Formación, confinamiento y observación de nemática activa basada en microtúbulos

Resumen

Aquí se presentan métodos para preparar nemática activa a partir de microtúbulos y motores de quinesina, incluida la preparación y construcción de proteínas y el uso de pozos para el confinamiento nemático activo.

Resumen

La formación de fases activas basadas en biopolímeros se ha convertido en una técnica importante para los investigadores interesados en explorar el campo emergente de los cristales líquidos activos y sus posibles funciones en la biología celular. Estos novedosos sistemas consisten en subunidades autoconducidas que consumen energía localmente, produciendo un fluido dinámico fuera de equilibrio. Para formar la fase de cristal líquido activo descrita en este informe, se combinan componentes proteicos purificados, incluidos biopolímeros y motores moleculares, y la fase nemática activa se forma espontáneamente en presencia de trifosfato de adenosina (ATP). Para observar el estado nemático, el material debe estar confinado en una geometría adecuada para microscopía a una densidad suficientemente alta. Este artículo describe dos métodos diferentes para la formación de una fase nemática activa utilizando microtúbulos y motores de quinesina: ensamblaje de una capa activa bidimensional en una interfaz de aceite y agua y ensamblaje bajo una capa de aceite usando un pozo elastomérico. También se describen técnicas para insertar el material activo en pequeños pozos de diferentes formas.

Introducción

Los fluidos activos están compuestos de partículas o elementos impulsados por energía que extraen combustible de su entorno local. Bajo las condiciones adecuadas, estos elementos activos móviles pueden actuar colectivamente para producir dinámica de fluidos emergente en escalas de longitud largas. Hay una variedad de ejemplos de tal comportamiento de fase fuera de equilibrio en la literatura y las fases activas se pueden encontrar en todo el espectro de los sistemas vivos. Algunos ejemplos notables son las colonias de bacterias¹, las hojas celulares ^2,3 y el flocado o enjambre de organismos ^4,5. Las fases activas también han sido ampliamente estudiadas en fases condensadas de filamentos citoesqueléticos, ya sea como parte de la célula⁶ o en sistemas sintéticos diseñados para hacer uso de componentes biológicamente extraídos ^7,8,9. El ordenamiento cristalino líquido y la formación de defectos topológicos tanto en sistemas naturales como sintéticos ensamblados a partir de extractos biológicos son de particular interés para la comunidad investigadora. En los últimos años, los grupos de investigación han examinado tales sistemas, sus propiedades físicas fundamentales y su relevancia para la biología 2,3,10,11.

Este artículo se centra en la formación del estado nemático activo a partir de una combinación de microtúbulos y proteínas motoras de quinesina. El cristal líquido nemático tradicional es una fase de equilibrio de la materia en la que las moléculas constituyentes exhiben un orden orientativo. Por ejemplo, un fluido que consiste en moléculas relativamente rígidas en forma de varilla puede exhibir tanto la fase nemática como, a temperaturas más altas, una fase¹² de fluido isotrópico no orientado. El primer ejemplo experimental de una fase nemática activa fue desarrollado por Sánchez et al.13, adaptando un experimento in vitro anterior ¹⁴ en el que se utilizaron grupos de proteínas motoras para producir un movimiento de cizallamiento entre haces de microtúbulos vecinos. Cuando este sistema de microtúbulos se limitó a una capa delgada, surgió un orden nemático espontáneo. En los últimos años, el estado nemático activo ha sido intensamente estudiado por varios grupos de investigación experimentales 15,16 y teóricos 17,18^, centrándose en fenómenos como la turbulencia activa —un estado en el que el fluido produce flujos caóticos autoconducidos ¹⁹— y defectos topológicos móviles. Este artículo describe métodos para preparar y formar el estado nemático activo a partir de microtúbulos y motores de quinesina en diferentes geometrías experimentales. En primer lugar, se describen los métodos de preparación para las diferentes soluciones de componentes, seguidos de métodos para formar la nemática activa utilizando dos geometrías de cámara de flujo diferentes. Se muestran los resultados típicos de las imágenes. Finalmente, se describen los métodos para confinar la nemática activa en pozos y canales.

Protocolo

1. Preparación del material activo

NOTA: El nematic activo 2D se ensambla en un proceso de tres pasos. Primero, se preparan dos soluciones separadas: a) microtúbulos polimerizados y estabilizados y b) MIX (una solución que contiene motores de quinesina). Estos se combinan y la actividad se inicia al agregar trifosfato de adenosina (ATP). El material se confina entonces en una geometría adecuada, de modo que su densidad es lo suficientemente alta como para que emerja el orden nemático. Se incluyen protocolos para la preparación de todos los componentes necesarios y cómo ensamblar la fase activa.

