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Resumen

Aquí, se presenta un método fácil de seguir para cultivar células epiteliales pigmentarias primarias de la retina porcina in vitro .

Resumen

El epitelio pigmentario de la retina (EPR) es una monocapa de células epiteliales pigmentadas polarizadas, ubicadas entre la coroides y la neuroretina en la retina. El RPE realiza diariamente múltiples funciones, incluyendo fagocitosis, transporte de nutrientes/metabolitos, metabolismo de la vitamina A, etc. Las células del EPR son células epiteliales terminalmente diferenciadas con poca o ninguna capacidad regenerativa. La pérdida de células del EPR da lugar a múltiples enfermedades oculares que conducen a la discapacidad visual, como la degeneración macular relacionada con la edad. Por lo tanto, el establecimiento de un modelo de cultivo in vitro de células primarias del EPR, que se asemeje más al EPR in vivo que a las líneas celulares, es fundamental para los estudios característicos y mecanicistas de las células del EPR. Teniendo en cuenta el hecho de que la fuente de globos oculares humanos es limitada, creamos un protocolo para cultivar células primarias de EPR porcino. Mediante el uso de este protocolo, las células RPE se pueden disociar fácilmente de los globos oculares porcinos adultos. Posteriormente, estas células disociadas se adhieren a placas / inserciones de cultivo, proliferan para formar una monocapa confluente y restablecen rápidamente las características clave del tejido epitelial in vivo dentro de las 2 semanas. Mediante qRT-PCR, se demuestra que las células primarias del EPR porcino expresan múltiples genes de firma a niveles comparables con el tejido RPE nativo, mientras que las expresiones de la mayoría de estos genes se pierden/se reducen altamente en las células humanas similares al EPR, ARPE-19. Además, la tinción de inmunofluorescencia muestra la distribución de la unión estrecha, la polaridad tisular y las proteínas del citoesqueleto, así como la presencia de RPE65, una isomerasa crítica para el metabolismo de la vitamina A, en células primarias cultivadas. En conjunto, hemos desarrollado un enfoque fácil de seguir para cultivar células primarias de EPR porcino con alta pureza y características nativas de EPR, que podría servir como un buen modelo para comprender la fisiología del EPR, estudiar las toxicidades celulares y facilitar las pruebas de detección de fármacos.

Introducción

El epitelio pigmentario de la retina (EPR) se encuentra entre los fotorreceptores y el coriocapilar en la capa externa de la retina1 con múltiples funciones, incluida la formación de la barrera hematoretiniana, el transporte e intercambio de nutrientes y metabolitos retinianos, el reciclaje de vitamina A para mantener un ciclo visual normal, y la fagocitosis y eliminación de los segmentos externos fotorreceptores (POS) desprendidos2,3 . Dado que los POS requieren una auto-renovación constante para generar visión, las células RPE necesitan engullir continuamente POS separados para mantener la homeostasis retiniana4. Por lo tanto, la disfunción del EPR da lugar a muchas enfermedades oculares cegadoras, como la degeneración macular asociada a la edad (DMAE)4, la retinitis pigmentosa (RP)5, la amaurosis congénita de Leber6, la retinopatía diabética7, etc. Hasta ahora, la patogénesis exacta de la mayoría de estas enfermedades sigue siendo difícil de alcanzar. Como resultado, el cultivo celular de EPR se establece para estudiar la biología celular del EPR, los cambios patológicos y los mecanismos subyacentes.

Como el modelo más simple para estudiar la biología celular, el cultivo de células RPE se inició ya en la década de 19208. Aunque ARPE-19 es ampliamente utilizado como células del EPR, la pérdida de pigmentación, la morfología de los adoquines y, especialmente, las funciones de barrera en esta línea celular plantean muchas preocupaciones9. En comparación, el cultivo de células RPE humanas primarias ofrece un escenario más realista para estudios fisiológicos y patológicos9. Sin embargo, la disponibilidad relativamente limitada restringe su uso y siempre existen problemas éticos. Además, varios grupos utilizaron modelos de ratón para cultivar células de EPR. Sin embargo, el tamaño del ojo del ratón es pequeño, y un solo cultivo generalmente requiere muchos ratones, lo cual no es conveniente9. Recientemente, los científicos han desarrollado nuevos métodos para utilizar células madre embrionarias humanas o células madre pluripotentes inducidas para derivar células RPE. Aunque esta técnica tiene un potencial particular para el tratamiento de trastornos hereditarios del EPR, consume mucho tiempo y generalmente requiere varios meses para generar células maduras del EPR10. Para superar estos problemas, aquí presentamos un protocolo fácil de seguir para aislar y cultivar células RPE de alta pureza en el laboratorio de forma rutinaria. En condiciones de cultivo adecuadas, estas células pueden mostrar funciones típicas del EPR y exhibir morfologías típicas del EPR. Por lo tanto, este método de cultivo puede proporcionar un buen modelo para comprender la fisiología del EPR, estudiar la citotoxicidad, investigar los mecanismos patológicos de las enfermedades oculares relacionadas y realizar exámenes de detección de drogas.

