Un modelo experimental de infarto de miocardio para el estudio de la reparación y remodelación cardíaca en ratones knockout

Resumen

En este trabajo describimos un modelo experimental de infarto de miocardio, un procedimiento de ecocardiografía para estudiar el remodelado y la función cardíaca, y procedimientos para cuantificar la fibrosis y la hipertrofia en secciones teñidas con rojo picrosirius y rodamina, así como el tamaño del infarto y el índice de expansión en cortes teñidos con tricrómico de Masson.

Resumen

Las enfermedades cardiovasculares son la causa más prevalente de muerte en los países occidentales, siendo el infarto agudo de miocardio (IM) la forma más prevalente. En este trabajo se describe un protocolo para estudiar el papel de la galectina 3 (Gal-3) en la evolución temporal de la cicatrización y remodelación cardíaca en un modelo animal experimental de infarto de miocardio.

Los procedimientos descritos incluyen un modelo experimental de IM con ligadura coronaria permanente en ratones machos C57BL/6J (control) y Gal-3 knockout (KO), un procedimiento de ecocardiografía para estudiar el remodelado cardíaco y la función sistólica in vivo, una evaluación histológica de la fibrosis miocárdica intersticial con cortes teñidos con rojo picrosirius y teñidos con lectina conjugada con rodamina para estudiar la hipertrofia de miocitos por el área de la sección transversal (MCSA), y la cuantificación del tamaño del infarto y del remodelado cardíaco (adelgazamiento de la cicatriz, grosor del tabique e índice de expansión) mediante planimetría en cortes teñidos con tricrómico de Masson y cloruro de trifenil tetrazolio. Gal-3 Los ratones KO con infarto de miocardio mostraron una remodelación cardíaca interrumpida y un aumento en la relación de adelgazamiento de la cicatriz y el índice de expansión. Al inicio del infarto de miocardio, la función miocárdica y el remodelado cardíaco también se vieron gravemente afectados. A las 4 semanas después del infarto de miocardio, la evolución natural de la fibrosis en ratones Gal-3 KO infartados también se vio afectada.

En resumen, el modelo experimental de IM es un modelo adecuado para estudiar la evolución temporal de la reparación y remodelación cardíaca en ratones con deleción genética de Gal-3 y otros modelos animales. La falta de Gal-3 afecta la dinámica de la reparación cardíaca e interrumpe la evolución de la remodelación y la función cardíaca después del infarto de miocardio.

Introducción

El infarto de miocardio (IM) es la forma más prevalente de enfermedad cardiovascular. Después del infarto de miocardio, el miocardio experimenta cambios morfológicos y funcionales en serie, incluyendo la curación de la zona del infarto de miocardio, el remodelado ventricular (VR) y la disfunción miocárdica¹. La cicatrización del infarto de miocardio es un proceso dinámico y bien orquestado asociado a una profunda infiltración inflamatoria que termina en la formación de una cicatriz fibrótica ^2,3. El modelo experimental de IM en ratones se utiliza actualmente para el estudio del remodelado cardíaco en condiciones patológicas ^4,5, y el conocimiento del protocolo quirúrgico preciso es esencial para desarrollar un procedimiento reproducible y eficaz para la inducción de una ligadura coronaria permanente. Este método es necesario para estudiar la curación del IM y su relevancia en la evolución temporal del remodelado del ventrículo izquierdo (VI) y la disfunción cardíaca asociada al IM.

Las galectinas son un grupo de lectinas que reconocen carbohidratos específicos en ligandos intracelulares, receptores de membrana y glicoproteínas extracelulares. La galectina 3 (Gal-3) es un miembro de esta familia que actúa a través del reconocimiento y entrecruzamiento de N- y O-glicanos en glicoconjugados en la superficie celular, y se expresa ampliamente en el sistema inmune⁶. Estudios previos han investigado el papel de Gal-3 como regulador de la inflamación y la fibrosis en las enfermedades cardiovasculares 7,8,9,10,11,12. Dado que es muy relevante dirigirse a los factores reguladores de la inflamación durante la cicatrización, ya que la inflamación puede afectar notablemente a la evolución de la remodelación, nos propusimos describir un protocolo para estudiar la evolución temporal de la remodelación ventricular post-IM y los pasos y métodos para determinar cómo la mutación genética de Gal-3 modifica la evolución temporal de la curación en el IM y afecta a la remodelación y función cardíaca en ratones.

