Reconstitución de la motilidad basada en actina con proteínas disponibles comercialmente

Resumen

Este protocolo describe cómo producir cometas de actina en las superficies de las perlas utilizando ingredientes proteicos disponibles comercialmente. Tales sistemas imitan las estructuras protrusivas que se encuentran en las células, y se pueden utilizar para examinar los mecanismos fisiológicos de la producción de fuerza de una manera simplificada.

Resumen

Muchos movimientos celulares y cambios de forma y ciertos tipos de motilidad bacteriana y orgánulo intracelular son impulsados por la actina del biopolímero que forma una red dinámica en la superficie de la célula, orgánulo o bacteria. Las bases bioquímicas y mecánicas de la producción de fuerza durante este proceso se pueden estudiar reproduciendo el movimiento basado en actina de manera acelular en superficies inertes como perlas que se funcionalizan e incuban con un conjunto controlado de componentes. Bajo las condiciones apropiadas, una red elástica de actina se ensambla en la superficie de la perla y se abre debido a la tensión generada por el crecimiento de la red, formando un "cometa actina" que impulsa la cuenta hacia adelante. Sin embargo, tales experimentos requieren la purificación de una gran cantidad de diferentes proteínas de unión a actina, a menudo poniéndolas fuera del alcance de los no especialistas. Este artículo detalla un protocolo para la obtención reproducible de cometas de actina y la motilidad de las perlas utilizando reactivos disponibles comercialmente. El recubrimiento de cuentas, el tamaño de la cuenta y la mezcla de motilidad se pueden alterar para observar el efecto sobre la velocidad de la cuenta, las trayectorias y otros parámetros. Este ensayo se puede utilizar para probar las actividades bioquímicas de diferentes proteínas de unión a actina y para realizar mediciones físicas cuantitativas que arrojan luz sobre las propiedades de la materia activa de las redes de actina. Esta será una herramienta útil para la comunidad, permitiendo el estudio de la motilidad basada en actina in vitro sin conocimiento experto en la purificación de proteínas de unión a actina.

Introducción

La polimerización de actina en las células se controla espacial y temporalmente mediante una regulación estricta de la nucleación del filamento de actina aguas abajo de la señalización celular¹. La nucleación ocurre a través de la formación de un trímero de actina, y luego ambos extremos del filamento naciente polimerizan espontáneamente, aunque un extremo es más dinámico (el extremo de púas) que el otro (el extremo puntiagudo)². Cuando la nucleación y la polimerización del extremo de púas se dirigen hacia una superficie, producen suficiente fuerza (en el rango de Newton pico a nano) para empujar la membrana celular para el movimiento y mover objetos de tamaño micrométrico dentro de la célula con hidrólisis de ATP como fuente de energía³. Algunos ejemplos incluyen la bacteria Listeria monocytogenes que usa cometas actina para propagarse de célula a célula, y mitocondrias, donde el movimiento basado en cometas actina es importante para la herencia aleatoria durante la mitosis ^4,5. Los cometas de actina en endosomas y otras vesículas intracelulares están implicados en el desprendimiento de las membranas del donante ^6,7,8.

Con el método presentado aquí, se omiten los aspectos de señalización de la polimerización celular de actina, y la polimerización de actina se produce en perlas micrométricas de poliestireno recubriéndolas con activadores de nucleación de actina ramificada, específicamente el dominio activo de la proteína WASP humana, VCA (también llamada WA o WCA)¹. Las perlas recubiertas se incuban en una mezcla que contiene los ingredientes necesarios para la polimerización de actina, incluido el principal nucleador de polimerización de actina en las células, el complejo Arp2/3, que es activado por VCA en la superficie del cordón para formar nuevos filamentos como ramas de los lados de los filamentos hijos¹. La actina inicialmente polimeriza uniformemente alrededor de la cuenta, pero luego rompe espontáneamente la simetría para crear un cometa actina que empuja la cuenta hacia adelante, recreando así redes protrusivas similares a células y cometas de una manera controlada. Enfoques similares con perlas y otras superficies recubiertas han sido utilizados en el pasado por nosotros y otros para estudiar la bioquímica y la biofísica de la polimerización de actina 9,10,11,12^, pero se requirió una amplia experiencia en proteínas de unión a actina para estos experimentos. El protocolo presentado aquí describe cómo crear robustamente cometas de actina y motilidad completamente con reactivos disponibles comercialmente (o que pronto estarán disponibles), haciendo que este enfoque sea accesible para cualquier persona, incluso en un entorno educativo para enseñar conceptos biofísicos. Las características clave incluyen la importancia de un pipeteo suave y confiable, el uso de monómero complejado con profilina como fuente de actina y la esencialidad de usar un activador complejo Apr2/3 altamente activo como reactivo de recubrimiento de perlas.

Protocolo

1. Preparación de tampones

NOTA: Utilice_H2Oultrapuro para todos los búferes. No tiene que ser estéril. Filtrar todas las soluciones descritas en los pasos 1.1-1.4 con un filtro de jeringa de 0,2 μm, alícuota en porciones de 500 μL-2 ml por tubo dependiendo del uso, y almacenar a -20 °C.