Protocolo

El uso de animales de experimentación cumplió con las regulaciones de la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología (ARVO) y fue aprobado por el Comité de Ética de Manejo de Animales Experimentales de la Universidad de Xiamen.

1. Preparación de dispositivos quirúrgicos experimentales, enzima de digestión tisular y tampón de cultivo celular

  1. Preparar los dispositivos quirúrgicos experimentales, limpiando y esterilizando en autoclave dos pares de tijeras quirúrgicas oftálmicas y fórceps el día antes de la disección del globo ocular, y luego secando la caja con dispositivos quirúrgicos en un horno de protocolo general a 65 °C durante la noche.
  2. Preparación de medios de cultivo.
    1. Prepare DMEM/Basic medio suplementado con 10% (v/v) de suero fetal bovino, 2 mM de L-glutamina y 1% (v/v) de penicilina (100 U/mL) y estreptomicina (100 U/mL).
    2. Prepare medios DMEM/F12 suplementados con FBS al 1% (v/v) y 1% (v/v) de penicilina (100 U/ml) y estreptomicina (100 U/ml).
    3. Prepare MEM-Nic 11, complementando MEM alfa con 2 mM de L-glutamina, 1% de FBS, 1% (v/v) de penicilina (100 U/mL) y estreptomicina (100 U/mL), 0.1 mM NEAA, 1% (v/v) de suplemento N1, taurina (0.25 mg/mL), hidrocortisona (20 ng/mL), triyodo-tironina (0.013 ng/mL) y nicotinamida de10 mM.
      NOTA: Para mejorar la viabilidad celular y la proliferación, el porcentaje de FBS se puede aumentar al 20% para neutralizar las enzimas de digestión y sembrar las células disociadas. Para el cultivo celular a largo plazo, el porcentaje de FBS puede reducirse hasta un 1%12.
  3. Descongelar la enzima de digestión tisular alícuota (solución de tripsina/EDTA al 0,25% (p/v) suplementada con 0,91 mM de EDTA, en lo sucesivo denominada solución de tripsina/EDTA) durante el experimento.
    NOTA: La solución fresca de tripsina/EDTA debe usarse cada vez para obtener resultados óptimos. Alícuota 10 ml de solución fresca de tripsina/EDTA en cada tubo de centrífuga estéril de 15 ml y congelar las alícuotas a -20 °C en nevera hasta su uso.
  4. Solución de disección.
    1. Esterilice 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS) (pH 7.2) suplementada con 2% (v/v) de penicilina (100 U/ml) y estreptomicina (100 U/ml) filtrando la solución a través de una unidad de filtro de jeringa de 0,22 μm.
  5. Cubra las placas de cultivo y los insertos de transwell.
    1. Lave los pocillos y los insertos transwell con 1x PBS. Retire el PBS de los pocillos y transpozos con una pipeta, y luego agregue 1 ml de 1x PBS fresco a la cámara inferior y 600 μL de 10 μg/ml de solución de laminina a la cámara superior.
    2. Incubar las placas/insertos de transwell en la incubadora de cultivo celular durante la noche a 37 °C y 5% deCO2. Retire la solución de laminina de la cámara superior y lave con 1 ml de PBS frío 1x dos veces antes de sembrar las células.