Protocolo

NOTA: Todos los experimentos descritos en este protocolo fueron aprobados por el Comité de Cuidado e Investigación Animal de la Universidad de Buenos Aires (CICUAL), en línea con el Comité para la Actualización de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio del Consejo Nacional de Investigaciones (EE.UU.)¹³. Para los experimentos, se utilizaron ratones machos C57BL/6J y Gal-3 KO de la misma edad (8-10 semanas de edad) con un peso de 30-35 g, que permiten una mejor manipulación para la cirugía. Permitir que los animales tengan acceso a agua y comida ad libitum. Los ratones Gal-3 KO se criaron en un fondo C57BL/6J en las mismas instalaciones de recursos biológicos que los ratones C57BL/6J de control.

1. Área quirúrgica e instrumental

1. Antes de comenzar la cirugía, verifique que el ventilador esté enchufado a una fuente de alimentación y que funcione correctamente. Confirme que haya suficiente solución anestésica. Prepare la solución el día de la cirugía calculando el número de animales que se utilizarán.
2. Confirme que todos los instrumentos quirúrgicos estén esterilizados, incluidas las tijeras de acero inoxidable, las microtijeras, los portaagujas para agujas grandes y pequeñas, los retractores, las pinzas curvas extra afiladas, las pinzas dentadas y las pinzas de tejido. Limpie el área de trabajo con etanol al 70%.
3. Asegure la disponibilidad de pequeñas bolas de algodón, hisopos y gasas para la cauterización inmediata de cualquier posible hemorragia.
4. Mantenga preparadas suturas de seda trenzadas recubiertas de silicona 10-0 a 7-0 para la ligadura de la arteria coronaria descendente izquierda (LDA), sutura de nailon para el cierre del tórax e hilo de lino para cerrar la piel.

2. Anestesia e intubación

1. Pesar a los ratones para determinar la dosis de anestesia.
2. Precaliente una almohadilla térmica rodeada por una base de espuma de poliestireno a 40 °C.
3. Anestesiar a los ratones con la administración intramuscular de 0,1 mL/10 g de peso corporal de una solución que contenga ketamina (65 mg/kg), xilacina (13 mg/kg) y acepromazina (1,5 mg/kg).
4. Una vez anestesiado el ratón y antes de iniciar el procedimiento quirúrgico, se comprueba la profundidad anestésica induciendo un estímulo ligeramente doloroso, como por ejemplo presionando los pies con los dedos. Si el animal responde al estímulo, ajuste la profundidad del anestésico.
5. Coloque el ratón en decúbito dorsal y pegue sus patas a la base de trabajo sobre la almohadilla térmica, colocándolo debajo de un microscopio estereoscópico binocular. Hiperextienda el cuello con una rosca que sujete los dientes maxilares unidos a la base de trabajo.
6. Luego, para la parte de intubación, exponer los anillos de la tráquea a través de una incisión mínima en el cuello, y canalizarlos con un catéter intravenoso de 20 G conectado a un ventilador de roedores (volumen corriente: 250 mL/braz) a una frecuencia respiratoria de 34-38 ciclos/min, como se describió anteriormente¹⁴.
7. Colocar al animal en decúbito lateral para realizar la toracotomía lateral izquierda en el cuarto o quinto espacio intercostal. Hacer una incisión en la piel del animal; Observe los músculos de abajo y extiéndalos con cuidado para separarlos de la pared torácica y ver claramente el espacio intercostal. En este punto, asegúrese de que el animal esté correctamente conectado al ventilador; Luego, abra el espacio intercostal haciendo un agujero con las pinzas extra afiladas.
   NOTA: La LDA debe ser identificable a lo largo de la pared libre del ventrículo izquierdo (VI) en los espacios intercostales mencionados anteriormente.
8. Realizar la pericardiectomía e identificar la LDA contrastando las arterias coronarias con las venas coronarias y la ramificación de la LDA por debajo de la aurícula izquierda. A continuación, realiza la ligadura de la LDA utilizando el 8-0 hilo de seda a ~2 mm del borde de la aurícula. Finalmente, cierre el tórax por capas con el hilo de seda 6-0 -cierre las costillas, asegurándose de que no haya neumotórax en el interior (hágalo con cuidado forzando los pulmones a expandirse con el ventilador) y acérquese a los músculos o suturarlos antes de cerrar la piel.
9. Una vez cerrada la piel, desconecte lentamente el ratón del ventilador en decúbito ventral y retire el tubo endotraqueal cuando se haya recuperado la frecuencia respiratoria. Deje que el animal se recupere de la anestesia en un ambiente tranquilo y, preferiblemente, con una temperatura ambiente estable a 27 °C.
10. Espere a que los animales se recuperen de la anestesia, comiencen a mover sus extremidades y a que se restablezca su frecuencia respiratoria normal. Luego, alójalos en jaulas individuales hasta el final del protocolo.
11. Realizar el mismo procedimiento en los animales de control o operados simuladamente, pero sin la ligadura de la LDA.