1. Prepare BSA al 10% pesando 2 g de BSA en un tubo cónico de 50 ml y llenando hasta la marca de 20 ml con H₂O. Mezcle hasta que el BSA se disuelva (aproximadamente 30 min) y luego enrase el volumen a 20 ml.
   NOTA: Utilice BSA de alta calidad (consulte la Tabla de materiales). La solución BSA al 10% se utiliza tanto en la preparación de perlas como en la mezcla de motilidad.
2. Para la preparación del cordón, preparar el tampón Xb (10 mM HEPES, 0,1 M KCl, 1 mM MgCl 2 y 0,1 mM CaCl₂, pH 7,5) como una solución 10x, y diluir antes de usar (100 μL de solución madre 10x Xb + 900 μL de_H2O). Preparar Xb/1% BSA mezclando 100 μL de solución madre 10x Xb + 100 μL de BSA al 10% + 800 μL de_H2O.
3. Prepare el tampón G (2 mM Tris, 0.2 mM CaCl 2, 0.2 mM DTT,₂ mM ATP), que es el tampón utilizado para diluir la actina monomérica (actina G). Ajústese a pH 7, no a pH 8 como se usa tradicionalmente (ver discusión).
4. Preparar el tampón de motilidad MB13 (10 mM HEPES, 1,5 mM ATP, 3 mM DTT, 1,5 mM MgCl₂, 1 mM EGTA, 50 mM KCl, 1% BSA, pH 7,5). Para algunas aplicaciones, 10x MB13 es útil. Sin embargo, prepare 10x MB13 sin BSA, ya que conduce a problemas durante el ajuste del pH. Agregue BSA a partir de una solución madre al 10% (preparada en el paso 1.1) al reconstituir 1x MB13 desde 10x MB13.

2. Preparación de soluciones proteicas

NOTA: Utilice H₂O ultrapuro para todas las resuspensiones. No tiene que ser estéril. Manipular todas las proteínas en hielo y alícuota en tubos preenfriados. Manipular suavemente para no producir burbujas, y nunca vortex soluciones de proteínas. Para que las existencias se almacenen a -80 °C, no es necesaria la congelación rápida en nitrógeno líquido. Adapte el tamaño de la alícuota para evitar más de cinco ciclos de congelación-descongelación, ya que esto no parece afectar la actividad de ninguna de las proteínas. Las alícuotas de trabajo pueden almacenarse a -20 °C durante algunas semanas.

1. Prepare la solución de G-actina (músculo esquelético de conejo) como se describe a continuación.
   1. Centrífuga de pulsos polvo de actina (ver Tabla de materiales) a 4 °C para recoger el sólido en el fondo del tubo.
   2. Agregue H 2 O según las instrucciones del fabricante (1 mg de proteína en 100 μL de H₂O frío para actina no marcada, 100 μg de proteína en 100 μL_{de H2}O frío para actina marcada con ATTO).
   3. Déjelo reposar en hielo durante al menos 15 minutos. Mezclar suavemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo, dejar reposar en hielo al menos otros 15 minutos, y mezclar de nuevo. Centrifugar por pulsos a 4 °C para recoger la solución en el fondo del tubo y volver a mezclar.
   4. Preparar 10-50 μL de alícuotas de actina no marcada dependiendo del uso, y 20 μL de alícuotas de actina marcada con ATTO. Conservar las alícuotas a -80 °C.
   5. Para despolimerizar oligómeros de actina que se forman durante la liofilización y la congelación, diluya una alícuota de actina resuspendida ~ 8 veces en G-buffer enriquecido con ATP y DTT adicionales (por ejemplo, a 20 μL de solución de actina resuspendida del paso 2.1.4, agregue 134 μL de G-buffer, 0.32 μL de 0.2 mM ATP y 0.16 μL de 1 M DTT). Para el etiquetado fluorescente, agregue aproximadamente un 10% de actina etiquetada; por ejemplo, agregue 5 μL de actina marcada con ATTO a 40 μL de actina diluida no marcada. Deje que se despolimerice en hielo con mezcla ocasional (pipeteo) al menos unos días a una semana antes de medir la concentración de proteínas mediante el ensayo de Bradford como se describe en el paso 3.