2. Disección de células del EPR del globo ocular porcino

  1. Preparación de los instrumentos.
    1. Limpie la campana de flujo laminar con 75% de etanol y luz UV. Prepare tres tubos de centrífuga estéril de 50 ml que contengan ~25 ml de etanol al 75%, tres tubos de centrífuga estéril de 50 ml que contengan ~25 ml de 1x PBS y tres placas de cultivo celular estéril de 10 cm que contengan ~15 ml de 1x PBS.
      NOTA: Estos ajustes se utilizan generalmente para diseccionar cuatro globos oculares porcinos. Por favor, amplíe cuando se utilicen más globos oculares. Para mejorar la viabilidad celular, preenfríe 1x tampón PBS en hielo durante al menos 30 minutos. Tanto el etanol al 75% como la luz UV son necesarios para garantizar que los instrumentos experimentales y las células no estén contaminados. Encienda la lámpara UV con anticipación para esterilizar toda la mesa de operaciones durante al menos 15 minutos.
  2. Limpie los globos oculares porcinos.
    1. Obtenga globos oculares frescos de un matadero y manténgalos en hielo hasta la disección. Remoje cuatro globos oculares porcinos en ~ 15 ml de etanol al 75% en una placa de Petri de 10 cm y use un par de tijeras y fórceps para cortar todos los tejidos conectivos y músculos residuales.
      NOTA: Retire la mayor cantidad de tejido posible del exterior de la esclerótica para reducir las contaminaciones. No corte el nervio óptico en este momento para facilitar la transferencia de globos oculares durante la etapa de descontaminación y lavado. Después de este paso, todos los procedimientos deben realizarse en una campana de flujo laminar.
  3. Descontaminar los globos oculares porcinos remojando y lavando cuatro globos oculares porcinos en tres tubos centrífugos estériles de 50 ml llenos de etanol al 75% de manera secuencial; Cada globo ocular se sumerge durante al menos 5 minutos en cada tubo. A continuación, lave los globos oculares porcinos en tres tubos centrífugos estériles de 50 ml llenos de 1x PBS de manera secuencial; lave cada globo ocular durante al menos 5 minutos en cada tubo (Figura 1A). Invierta los tubos cada minuto para lavar bien los globos oculares.
  4. Disección de globos oculares porcinos.
    1. Mover los cuatro globos oculares porcinos a una placa de cultivo celular estéril de 10 cm que contenga 1x PBS. Recorte la superficie externa de cada globo ocular nuevamente para eliminar el nervio óptico y los pequeños residuos (Figura 1B). Use tijeras para hacer un pequeño corte en la intersección del limbo y la esclerótica, y luego retire la córnea, el iris, el cristalino, el cuerpo vítreo y la retina neural (para obtener información detallada sobre las estructuras de estos tejidos, consulte la Figura 1).
    2. Transfiera el complejo EPR-coroides-esclerótica a una nueva placa de cultivo celular de 10 cm y haga cuatro cortes para aplanar el ocular en forma de trébol de cuatro hojas (Figura 1C).
  5. Realice la digestión de la solución de tripsina/EDTA colocando los cuatro complejos RPE-coroides-esclerótica en una nueva placa de 10 cm. Vierta 20 ml de solución fresca de tripsina/EDTA para fusionar los complejos RPE-coroides-esclerótica y coloque el plato en la incubadora de cultivo celular a 37 °C durante ~30 min.
    NOTA: Use una solución fresca de tripsina/EDTA para disociar las células del EPR. Controle cuidadosamente el tiempo de digestión de la solución de tripsina/EDTA, ya que un tiempo de incubación más largo (más de 30 min) puede aumentar la contaminación de otros tipos de células.

3. Aislamiento y cultivo de células del EPR del globo ocular porcino

  1. Disociación del EPR.
    1. Saque el plato de la incubadora después de 30 minutos de incubación con solución de tripsina/EDTA y agregue 20 ml de medios de cultivo precalentados (con 10% de FBS) al plato para neutralizar la solución de tripsina/EDTA.
      NOTA: En este paso, sólo se utiliza DMEM/Basic media. Cuando las células alcanzan la confluencia, se pueden usar tres medios de cultivo dependiendo de las condiciones experimentales: medios DMEM / Basic, medios DMEM / F12 y medios MEM-Nic.
    2. Utilice una pipeta de transferencia de 5 ml para disociar las células del EPR pipeteando suavemente varias veces. Recoja las suspensiones celulares en tubos de centrífuga de 15 ml. Use otros 10 ml de medios de cultivo frescos (10% FBS) para lavar los complejos EPR-coroides-esclerótica en el plato pipeteando suavemente para obtener tantas células de EPR como sea posible.
      NOTA: No triture las células demasiado vigorosamente. Asegúrese de llenar y vaciar la pipeta a una velocidad de aproximadamente 3 ml/s. Evite burbujear la suspensión celular.
  2. Recolectar células RPE centrifugando los tubos a 200 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Aspirar el sobrenadante con una pipeta y añadir otros 5 ml de medios de cultivo (10% FBS) para resuspender las células y centrifugar a 200 x g durante otros 5 min. Decantar el sobrenadante y resuspender las células con 12 mL de medios de cultivo.
    NOTA: Al aspirar el sobrenadante, deje aproximadamente 1 ml de medio para evitar la ruptura de los grupos celulares.
  3. Siembra de células RPE.
    1. Semilla ~1-2 x 105 células/pocillo en placas de cultivo de 12 pocillos o insertos de transwell. Por lo general, alrededor de 1,5 x 106 células del EPR se obtienen de cuatro globos oculares porcinos. Cambie los medios de cultivo cada 2 días y reduzca la concentración sérica al 1% cuando las células cubran completamente la superficie de los pocillos/insertos.
      NOTA: No mueva la placa de cultivo celular con demasiada frecuencia antes de que las células se adhieran a la placa de cultivo/insertos.
  4. Cambie los medios de cultivo cada 2 días hasta que se recolecten las células.
    NOTA: La concentración de FBS se puede reducir después de que las células alcanzan la confluencia, y las células se pueden cultivar hasta por varios meses para permitir la diferenciación y maduración completas.