3. Diseño del estudio

1. Para probar la evolución temporal de la cicatrización y la remodelación ventricular después del infarto de miocardio, aleatorice a los ratones en los siguientes grupos:
   1. Para estudiar la fase temprana de la remodelación ventricular después de 1 semana de evolución del IM, asigne los ratones a los siguientes grupos: 1) C57 Sham (1 semana); 2) Gal-3 KO Sham (1 semana); 3) C57 MI (1 semana); 4) Gal-3 KO MI (1 semana).
   2. Para estudiar la fase tardía de la remodelación ventricular a las 4 semanas de infarto de miocardio, asigne a los ratones a los siguientes grupos: 5) C57 Sham (4 semanas); 6) Gal-3 KO Sham (4 semanas); 7) C57 MI (4 semanas); 8) Gal-3 KO MI (4 semanas).

4. Ecocardiografía

NOTA: Para los ecocardiogramas de ratón, se deben utilizar transductores lineales de más de 10 MHz para una visualización adecuada de los diámetros de las paredes y los tamaños de las cavidades. Este procedimiento se puede realizar bajo anestesia con avertina intraperitoneal (IP) a 1,15 mL/kg o en animales conscientes. Sin embargo, esto último puede conducir a resultados confusos en ratones con infarto de miocardio debido al estrés y la ansiedad causados por la manipulación.

1. Para anestesiar a un ratón, levántalo, sujétalo con la espalda hacia la palma de la mano y gíralo para que llegue a la superficie del abdomen. En esa posición, inyecte la anestesia IP en un ángulo de 45° entre el animal y la aguja subcutánea.
2. Una vez que el ratón esté anestesiado, aféitese el pecho y colóquelo sobre una almohadilla térmica precalentada en la posición de decúbito dorsal. Para obtener vistas paraesternales de eje largo y eje corto, mueva el transductor 90°. Una vez obtenida la vista correcta del eje, coloque el cursor a nivel del músculo papilar, pulse la tecla de modo M 2D para capturar las imágenes y utilice un software de análisis de imágenes para medir los siguientes parámetros:
   1. Mida las dimensiones del ventrículo izquierdo, incluido el grosor de la pared (LVWT), las áreas del VI tanto en sístole (S) como en diástole (D), y el área diastólica del ventrículo izquierdo (LVDA) y el área sistólica del ventrículo izquierdo (LVSA) en al menos tres latidos.
   2. Además, calcule la función ventricular por la fracción de eyección (FE, %), la fracción de acortamiento (SF, %) y la masa cardíaca (suponga un cubo no corregido) utilizando la ecuación (1), la ecuación (2) y la ecuación (3), como se describió anteriormente¹⁵.
      SF (%) = ([LVEDD - LVESD]/LVEDD) × 100 (1)
      EF (%) = ([LVDA - LVSA]/LVDA) × 100 (2)
      Masa del VI = 1,055 × ([IVST + LVEDD + PWT]³− [LVEDD]³) (3)
      Donde la DAVI es el diámetro telediastólico del ventrículo izquierdo, la DAVI es el diámetro telesistólico del ventrículo izquierdo, la IVST es el grosor intraventricular y la PWT es el grosor de la pared posterior.