      NOTA: Mantenga la actina fluorescente y sin etiquetar diluida en hielo en una habitación fría o refrigerador; Nunca congele ni deje calentar. La preparación continuará despolimerizándose con el tiempo, y cuando se maneja correctamente se puede usar durante al menos 6 meses.
2. Resuspender el complejo Arp2/3 (cerebro porcino) (ver Tabla de materiales) siguiendo las instrucciones del fabricante (20 μg de proteína en 20 μL de_H2Ofrío), con la secuencia de centrifugación por pulsos, mezcla, etc. en hielo como se describe para la actina en el paso 2.1. Combine las soluciones proteicas de la resuspensión de dos tubos de polvo para tener un stock más grande para experimentos reproducibles. Preparar 2 μL de alícuotas y almacenar a -80 °C.
3. Resuspender la profilina (recombinante humana) (ver Tabla de materiales) a una concentración 4 veces mayor que la estipulada en las instrucciones del fabricante (100 μg de proteína en 25 μL de_H2Ofrío), con la secuencia de centrifugación por pulsos, mezcla, etc. en hielo como para la actina en el paso 2.1. Combine las soluciones de proteínas de la resuspensión de dos tubos de polvo antes de determinar la concentración de proteínas para tener un stock más grande para experimentos reproducibles.
   NOTA: Mantener en hielo en una cámara frigorífica o refrigerador; Nunca congele ni deje calentar. Cuando se maneja correctamente, la profilina resuspendida es buena durante al menos 6 meses a 1 año.
4. Resuspender la proteína de taponado (α1β2, recombinante humano) (ver Tabla de materiales) siguiendo las instrucciones del fabricante (50 μg de proteína en 50 μL de_H2Ofrío), con la secuencia de centrifugación por pulsos, mezcla, etc. en hielo como se describe para la actina en el paso 2.1. Enfríe 50 μL de glicerol en hielo y agréguele los 50 μL de proteína de taponado resuspendida; Mezclar suavemente. Conservar a -20 °C.
   NOTA: La solución no se congela y la actividad es robusta, por lo que la solución se puede mantener como una sola alícuota durante meses, o incluso años, si se maneja con cuidado. La proteína de tapado recombinante de ratón, la más utilizada en el pasado en experimentos in vitro ¹³, pronto estará disponible comercialmente.
5. Resuspender gelsolin (humano recombinante, marcado con His) (ver Tabla de materiales) siguiendo las instrucciones del fabricante (20 μg de proteína en 20 μL de_H2Ofrío), con la secuencia de centrifugación por pulsos, mezcla, etc. en hielo como se describe para la actina en el paso 2.1. Se usan aproximadamente 2 μL de gelsolin por día de experimentos; por lo tanto, preparar alícuotas grandes (5-10 μL) y almacenar a -80 °C.
   NOTA: El protocolo con gelsolin se proporciona como alternativa. Se recomienda el uso de proteína taponadora en lugar de gelsolin, ya sea comprada o purificada como en¹³.
6. Resuspender VCA (WASP-VCA humano, marcado con GST) (ver Tabla de materiales) a una concentración 2 veces mayor que la estipulada en las instrucciones del fabricante (500 μg de proteína en 250 μL de_H2Ofrío), con la secuencia de centrifugación por pulsos, mezcla, etc. en hielo como para la actina en el paso 2.1. Hacer 10 μL de alícuotas y almacenar a -80 °C.
   NOTA: Una vez que se comercializa SpVCA (pVCA humano, estreptavidina y marcado con His) o si es posible la purificación de proteínas¹⁴ , se recomienda el uso de SpVCA en lugar de VCA. VCA no da cometas de forma reproducible bajo las condiciones descritas aquí.