4. Caracterización de células primarias del EPR porcino

  1. Cultive las células en confluencia durante 1 o 2 semanas, y luego coseche las células para su posterior análisis.
  2. Recolección de células para el análisis cuantitativo de PCR en tiempo real (qRT-PCR).
    1. Retire los medios de cultivo, lave las células con 1 ml de PBS frío 1x y luego agregue 500 μL de solución de extracción de ARN en cada pocillo para recolectar lisado celular de aproximadamente 1 x 106 células.
    2. Extraer ARNm13; Se extraen aproximadamente 4 μg de ARN de cada muestra. Utilizar 100 ng de ARNm para realizar la transcripción inversa14; diluir el ADNc 40 veces para el análisis cuantitativo de PCR en tiempo real. Los cebadores se enumeran en la Tabla 1.
  3. Recolectar células para la tinción de inmunofluorescencia.
    1. Retire los medios de cultivo, lave las células con 1 ml de PBS frío 1x y luego agregue 500 μL de paraformaldehído al 4% (p/v) en 1x PBS para fijar las células (aproximadamente 1 x 106 células/pocillo) durante 30 min a temperatura ambiente. Luego, lavar las células con 1x PBS dos veces y realizar tinción de inmunofluorescencia con anticuerpos primarios (1:100 en 1x PBS suplementado con albúmina sérica bovina al 1% (p/v)) a 4 °C durante la noche y anticuerpos secundarios (1:200 en 1x PBS suplementado con albúmina sérica bovina al 1% (p/v)) a temperatura ambiente durante 2 h de acuerdo con los protocolos en línea15.
    2. Las imágenes de inmunofluorescencia son adquiridas por un microscopio confocal siguiendo el manual en línea16.
  4. Células de cosecha para el análisis de Western blot.
    1. Retire los medios de cultivo, lave las células con 1x PBS frío dos veces y luego agregue 80 μL de tampón RIPA (con 1x inhibidor de proteasa) en cada pocillo y use raspadores celulares para rascar aproximadamente 1 x 106 células de los platos / insertos.
    2. Recoger el lisado celular de cada pozo/inserto en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Hervir los lisados celulares durante 10 minutos y luego medir las concentraciones de proteínas utilizando kits de BCA; la concentración de proteína de cada muestra es de aproximadamente 2 mg/ml. Utilizar 25 μg de proteínas de cada muestra para el análisis de Western blot según protocolos en línea17.
    3. Para Western blot, incubar las membranas en 5 ml de solución de anticuerpos primarios (dilución 1:1.000 de anticuerpos primarios en 1x solución TBST suplementada con albúmina sérica bovina al 5% (p/v)) a 4 °C durante la noche en un agitador multipropósito giratorio.
    4. Luego, incubar la membrana con aproximadamente 15 ml de solución de anticuerpos secundarios anti-conejo o anti-ratón (dilución 1:5,000 de anticuerpos secundarios en 1x solución TBST suplementada con leche descremada al 5% (p/v)) a temperatura ambiente durante 2 h en un agitador orbital, según la fuente del anticuerpo primario utilizado.
  5. Medición de la resistencia transepitelial (TER).
    1. Lave los electrodos de palillos con etanol al 70% y 1x PBS estéril de forma secuencial. Luego coloque el extremo más corto del electrodo en la cámara superior y el extremo más largo en la cámara inferior de los insertos de transwell y haga clic en el botón en el voltímetro epitelial para las mediciones. Registre las mediciones TER de cada pocillo por triplicado.

