no infecciosos utilizando la evolución sistemática de ligandos por enriquecimiento exponencial (SELEX). Aprovechamos dos características de SELEX. En primer lugar, SELEX se puede hacer a medida para eliminar objetivos competidores, como virus no infecciosos u otros virus similares, utilizando la selección de contadores. Además, todo el virus se puede utilizar como objetivo de SELEX, en lugar de, por ejemplo, una proteína de superficie viral. Virus completo SELEX permite la selección de aptámeros que se unen específicamente al estado nativo del virus, sin la necesidad de interrumpir el virus. Por lo tanto, este método permite obtener agentes de reconocimiento basados en diferencias funcionales en la superficie de los patógenos, que no necesitan ser conocidas de antemano.

Introducción

Las infecciones por virus tienen enormes impactos económicos y sociales en todo el mundo, como se hizo cada vez más evidente a partir de la reciente pandemia de COVID-19. El diagnóstico oportuno y preciso es primordial en el tratamiento de infecciones virales y al mismo tiempo previene la propagación de virus a personas sanas. Si bien se han desarrollado muchos métodos de detección de virus, como las pruebas de PCR^1,2 y los inmunoensayos^3, la mayoría de los métodos utilizados actualmente no son capaces de determinar si el virus detectado es realmente infeccioso o no. Esto se debe a que ....

Protocolo

1. Preparación de reactivos y tampones

1. Prepare 10x Tris-borrate EDTA (10x TBE) agregando 0.9 M Tris-base, 0.9 M de ácido bórico, 20 mM EDTA (sal disódica) y agua desionizada a un volumen final de 1 L. Mezcle hasta que todos los componentes se disuelvan.
2. Prepare una solución madre de poliacrilamida desnaturalizante al 10% de la siguiente manera. En una botella de vidrio de 250 ml, agregue 120 g de urea (8 M), 25 ml de 10x TBE, 62.5 ml de solución de acrilamida/bisacrilamida al 40% (29:1) y suficiente agua destilada para alcanzar el volumen final de 250 ml. Mezclar hasta que todos los componentes se disuelvan.
3. Prepare el bú....

Resultados

Dado que los aptámeros de ADN se pueden obtener utilizando SELEX en un tubo de ensayo¹⁵, esta estrategia de SELEX fue cuidadosamente diseñada para incluir pasos de selección positiva hacia el virus infeccioso intacto y completo (es decir, retener las moléculas de ADN que se unen al virus infeccioso), así como pasos de contraselección para el mismo virus que se ha vuelto no infeccioso por un método de desinfección particular. específicamente el tratamiento UV, descartando las secuencias d.......

Discusión

SELEX permite no sólo la identificación de aptámeros con alta afinidad, en el rango pM-nM 22,43,44,45^, sino también con alta y sintonizable selectividad. Al aprovechar la contraselección, se pueden obtener aptámeros con selectividad desafiante. Por ejemplo, el grupo Li ha demostrado la capacidad de obtener secuencias que pueden diferenciar cepas bacterianas patógenas de cepas no patóge.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Ammonium persulfate (APS)	BioRad	1610700
100% Ethanol	Sigma-Aldrich	E7023
1x PBS without calcium & magnesium	Corning	21-040-CM
40% acrylamide/bisacrylamide (29:1) solution	BioRad	1610146
Agencourt AMPure XP Beads	Beckman Coulter	A63880	DNA clean-up beads - Section 7.2.2
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit	Merck	UFC501024	cut-off 10 kDa
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit	Merck	UFC510024	cut-off 100 kDa
Boric Acid	Sigma-Aldrich	100165
C1000 Touch Thermal Cycler with Dual 48/48 Fast Reaction Module	BioRad	1851148
Calcium Chloride	Sigma-Aldrich	C4901
CFX Connect Real-Time PCR Detection System	BioRad	1855201
Digital Dry Baths/Block Heaters	Thermo Scientific	88870001
Dynabeads MyOne Streptavidin C1	Thermo Fisher	65001	streptavidin-modified magnetic beads - Section 4.9
EDTA disodium salt	Sigma-Aldrich	324503
Eppendorf Safe-Lock microcentrifuge tubes	Sigma-Aldrich	T9661	1.5 mL
Lenti-X p24 Rapid Titer Kit	Takara Bio USA, Inc.	632200	Lentivirus quantification kit - Section 3.3.2.1
MagJET Separation Rack, 12 x 1.5 mL tube	Thermo Scientific	MR02
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	M8266
Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical	BioRad	MSB1001	non-UV absorbing
Mini-PROTEAN Tetra Cell for Ready Gel Precast Gels	BioRad	1658004EDU
Mini-PROTEAN Short Plates	BioRad	1653308
Mini-PROTEAN Spacer Plates with 0.75 mm Integrated Spacers	BioRad	1653310
Molecular Biology Grade Water	Lonza	51200
Multiplate 96-Well PCR Plates, high profile, unskirted, clear	BioRad	MLP9611
Nanodrop One	Thermo Scientific	ND-ONE-W
OneTaq DNA Polymerase	New England BioLab	M0480S
Ovation Ultralow v2 + UDI	Tecan	0344NB-A01	High-troughput sequencing library preparation kit - Section 7.2.
PIPETMAN G (100-1000 µL, 20-200 µL, 2-20 µL and 0.2-2 µL)	Gilson	F144059M, F144058M, F144056M, F144054M
Purifier Logic+ Class II, Type A2 Biosafety Cabinets	Labconco	4261
Qubit dsDNA BR Assay Kit	Invitrogen	Q32850	fluorescence-based  dsDNA quantification  kit - Section 7.2.3
SHARP Classic Low Retention Pipet Tips (10 uL, 200 uL, 1000 uL)	Thomas Scientific	1158U43, 1159M44, 1158U40
Sodium acetate	Sigma-Aldrich	S2889
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S7653
Sorvall Legend Micro 17R Microcentrifuge	Thermo Scientific	75002440
SsoFast EvaGreen Supermix	BioRad	1725201	qPCR mastermix - Section 6.2.
Tris(hydroxymethyl)aminomethane	Sigma-Aldrich	T1503
Tubes and Ultra Clear Caps, strips of 8	USA scientific	AB1183	PCR tubes
Urea	Sigma-Aldrich	U5128