1. Preparación del racimo de proteínas motoras de kinesina
   1. Extraer y purificar proteínas motoras K401-BIO recombinantes (motores K401) de Escherichia coli siguiendo el protocolo de Edgar C. Young²⁰.
      NOTA: Las proteínas motoras K401-BIO son diméricas y consisten en dos cabezas conectadas con un tallo helicoidal. Los motores fueron suministrados por la Instalación de Biomateriales de Brandeis y utilizados como se informó anteriormente¹⁶. Con el propósito de formar una nemática activa, las moléculas de quinesina se biotinilan y luego se conectan a través de un enlace de estreptavidina para formar grupos de quinesina de hasta cuatro motores 13,15,21,22. Es útil expresar la quinesina con una etiqueta de proteína fluorescente verde (GFP).
   2. Después de la purificación e incubación de estreptavidina y motores en hielo durante 40 minutos, congelar rápidamente los motores K401 en nitrógeno líquido en alícuotas de 5 μL a una concentración final de 0,7 mg/ml y almacenar a -80 °C.
      NOTA: El experimento se puede pausar aquí. Descongele suavemente la kinesina cuando sea necesario y no vuelva a congelar.
   3. Preparar grupos de quinesina marcada con biotina (KSA) mezclando 24 % vol de motores K401 de 0,7 mg/ml, 27 % en volumen de estreptavidina de 0,325 mg/ml y 3 % en volumen de 5 mM de ditiotritol (DTT) (para evitar la agregación) a 4 °C en tampón M2B de 46 vol% (TUBOS de 80 mM [ácido 1,4-piperazinadiethanesulfónico, pH 6,8], 2 mM de MgCl₂ y 1 mM de EGTA [etilenglicol-bis(β-aminoetil éter)-N, ÁCIDO N,N′,N′-TETRAACÉTICO]). Deje que el KSA se incube en hielo durante 40 minutos.
2. Preparación de la solución de microtúbulos
   NOTA: La guanosina-5'-[(α,β)-metileno]trifosfato, la sal de sodio (GMPCPP) es un análogo lentamente hidrolizable del trifosfato de guanosina (GTP), y los microtúbulos formados en presencia de GMPCPP son tres veces más rígidos que los microtúbulos GTP²³ y más cortos. El uso de microtúbulos cortos y rígidos es favorable para la formación de la fase nemática activa, ya que estos factores se combinan para promover el orden cristalino líquido.
   1. Polimerizar la tubulina ciclada no marcada (99%, ver Tabla de materiales) utilizando 0,6 mM GMPCPP a una concentración de tubulina de 6 mg/ml.
      NOTA: La tubulina de alta calidad también se puede purificar a partir de cerebro bovino o porcino siguiendo protocolos establecidos u obtenerse de otra fuente confiable, como la Instalación de Biomateriales de Brandeis, donde los materiales se pueden enviar congelados para evitar daños. Para la purificación de tubulina del cerebro bovino, consulte el protocolo publicado de Bate et ^al.24. Para la purificación de tubulina del cerebro porcino, consultar los protocolos publicados de Castoldi et al.25 y Tayar et ^al.26.
   2. En preparación para la polimerización, prepare un baño de calor a 37 °C y enfríe previamente la centrífuga a 4 °C. Combinar la solución de tubulina no marcada en tampón M2B (paso 1.1.3) en un tubo de ultracentrífuga de 500 μL con tubulina marcada con rodamina al 4 al % mol (ver Tabla de materiales) para producir microtúbulos marcados al 4% después de la polimerización.