Resultados

Las células primarias de EPR porcino (pRPE) se cultivaron en medios DMEM/Basic con 10% de FBS, y la morfología celular bajo microscopio óptico se fotografió a los 2 días (Figura 2A), 6 días (Figura 2B) y 10 días (Figura 2C) después de la siembra. Después de 1 semana, se observó una monocapa confluente de células pRPE pigmentadas con morfologías de adoquines.

Para caracterizar mejor las célula...

Discusión

Aquí, se ha descrito un protocolo detallado y optimizado para el aislamiento, cultivo y caracterización de células de EPR de globos oculares porcinos, que genera un buen modelo para la caracterización in vitro de células de EPR y estudios de trastornos relacionados con EPR. Los métodos para el aislamiento del EPR de los ojos humanos, de ratón y de rata se han descrito previamente23,24,25. Sin embargo, es difícil...

Divulgaciones

Todos los autores revelaron que no hay conflictos de intereses.

Todos los autores declaran que no hay intereses financieros en conflicto.

Agradecimientos

Los autores desean mostrar su gratitud y respeto a todos los animales que contribuyen con sus células en este estudio. Este estudio fue apoyado en parte por subvenciones del Programa Nacional de Investigación y Desarrollo Clave de China (2019YFA0111200, Yi Liao & Yuan Gao y Grant nos. 2018YFA0107301, Wei Li). Los autores agradecen a Jingru Huang y Xiang You del Laboratorio Central, Facultad de Medicina de la Universidad de Xiamen por el apoyo técnico en imágenes confocales.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
ARPE-19 cellsCCTCCGDC0323
Bovine serum albuminYeasen36101ES60
Confocal microscopyZeissLSM 880 with Airyscan
ChemiDoc TouchBio-Rad1708370
Cell scraperSangonF619301
10 cm culture dishNEST121621EH01
12-well culture plateNEST29821075P
DMEM F12 MediumGibcoC11330500BT
DMEM basic MediumGibcoC11995500BT
EVOM2World Precision InstrumentsEVOM2For TER measurement
Fetal bovine serumExCell BioFSP500
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488ThermoFisher Scientific A-11034
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594ThermoFisher ScientificA-11012
Goat anti Mouse IgG (H/L):HRPBio-Rad0300-0108P
Goat anti Rabbit IgG (H/L):HRPBio-Rad5196-2504
hydrocortisoneMCEHY-N0583/CS-2226
Hoechst 33342 solution (20 mM)ThermoFisher Scientific62249
LightCycler 96 InstrumentRoche5815916001
LiothyronineMCEHY-A0070A/CS-4141
lamininSigma-AldrichL2020-1MG
MEM(1X)+GlutaMAX MediumGibco10566-016
MEM NEAA(100X)Gibco11140-050
Millex-GP syringe filter unitMilliporeSLGPR33RB
N1Sigma-AldrichSLCF4683
NcmECL UltraNew Cell&Molecular BiotechP10300
Non-fat Powdered MilkSolarbioD8340
NicotinamideSparkJadeSJ-MV0061
Na+-K+ ATPase antibodyAbcamab76020Recognize both human and porcine proteins
PAGE Gel Fast Preparation Kit(10%)EpizymePG112
primary Human RPE cells --Generous gift from Shoubi Wang lab 
Pierce BCA Protein Assay Kit ThermoFisher Scientific23225
PrismGraphPad by Dotmaticsversion 8.0
Protease Inhibitor CocktailsAPExBIOK1024
PRE65 antibodyProteintech17939-1-APRecognize both human and porcine proteins
PEDF antibodySanta Cruz Biotechnologysc-390172Recognize both human and porcine proteins
100 x penicillin/streptomycin Biological Industries03-031-1BCS
Phosphate buffered saline (PBS)RARBIORA-9005
ReverTra Ace qPCR RT Master MixToyoboFSQ-201
RIPA bufferThermoFisher Scientific 89900
15 mL sterile centrifuge tubesNEST601052
50 mL sterile centrifuge tubesNEST602052
0.25% Trypsin-EDTAGibco25200-056
TaurineDamas-beta107-35-7
TrizolThermo-Fisher 15596026RNA extraction solution
TB Green Fast qPCR MixTakaraRR430A
12-well transwell insertsLabselect14212
VEGF antibodyProteintech19003-1-APRecognize both human and porcine proteins
VEGF ELISA kitNovusbioVAL106
ZO-1 antibodyABclonalA0659Recognize both human and porcine proteins

Referencias

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