5. Evaluación histológica

1. Durante la necropsia, se extrae el corazón del animal abriendo el tórax de lado a lado y cortando todas las estructuras que lo rodean. Limpie el coágulo de sangre que se encuentra dentro de las cavidades aplicando una presión suave con papel de seda.
2. Coseche y pese el corazón en una báscula de precisión de laboratorio. Sumérjalo en formaldehído al 10% durante al menos 72 h a temperatura ambiente. Cortar el corazón manualmente desde el ápice hasta la base en rodajas transversales de 1 mm de grosor con una cuchilla y procesar las rodajas incrustándolas en parafina. Realice cortes en serie en las secciones incrustadas en parafina de 5 μm de espesor con un micrótomo.
3. Coloque cada sección entre portaobjetos y tíñelas con hematoxilina y eosina (H&E), tricrómico de Masson, secciones teñidas con lectina conjugadas con rodamina o rojo Picrosirius^15,16.
   1. Mediante el uso de un fotomicroscopio adecuado, tome imágenes digitalizadas a 400x para la morfometría, la fibrosis y la cuantificación de MCSA. Verifique que el microscopio esté conectado a una cámara digital y a una computadora con software de análisis de imágenes. Para cada análisis morfométrico, asegúrese de que las imágenes estén en las mismas áreas, con un mínimo de 10 campos de alta potencia a 400x por sección (tabique, zona infartada y zona remota) y sin superponer los campos.
      1. Para medir el MCSA, tenga en cuenta las posiciones de los miocitos cardíacos y cuente solo los miocitos que están cortados transversalmente y rodeados por al menos tres capilares cercanos.
      2. En las rodajas teñidas de rojo de Picrosirius, identifique las áreas de la cicatriz y el tabique, e identifique el colágeno intersticial en ambas zonas. Cargue las imágenes en el software de análisis y abra la pestaña de umbral para resaltar todas las áreas de colágeno positivas y negativas Para obtener los datos, presione la pestaña de medición y guarde los resultados. Para el cálculo del porcentaje de colágeno por región, utilice la ecuación (4), y sume las zonas positivas para colágeno y divídalas por el tejido total, incluidas las áreas positivas para colágeno, como se describe en otra parte^15,16.
         Colágeno (%) = Área roja de Picrosirius/Área total del tejido (4)
      3. Cuantificar el MCSA a partir de las imágenes digitalizadas obtenidas de las secciones teñidas con lectina conjugadas con rodamina de las muestras incluidas en parafina. Para obtener la imagen correcta, utilice un software de análisis de imágenes para trazar los contornos rojos de los miocitos que rodean las membranas celulares. Seleccione la pestaña de área , trace los contornos y presione la función de pestaña de medición . Por último, guarde los resultados de las áreas de celda¹⁶.