3. Medición de las concentraciones de proteínas

1. Construya una curva estándar de Bradford hecha de dos diluciones seriales superpuestas de BSA.
   NOTA: La curva estándar solo necesita construirse cada dos meses (o incluso con menos frecuencia) siempre que el espectrofotómetro no cambie.
   1. En la fila 1 de un bastidor de microtubos, coloque los tubos para la serie de dilución BSA #1: cuatro tubos de 2 ml seguidos de cuatro tubos de 1,5 ml. En la fila 3 del bastidor, coloque los tubos para la serie de dilución BSA #2 como para la serie #1. En la fila 5 del bastidor, coloque un tubo de 2 ml para cada muestra que se vaya a medir junto con dos tubos de 1,5 ml. Agregue un solo tubo de 1.5 ml en la fila 5 para el espacio en blanco.
   2. Mida el reactivo Bradford (consulte la Tabla de materiales) en los tubos de 1,5 ml.
      1. Llene un tubo cónico de 15 ml hasta la parte superior con Bradford Reagent para facilitar el pipeteo (el exceso se devolverá a la botella de stock en el refrigerador) en hielo. Tome 200 μL de reactivo Bradford y expulse de nuevo en el tubo cónico para humedecer la punta de la pipeta. Como la solución es viscosa, pipetear lentamente para permitir que la solución entre y dejar la punta completamente sin hacer burbujas.
      2. Con la punta "prehúmeda", pipetear lentamente 200 μL de Bradford Reagent en cada uno de los tubos de 1,5 ml del bastidor (cuatro para cada dilución BSA, uno para el blanco y dos para cada muestra a medir). Haga esto primero para permitir que el reactivo Bradford se caliente completamente a temperatura ambiente antes de mezclarlo con soluciones de proteínas. Devuelva el contenido restante del tubo cónico de 15 ml al frasco.
   3. Mida_H2Oen los tubos de 2 ml. En la fila 1 del bastidor, agregue 1.990 μL de_H2Oal primer tubo y 900 μL a los otros tres tubos. Para la fila 3, añadir 1.992,5 μL al primer tubo y 900 μL a los otros tres tubos. Añadir 2.000 μL_H2Oa cada uno de los tubos de muestra de la fila 5.
      NOTA: Para todos los volúmenes mayores de 1.000 μL, utilice una pipeta de 1.000 μL, pero administre la cantidad total pipeteando dos veces. Es importante tener todo listo antes de comenzar los pasos posteriores, para evitar dejar proteínas altamente diluidas en_H2Odurante largos períodos de tiempo.
   4. Para preparar la serie de dilución BSA #1, mezcle 10 μL de BSA calibrado de 2 mg/ml (consulte la Tabla de materiales) en el tubo con 1,990 μL_H2Opara obtener una solución de 10 μg/ml. A partir de esto, hacer tres diluciones seriadas (5 μg/mL, 2.5 μg/mL y 1.25 μg/mL BSA) transfiriendo 900 μL de cada solución al siguiente tubo (que contiene 900 μL_H2O).
   5. Para preparar la serie de dilución BSA #2, mezcle 7.5 μL de BSA calibrado de 2 mg / ml en el tubo con 1,992.5 μL_H2Opara obtener una solución de 7.5 μg / ml. A partir de esto, hacer tres diluciones seriadas (3.75 μg/mL, 1.875 μg/mL y 0.9375 μg/mL BSA) transfiriendo 900 μL de cada solución al siguiente tubo (que contiene 900 μL_H2O).
   6. Mezclar y leer absorbancia para generar la curva estándar. Agregue 800 μL de_H2Oal tubo de reactivo de Bradford para el espacio en blanco y encienda el temporizador. De la manera más eficiente posible sin hacer burbujas, mezcle 800 μL de cada estándar BSA con 200 μL de reactivo Bradford en los tubos preparados. Una vez que todos los patrones se hayan mezclado con el reactivo Bradford (< 5 min), vierta cada estándar en una cubeta desechable y lea la absorbancia a 600 nm en el espectrofotómetro después de dejar en blanco la máquina.
      NOTA: La misma cubeta se puede utilizar para leer toda la serie si primero se lee el estándar menos concentrado y la cubeta está bien vacía entre lecturas. Rehacer la curva estándar hasta que el ajuste lineal tenga un valor R de al menos 0,99. Solo después de que se domine el pipeteo y la mezcla suave, proceda a leer las muestras.
2. Medir las concentraciones de actina y proteínas de unión a actina
   1. En los tubos de 2 ml que contienen 2.000 μL de_H2O(preparados en el paso 3.1.3), mezclar suavemente lo siguiente: 2 μL de complejo Arp2/3 y profilina, 4 μL de actina G marcada, 5 μL de gelsolina y VCA y 8 μL de proteína taponadora (recombinante humana). Inmediatamente tomar 800 μL de la solución y mezclar con el reactivo de Bradford ya preparado, y luego repetir para tener dos lecturas dentro del 5% -10% de la otra para cada muestra. Una diferencia mayor indica un problema con la resuspensión o el manejo. Lea a los pocos minutos de mezclar con el reactivo Bradford.
      NOTA: Si se utiliza una curva estándar de otro día, sólo se debe preparar el espacio en blanco del paso 3.1.6, además de las muestras.
3. Calcular las concentraciones de actina y proteínas de unión a actina utilizando la curva estándar y el factor de dilución. Rehacer la medición para cada nueva resuspensión. Los pesos moleculares para convertir las lecturas de mg/ml obtenidas mediante el ensayo de Bradford a μM son: actina 43 kD, complejo Arp2/3 224 kD, profilina 15 kD, gelsolina 95 kD, proteína de tapado 68 kD (recombinante humano) o 63,5 kD (recombinante de ratón), VCA 43 kD y SpVCA 54 kD (peso molecular del monómero).

4. Recubrimiento de perlas

1. Preenfríe la centrífuga a 4 °C y ajuste el bloque seco de agitación (consulte la Tabla de materiales) a 18 °C.
2. Lavar las perlas: pipetear 50 μL de tampón Xb en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, añadir 9 μL de suspensión de perlas de 4,5 μm de diámetro o 2 μL de suspensión de perlas de 1 μm de diámetro (2,5 % p/v de suspensión) (ver Tabla de materiales). Mezclar bien y centrifugar las muestras a 20.000 x g durante 10 min a 4 °C.
   NOTA: El área total de superficie de cuentas de ambos tamaños de cuentas es de 3 cm²:
   
   Se deriva calculando el número de cuentas y luego su superficie total utilizando ecuaciones clásicas para el volumen y el área de superficie de las esferas. Se pueden usar otros tamaños de perlas si las cantidades se ajustan para mantener constante el área de superficie total en 3 cm².
3. Cubra las perlas: retire con cuidado el sobrenadante sin perturbar las perlas y vuelva a suspender el pellet de perla en 40 μL de 2 μM SpVCA (o 7 μM VCA) en tampón Xb mediante un pipeteo suave. Agitar a 18 °C, 1.000 rpm durante 20 min.
4. Lave las perlas recubiertas: centrifugar la mezcla (20.000 x g durante 10 min a 4 °C) y retirar con cuidado el sobrenadante. Resuspender las perlas en 50 μL de BSA Xb/1% frío y centrifugar a 20.000 x g durante 10 min a 4 °C. Retire el sobrenadante y repita el paso de lavado 1x.
5. Vuelva a suspender el pellet de perla recubierto del paso 4.4 en 120 μL de BSA en frío Xb/1% para ambos tamaños de perlas de modo que la cantidad de área de superficie de perla/μL de solución de perlas sea la misma. Guarde este producto en hielo en un refrigerador o cámara frigorífica. Las perlas recubiertas continuarán funcionando normalmente durante al menos varias semanas.