   3. Verificar la concentración de tubulina mediante un ensayo de Bradford²⁷. La concentración total de tubulina en el tubo de centrífuga debe ser de 6.5-6.9 mg / ml.
   4. Incubar la mezcla de tubulina en hielo durante 10 min y ultracentrifugar durante 10 min a 352,700 x g a 4 °C. Este paso elimina la tubulina disfuncional, que estará en el pellet.
   5. Con una pipeta, extraiga cuidadosamente el sobrenadante que contiene tubulina funcional en un tubo de microcentrífuga. Agregue GMPCPP a una concentración final de 0.6 mM para inducir la polimerización de tubulina y TDT a una concentración final de 1 mM para evitar la agregación de proteínas.
   6. Incubar la mezcla en el baño de calor a 37 °C durante 30 min, luego centrifugar de nuevo durante 10 min a 14.000 x g a temperatura ambiente. Retire el sobrenadante, luego diluya el pellet con tampón M2B para alcanzar una concentración final de microtúbulos de 6 mg / ml.
      NOTA: Esta solución se puede almacenar a temperatura ambiente durante al menos 4 h antes de su uso.
   7. Para comprobar que los microtúbulos se han polimerizado correctamente, diluir 1 μL de la solución de microtúbulos 100:1 con tampón M2B y pipeta en un portaobjetos de microscopio. Cubra con una cubierta para obtener imágenes con un microscopio de fluorescencia (consulte la Tabla de materiales) con una lente de objetivo de 40x.
      NOTA: Las longitudes de onda de excitación y emisión se eligen de acuerdo con el etiquetado de fluorescencia utilizado en los microtúbulos. En este protocolo, se utiliza el etiquetado de rodamina (ver paso 1.2.2), por lo que las imágenes se llevan a cabo utilizando una banda de excitación de 515-560 nm y un filtro de paso largo de 590 nm. La figura 1 muestra un ejemplo representativo.
   8. Una vez completada la polimerización, congelar los microtúbulos como alícuotas de 2 μL en nitrógeno líquido y almacenar a -80 °C (si es necesario).
3. Preparación de MIX
   NOTA: MIX es una solución acuosa que incluye los grupos de kinesina-estreptavidina (KSA). El MIX preparado debe conservarse a -80 °C en alícuotas de 4 μL antes del experimento. Cuando MIX se combina con ATP y la solución de microtúbulos descrita en el paso 1.2 a temperatura ambiente, se inicia la actividad. MIX se prepara de la siguiente manera^13,19.
   1. Prepare una solución para prevenir el desvanecimiento de la fluorescencia (ANTIFADE) mezclando dos soluciones antioxidantes. Combine AO1 (250 mM DTT, 65 mM catalasa) y AO2 (750 μM catalasa, 3 mM glucosa oxidasa) en una relación de volumen 1:1. Incluye 20 mM de Trolox, otro antioxidante utilizado para reducir el daño causado por la microscopía de fluorescencia.
   2. Preparar MIX haciendo una solución de KSA (descrita en el paso 1.1.3) que incluya 6% en peso de polietilenglicol (PEG) de 20 kDa para inducir el agrupamiento de los microtúbulos, 3 vol% de ANTIFADE y 5 vol% de piruvato quinasa/deshidrogenasa láctica (PKLDH) a 70 mg/ml para la regeneración de ATP.