6. Determinación cuantitativa del tamaño del infarto y planimetría para evaluar el remodelado cardíaco

1. Medir el tamaño del infarto de miocardio, el grosor de la pared y la longitud de las circunferencias endocárdicas y epicárdicas mediante planimetría a partir de las imágenes histológicas de los cortes tricrómicos de Masson obtenidas con un microscopio óptico (4x) y el software adecuado.
   1. Para la cuantificación del tamaño del infarto, identifique la zona de infarto (azul) y la zona remota (rojo). Trace y mida la longitud total de la zona del infarto y la zona remota en los lados endocárdico y epicárdico. Calcular el promedio de los trazados endocárdicos y epicárdicos como porcentaje de la circunferencia total del VI¹⁷.
   2. De manera similar, mida el grosor de la cicatriz (el promedio de cinco mediciones equidistantes) y el grosor del tabique (el promedio de tres mediciones equidistantes) en una sección media del corazón, y use estas mediciones para determinar la relación de espesor de la cicatriz (ecuación [5]) y el índice de expansión (ecuación [6]¹⁸).
      NOTA: Todos los valores se pueden registrar en una hoja de cálculo.
      Relación entre el grosor de la cicatriz = el grosor de la cicatriz/espesor del tabique (5)
      Índice de expansión = (área de la cavidad del VI/área total del VI) × (espesor del tabique/espesor de la cicatriz) (6)
      NOTA: Dado que la remodelación puede modificar la expansión, lo que resulta en una subestimación o sobreestimación del tamaño del infarto, puede ser necesario algún tiempo para realizar un experimento piloto para medir el tamaño del infarto a las 24 h, seguido de la eutanasia. En este caso, anestesiar al animal con la misma solución anestésica IP utilizada para el procedimiento de infarto de miograma.
2. Colocar al animal en decúbito dorsal e intubarlo como se describió anteriormente. Una vez que el animal está anestesiado, se realiza una incisión diagonal profunda que llega a la piel, los músculos y los huesos costales desde la apófisis xifoides hasta el hueco axilar.
3. Aísle el arco aórtico, haga un pequeño orificio en la aorta ascendente e introduzca un catéter para perfundir el corazón con el azul de Evan. Luego, retire manualmente el corazón manchado del animal y córtelo desde el ápice hasta la base con una cuchilla afilada. Colocar las rodajas de corazón en cloruro de trifeniltetrazolio (TTC) al 1% en tampón fosfato isotónico (pH 7,4) e incubar a 37 °C durante 30 min ⁴ para confirmar que los animales son comparables en cuanto al tamaño del infarto.

Resultados

Supervivencia post-infarto de miocardio y necropsia
Durante 4 semanas de seguimiento, el 17% (4/23) de los ratones C57 frente al 40% (8/20) de los ratones Gal-3 KO fueron encontrados muertos. Se realizó la necropsia; los ratones Gal-3 KO muertos mostraron corazones más grandes que los ratones C57 (Figura 1), y el 38% de los ratones C57 en comparación con el 32% de los ratones Gal-3 KO tenían coágulos torác...

Discusión

El modelo experimental de infarto de miocardio por ligadura permanente de la arteria coronaria se utiliza para estudiar una amplia variedad de mecanismos fisiopatológicos de reparación y remodelación cardíaca ^5,14,17. En este artículo se resumen los diferentes métodos utilizados actualmente en este laboratorio para estudiar la evolución temporal de la reparación cardíaca y sus efectos e...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
8-0 silk suture	Ethicon
C57BL/6J mice	Department of Bioresources of the Faculty of Veterinary of the University of Buenos Aires, Argentina
Forceps
Hardvard 386 respirator	Hardvard company
Heating pad			maintain animal's temperature during surgery
Image Pro-Plus 6.0	Media Cybernetics		Image Analysis Software
Ketamine	Holiday
Masson Trichrome	BIOPUR
Picrosirius red	BIOPUR
Retractors
Rodent Ventilator Model 683	Harvard Apparatus		Mechanical ventilator
Scissors
Stereoscopic magnifying glass	Arcano
Vivid 7 machine (General Electric Medical Systems, Horten, Norway)	General Electric		Any tracking software can be utilized with this protocol
WGA no. RL-1022, Vector Laboratories, Burlingame	Vector Laboratories
Xylazine	Pro-Ser