5. Preparación de la mezcla de motilidad y portaobjetos para la observación

NOTA: El volumen total de la mezcla de motilidad es de 8,4 μL para permitir un espacio libre de aproximadamente 25 μm entre el portaobjetos y el cubreobjetos de 18 mm x 18 mm, de modo que no se aprieten cuentas de todos los tamaños (hasta 10 μm de diámetro). La mezcla básica de motilidad es aproximadamente 5 μM de actina G (10% de actina fluorescente marcada) con 5 μM de profilina, 50 nM de complejo Arp2/3 y proteína de tapado de 25 nM (o gelsolina de 240 nM).

1. Preparar la mezcla de reacción de motilidad. Las cantidades exactas de actina (y, por lo tanto, de profilina) dependen de la concentración calculada en el paso 3.3, pero una reacción representativa es la siguiente. Mezclar en hielo, en este orden: 3,2 μL de MB13, 1,5 μL de profilina a 30 μM diluida en MB13, 1 μL de proteína de taponado a 0,21 μM diluida en MB13 o gelsolina diluida a 2 μM en MB13, 1 μL de complejo Arp2/3 a 0,47 μM diluido en MB13, 0,2 μL de suspensión de perlas (vórtice justo antes de su uso), y 1,5 μL de actina a 30 μM en tampón G. Mezclar bien pero rápido y arrancar el temporizador.
2. Detecte toda la mezcla de reacción de motilidad en un portaobjetos. Cubra con un cubreobjetos de 18 mm x 18 mm y selle el cubreobjetos con VALAP fundido con un pincel pequeño. VALAP es una mezcla de lanolina, parafina y vaselina (ver Tabla de materiales) 1:1:1 en peso, derretida y agitada junta.

6. Observación microscópica

1. Observe inmediatamente las reacciones de motilidad utilizando un objetivo 100x en un microscopio vertical o invertido (ver Tabla de materiales), equipado con contraste de fase y/o microscopía de epifluorescencia (cubo GFP, ver Tabla de materiales). Las observaciones se realizan a temperatura ambiente (23-25 °C).
   1. Para obtener velocidades de desplazamiento promedio para toda una población de cuentas, registre el contraste de fase o las imágenes fijas fluorescentes a lo largo del tiempo escaneando toda la diapositiva. Mide la longitud del cometa a mano y traza el tiempo. La pendiente del ajuste lineal es la velocidad de crecimiento promedio.
   2. Para evaluar la velocidad de las cuentas individuales, recopile películas de lapso de tiempo en microscopía de contraste de fase. Dependiendo de la velocidad del talón y la resolución requerida, tome fotogramas cada 1-10 s. Utilice la herramienta de seguimiento de cualquier programa de procesamiento de imágenes para obtener velocidades y trayectorias de cuentas.

Resultados

Uno de los aspectos clave de la creación reproducible de cometas de actina en perlas es el pipeteo suave y preciso de delicadas proteínas de unión a actina. Generar una curva estándar de Bradford es una buena manera de evaluar las habilidades de pipeteo. La Figura 1A,B muestra los tubos para la curva estándar y un ejemplo de cómo se ven las dos diluciones seriadas de BSA una vez mezcladas con el reactivo Bradford. Tenga en cuenta el tono azul graduado (una mayor concentración de proteína da una solución más azul). Cuando se leen en el espectrofotómetro y se trazan, estas soluciones dan una curva estándar como se muestra en la Figura 1C. Para practicar un pipeteo cuidadoso, el ensayo debe repetirse hasta que el factor de correlación lineal sea 0.999, como se muestra.

Una vez que las concentraciones de proteínas resuspendidas comerciales se han evaluado cuidadosamente a través del ensayo de Bradford, las perlas recubiertas y la mezcla de motilidad se preparan y mezclan. La Figura 2A muestra imágenes representativas de las diferentes etapas de la formación del cometa: las nubes de actina se forman a los pocos minutos de mezclar las cuentas recubiertas de SpVCA y el medio de motilidad; La polarización de las nubes ocurre a ~ 5 min y la producción del cometa a los 15-20 min. Los cometas actina, visibles tanto con epifluorescencia como con microscopía de contraste de fase (Figura 2A), continúan alargando durante muchas horas, pero no se mantiene una velocidad constante, por lo que la motilidad de las cuentas normalmente se evalúa dentro de 1 h. Por otro lado, se necesitan 30 minutos con perlas recubiertas de VCA para obtener nubes de actina brillantes (Figura 2B), y no se forman cometas, aunque la simetría comienza a romperse a las 1-2 h (flecha en la Figura 2B) y las nubes muestran polarización después de la incubación nocturna.

La Figura 3 muestra un ejemplo de evaluación de la velocidad del cordón en presencia de proteína de tapado. Dado que todas las cuentas rompen la simetría aproximadamente al mismo tiempo, se realizan grabaciones de "pseudo-lapso de tiempo" donde se escanea la diapositiva y se toman imágenes de toda la población de cometas a lo largo del tiempo (Figura 3A). Los cometas no se despolimerizan; por lo tanto, el aumento en las longitudes de los cometas medido a lo largo del tiempo se puede utilizar para calcular la velocidad de desplazamiento (Figura 3B). Gelsolin se puede usar en lugar de tapar la proteína para la formación de cometas si se agrega 10 veces más gelsolin para compensar su actividad de tapado reducida. Los cometas formados en presencia de gelsolin son cualitativamente iguales y se mueven aproximadamente a las mismas velocidades que las cuentas con proteína tapante (Figura 3C). La actividad de tapado es clave para concentrar la polimerización en la superficie de la perla, y cuando ni la proteína de tapado ni la gelsolina están incluidas en la mezcla de motilidad, las nubes de actina nunca se polarizan para formar cometas, aunque se forman nubes de actina brillantes alrededor de las perlas (Figura 3D). Los cometas en cuentas se pueden usar para medir la producción de fuerza basada en actina en diferentes contextos bioquímicos alterando la mezcla de motilidad y observando el resultado en la motilidad utilizando diferentes técnicas de micromanipulación, por ejemplo¹⁵.

Figura 1: Curva estándar de Bradford. (A) Imagen de cómo configurar los tubos para hacer la curva estándar de Bradford. No se muestran los tubos de muestra. (B) Imagen de las dos diluciones seriadas BSA superpuestas una vez mezcladas con el reactivo Bradford. (C) Las absorbancias a 600 nm de las soluciones mostradas en (B) se miden en el espectrofotómetro y se representan en función de las concentraciones de proteínas de las soluciones BSA. El ajuste lineal se utiliza para calcular la concentración de la muestra. El factor de correlación, R, del ajuste lineal es 0,999. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Formación de cometas en cuentas recubiertas de SpVCA en lugar de cuentas recubiertas de VCA. (A) Cuentas recubiertas de SpVCA representativas (diferentes cuentas en cada imagen) mostradas a lo largo del tiempo. Se indica el tiempo desde el momento de la mezcla. Las nubes de actina se forman inmediatamente, y la polarización de las nubes da cometas, que continúan alargando durante horas. (B) Cuentas recubiertas de VCA representativas (diferentes cuentas en cada imagen) mostradas a lo largo del tiempo. Se necesita más de 1 h para ver los inicios de la polarización de la nube de actina (flecha) e incluso las incubaciones largas no producen cometas. Todas las imágenes son de perlas de 4,5 μm de diámetro, imágenes de epifluorescencia de actina fluorescente emparejadas con visualización de contraste de fase para los puntos de tiempo de 15 y 20 min en (A), barras de escala = 5 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Análisis de la velocidad de los cometas y las cuentas. (A) y (C) En presencia de proteína tapante (CP) o gelsolina, las nubes de actina se polarizan para formar cometas en los primeros 20 minutos de reacción, y los cometas se alargan con el tiempo. Tiempo desde la mezcla indicado para cada imagen; Cada imagen es una cuenta diferente. Existe cierta variabilidad entre las perlas y la preparación, pero en promedio las perlas se mueven a velocidades de micras/submicrónicas por minuto (0,2-1 μm/min) en las condiciones estándar descritas aquí. (B) Gráfico representativo que muestra la evaluación de la longitud del cometa (población total de cuentas) a lo largo del tiempo. La pendiente de la correlación lineal corresponde a la velocidad de desplazamiento promedio, en este caso 0,24 μm/min. (D) En ausencia de actividad de tapado (sin proteína de tapado o gelsolina), se forman nubes de actina alrededor de las cuentas, pero los cometas no se forman. Todas las imágenes son de perlas de 4,5 μm de diámetro, imágenes de epifluorescencia de actina fluorescente, barras de escala = 5 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

El protocolo detallado aquí describe cómo obtener el crecimiento de la red de actina en las superficies de las cuentas, la formación de cometas y la motilidad de las cuentas utilizando proteínas disponibles comercialmente. Sin embargo, a veces los cometas no se observan de forma reproducible o no son homogéneos entre el portaobjetos y el cubreobjetos. La siguiente discusión enfatiza algunos puntos clave en el protocolo y sugiere algunos parámetros que se pueden ajustar. Un factor a tener en cuenta es que la formación del cometa y la velocidad de las cuentas se ven afectadas por la temperatura, con temperaturas muy por encima de 25 ° C o muy por debajo de 23 ° C que afectan negativamente la formación del cometa y dan datos irreproducibles. Se recomienda encarecidamente el uso de un microscopio de temperatura controlada o un microscopio en una habitación climatizada. Aunque la actina marcada con fluorescencia a menudo se incluye en la mezcla de motilidad para observar cometas por microscopía de fluorescencia, una vez que los cometas tienen más de un diámetro de cuenta de longitud, también son visibles por microscopía de contraste de fase como un frotis oscuro junto a la cuenta. La visualización de contraste de fase es más apropiada para las imágenes de lapso de tiempo, ya que cierta fototoxicidad se asocia con imágenes de fluorescencia incluso a través de discos giratorios. Debido a que las cuentas se asientan con el tiempo, un microscopio invertido produce menos deriva horizontal de cuentas que uno vertical y es más apropiado para películas. El uso de VALAP fundido para sellar portaobjetos es importante ya que sustancias como el esmalte de uñas interfieren con la formación de cometas. Se pueden hacer grandes cantidades de VALAP en un vaso de precipitados y luego sacarlas para rellenar vasos de precipitados más pequeños más susceptibles de fusión rápida. VALAP es bueno durante años a temperatura ambiente.

Otro aspecto técnico clave es la meticulosa preparación de la mezcla de tampón y motilidad. Se debe tener cuidado al preparar MB13, en particular en la etapa de ajuste del pH. El pH de MB13 debe ajustarse rápidamente a neutro con NaOH para evitar la hidrólisis de ATP, pero no demasiado rápido ya que el EGTA se solubiliza a medida que el pH se acerca al neutro. EGTA es un ingrediente clave porque compleja el calcio unido a la actina, dando en la mezcla de motilidad la forma de magnesio más activa¹⁶. MB13 preparado demasiado rápido o demasiado lento da una formación de cometas subóptima o incluso ninguna en absoluto. Un punto clave adicional es mantener un seguimiento cuidadoso de la concentración de KCl en la mezcla de motilidad cuando se juega con las condiciones. Por ejemplo, cuando se usa 1x MB13 en la mezcla de reacción y se diluye profilina, proteína de tapado y el complejo Arp2/3 en MB13, la concentración final de KCl en la reacción de motilidad es de aproximadamente 40-50 mM debido a la dilución por tampón G. Esta concentración da los mejores resultados en el ensayo del cometa, y cualquier KCl superior a 60 mM disminuye la actividad nucleante del complejo Arp2/3.

En el lado de las proteínas, un aspecto técnico crítico de la obtención de cometas de actina es el manejo adecuado de las proteínas comerciales de unión a actina, en particular el pipeteo preciso de cantidades de microlitros. La linealidad de la curva estándar de Bradford es una buena prueba de pipeteo y la curva se puede utilizar para mediciones rutinarias de concentraciones de proteínas. De hecho, cuando se utilizan proteínas comerciales resuspendidas para el procedimiento cometa, es importante verificar siempre las concentraciones de proteínas, ya que la variabilidad del lote y el error del usuario durante la resuspensión pueden conducir a diferencias entre las concentraciones reales y esperadas. A veces, pequeñas diferencias en las concentraciones de proteínas pueden conducir a la ausencia total de cometas.

Otro aspecto importante del método presentado aquí es el uso de G-actina complejada con profilina como combustible para la polimerización. Históricamente, los sistemas in vitro utilizaban actina filamentosa prepolimerizada (actina F) como fuente de actina: despolimerización en la polimerización alimentada a granel en la superficie^10,17. Esto tenía la ventaja de controlar los niveles de G-actina, pero agregó una capa de complejidad que requiere componentes adicionales para catalizar la despolimerización. Dado que la rotación de la red de actina no es necesaria para la producción de fuerza y la motilidad, que son alimentadas por nucleación y polimerización en la superficie de la perla, mientras que los factores de despolimerización de actina como ADF / cofilina actúan sobre las redes envejecidas lejos de la superficie¹⁸, la mayor parte de la reconstitución in vitro de la motilidad basada en actina ahora se realiza sin rotación por simplicidad. Sin embargo, hay algunos inconvenientes en el uso de G-actina. Primero, cuando se usa actina comercial, que ha sido liofilizada, los oligómeros están presentes. Los pasos de despolimerización descritos aquí son muy importantes para obtener resultados reproducibles. En particular, aunque el tampón G se ajusta tradicionalmente a pH 8, un pH más bajo (pH 7, por ejemplo) parece funcionar mejor en los ensayos descritos en este artículo, posiblemente porque el pH bajo mejora la despolimerización¹⁹. Otra desventaja del uso de G-actina es que una vez colocada en condiciones salinas permisivas a la polimerización, se produce nucleación espontánea y se forma F-actina en la masa, así como en la superficie del cordón. La complejación de G-actina con profilina suprime la nucleación espontánea en la polimerización a granel y en el extremo puntiagudo, enfocando así tanto la nucleación como la polimerización del extremo de púas en la superficie²⁰. La profilina-G-actina es fisiológicamente relevante, ya que gran parte de la actina en la célula está presente en esta forma²¹. Aquí, se utiliza una proporción de 1:1 de profilina:actina; sin embargo, las proporciones más altas (por ejemplo, 3: 1) inhiben más completamente la polimerización en el bulto, aunque las proporciones más altas también inhiben el complejo Arp2/3 y el alargamiento del extremo de púas en cierta medida^22,23.

La actividad de tapado también es clave para la formación de cometas, ya que asegura la inserción de nueva actina en la superficie a través de ciclos de nucleación por el complejo Arp2/3 activado en superficie^24,25. Sin tapado, las nubes de actina no rompen la simetría para formar cometas porque la polimerización en la superficie no acumula suficiente tensión para romper la nube²⁶. En el pasado, hemos utilizado proteína¹³ de tapado de ratón recombinante purificada en casa, pero las pruebas realizadas para este artículo indican que la proteína de tapado humano recombinante disponible comercialmente es igualmente efectiva, al igual que gelsolin disponible comercialmente, aunque se debe usar 10 veces más gelsolin, y para ciertas aplicaciones, puede no ser apropiado ya que tiene actividad de corte de actina y tapado²⁷.

Finalmente, la robustez de este método reside en el uso de un activador complejo Arp2/3 muy activo, la estreptavidina-pVCA (SpVCA)²⁸. SpVCA incluye el dominio de unión profilina-G-actina de WASP (el dominio p) además del dominio de unión complejo Arp2/3, ya que se encuentra que es más eficiente en condiciones de profilina-G-actina²⁹. Más importante aún, el uso de la etiqueta de estreptavidina, originalmente introducida para permitir la funcionalización de la superficie a través del enlace biotina-estreptavidina, tiene el efecto adicional de aumentar la activación del complejo Arp2/3, presumiblemente debido al hecho de que la estreptavidina es un tetrámero y, por lo tanto, agrupa el activador, conocido por aumentar la actividad del complejo Arp2/3³⁰ . El SpVCA producido comercialmente está actualmente en desarrollo y pronto estará disponible para su compra. Cabe señalar además que, aunque 40 μL de SpVCA de 2 μM se usa rutinariamente para recubrir 3 cm² de superficie de perla, otras concentraciones de recubrimiento (más altas y más bajas) también funcionan, y jugar con estas condiciones da diferentes velocidades de crecimiento y morfologías del cometa. De hecho, cuando los cometas no se forman o el tamaño del cometa no es homogéneo en el portaobjetos, se deben probar diferentes condiciones de recubrimiento, así como diferentes concentraciones de KCl y profilina en la mezcla de motilidad. Las concentraciones de actina, complejo Arp2/3 y proteína de taponado en la mezcla de motilidad también pueden alterarse para optimizar la formación de cometas, pero en nuestras manos, cambiar estas proporciones a menudo da resultados confusos.

Para concluir, los métodos descritos aquí producen ensamblaje de actina en superficies de perlas y motilidad, pero se puede usar cualquier superficie que pueda ser funcionalizada con SpVCA. En los casos en que la adsorción como se describe aquí no funciona, la fracción estreptavidina se puede utilizar para unir SpVCA a la superficie de interés después de la biotinilación. Las estructuras de actina así formadas, cometas o no, pueden ser utilizadas para probar diferentes aspectos bioquímicos y biofísicos de las redes de actina, y son especialmente apropiadas para manipulaciones físicas con micropipetas, pinzas ópticas y ablaciones láser 15,26,31,32. Además de sus usos para la comunidad de investigación, el enfoque descrito aquí es apropiado como una herramienta de enseñanza para que los estudiantes de biofísica de pregrado estudien conceptos de materia activa como la ruptura de simetría y la autoorganización.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Actin, rabbit muscle, Alexa Fluor 488 conjugate	Invitrogen (ThermoFisher Scientific)	A12373 (recently discontinued)	This product can be replaced with ATTO-488 actin from Hypermol.
Actin, rabbit muscle, ATTO-488	Hypermol	8153
Actin, rabbit skeletal muscle	Cytoskeleton	AKL99
Arp2/3 complex	Cytoskeleton	RP01P
ATP	Sigma	A7699
BioSpectrometer, basic	Eppendorf	035739
Bradford Reagent	Bio-Rad	500-0006
BSA, high quality	Sigma	A3059
BSA standard 2 mg/mL (Pierce)	Thermo Scientific	23209
Capping protein (a1b2, mouse recombinant)	Home-purified (Reference 13)		This product will soon be commercially available from Cytoskeleton.
Capping protein (a1b2, human recombinant)	Hypermol	8322
Cube, GFP: U-MNIBA3 or U-MWB2	Olympus	discontinued	Any GFP cube, adapted to the microscope being used, can be used.
Dry block, agitating: ThermoMixer C (refrigerated)	Eppendorf	035963
** with SmartBlock, 24 microtubes 2 mL	Eppendorf	035969
Gelsolin (human recombinant, His-tagged)	Cytoskeleton	HPG6
Lanolin	Sigma	49909
Microcentrifuge 5427R + rotor	Eppendorf	934126
Microscope, upright: BX51	Olympus	discontinued	Any epifluorescence upright microscope equipped with phase contrast optics can be used.
Microscope, inverted: IX70	Olympus	discontinued	Any epifluorescence inverted microscope equipped with phase contrast optics can be used.
Paraffin	Sigma	76244
Petroleum jelly: Vaseline	Sigma	16415
Pipettes Research Plus	Eppendorf		Gilson pipettes don't work as well for delivery of very small volumes (0.5 µL for example).
**10 µL		933954
**2.5 µL		933953	These two sizes are essential, but the use of high-quality pipettes (a full Research Plus set for example) is recommended.
Polystyrene carboxylate beads	Polysciences
**approx. 1 µm diameter		08226
**approx. 4.5 µm diameter		17140-5
Profilin 1 (human recombinant, untagged)	Cytoskeleton	PR02
SpVCA (human WASP pVCA domain, N-ter His-tag, C-ter Streptavidin tag)	Home-purified (Reference 14)		This product will soon be commercially available from Cytoskeleton.
VCA (human WASP VCA domain, GST-tagged)	Cytoskeleton	VCG03