2. Creación de la nemática activa

NOTA: La actividad en el material se inicia por la adición de ATP. La red activa se prepara fresca para cada experimento mediante la adición de ATP a una concentración lo suficientemente alta como para inducir la actividad motora. Para formar una fase nemática activa uniforme y completamente desarrollada, los microtúbulos deben tener una densidad suficientemente alta. Esto se puede lograr confinando los microtúbulos entre dos fluidos inmiscibles para formar una capa nemática activa bidimensional (2D). Este método fue desarrollado originalmente en la Universidad de Brandeis¹³ y sigue siendo una técnica popular para producir una fase nemática homogénea, de alta calidad y activa.

1. Método de celda de flujo para la formación nemática activa
   1. Prepare cubreobjetos hidrófilos con un recubrimiento de acrilamida.
      1. Limpie bien los cubreobjetos con agua jabonosa, etanol y NaOH 0,1 M con enjuagues alternativos con agua nanopura. Una vez enjuagados, cubra los cubreobjetos con una solución de silano compuesta de 100 ml de etanol, 1 ml de ácido acético y 500 μL de 3-(trimetoxisilil) propilmetacrilato durante 15 minutos, luego enjuague con agua nanopura.
      2. Prepare una solución de acrilamida a partir de 95 ml de agua nanopura y 5 ml de acrilamida al 40% en peso, luego desgasifique la solución durante 30 minutos en un horno de vacío.
      3. Añadir 35 μL de tetrametiletilendiamina (TEMED) para una concentración final de 2,3 mM y luego 0,07 g de persulfato de amonio. Vierta la solución de acrilamida sobre los cubreobjetos mientras está boca arriba e incube durante la noche a temperatura ambiente.
   2. Prepare portaobjetos de microscopio hidrófobo. Pipetear 100 μL de una solución repelente al agua (ver Tabla de materiales) en un portaobjetos de microscopio de vidrio limpio, luego coloque otro portaobjetos de vidrio limpio encima. Esto asegura un recubrimiento uniforme de la solución repelente al agua en la superficie donde se asienta durante 2 minutos. Después de 2 minutos, retire el segundo portaobjetos de vidrio y enjuague bien el primer portaobjetos con agua nanopura, luego séquelo con gas nitrógeno. Limpie suavemente la región donde se colocará la cinta (alrededor del patrón) con acetona para asegurarse de que la solución repelente al agua no impida la adhesión al vidrio.
   3. Prepare una mezcla de aceite de ingeniería que incluya 1.8% (v/v) de 008-fluorosurfactante (consulte la Tabla de materiales).
   4. Ensamble el portaobjetos de vidrio y el cubreobjetos con el portaobjetos de vidrio hidrófobo en la parte inferior de la celda de flujo y el deslizamiento de cubierta hidrófilo como superficie superior en una geometría sándwich utilizando espaciadores adhesivos de doble cara de 40 μm. Coloque los espaciadores a 1,5 mm de distancia en el portaobjetos del microscopio hidrófobo. Luego coloque el cubrecubierto de acrilamida en la parte superior de los espaciadores con el lado tratado hacia abajo para adherirse. Asegúrese de que la adhesión se complete con la presión de un objeto contundente.
      NOTA: El objetivo es ensamblar una celda de flujo con una interfaz plana aceite/agua en el interior (Figura 2A, B). Aquí es donde se formará la capa activa. También se pueden usar cintas y películas espaciadoras alternativas para producir un grosor de celda similar.
   5. Después de que se haya construido la celda de flujo, pipetear inmediatamente la mezcla de aceite en la celda de flujo, llenando el espacio cerrado.
   6. Usando una pipeta, mezcle suavemente en un vial separado 6 μL de material activo con 3,73 μL de MIX, 1 μL de solución de microtúbulos, 0,6 μL de solución de ATP (la concentración puede variar para variar la velocidad de los microtúbulos) y 0,67 μL de tampón M2B.
   7. Pipetear el material activo recién mezclado en un extremo abierto de la celda de flujo, los volúmenes variarán, pero deben exceder el volumen de la celda de flujo (aproximadamente 3-6 μL). Parte del aceite será desplazado por la solución acuosa a medida que se inyecta en el canal; Esto puede ser malvado en el extremo opuesto del canal de flujo usando un pequeño trozo de papel de seda.
   8. Después del llenado, selle ambos lados de la celda de flujo con un pegamento epoxi (consulte la Tabla de materiales) que se endurece cuando se expone a la luz UV durante 20 s.
      NOTA: En este punto, el material activo forma una red 3D que permanece suspendida en la capa de agua.
   9. Para confinar la capa activa entre los dos fluidos inmiscibles en una capa cuasi-2D, coloque la celda de flujo en una centrífuga de cubo oscilante (consulte la Tabla de materiales) con la fase acuosa en la parte superior y la capa de aceite más densa debajo. Centrifugadora a 212 x g durante 10 min. Después de completar este paso, la celda de flujo se puede llevar a un microscopio de epifluorescencia para obtener imágenes con un objetivo de aumento de 10x o 20x. La Figura 2C,D muestra imágenes típicas antes y después de este paso.
2. Método invertido para la formación nemática activa
   NOTA: Un método alternativo al descrito en el paso 2.1 es ensamblar la capa nemática activa debajo de una capa gruesa de petróleo confinada a un pozo PDMS profundo²⁸. Este método produce resultados similares, y es algo más fácil de dominar; Sin embargo, la calidad de imagen con este método no suele ser tan buena como el método de celda de flujo.
   1. Prepare el polidimetilsiloxano (PDMS) utilizando un agente de curado de elastómero y una base de elastómero (consulte la Tabla de materiales). Mezcle los dos componentes en una proporción de 1:10 usando una espátula de metal. Aparecen pequeñas burbujas durante la mezcla que son difíciles de eliminar, y la mezcla parece lechosa. Para eliminar estas burbujas, coloque la mezcla al vacío para desgasificarla durante 1 h, después de lo cual el PDMS sin curar debe aparecer transparente.
      NOTA: El PDMS ahora está listo para formar cualquier forma usando un molde, o puede curarse en el recipiente y luego cortarse o perforarse en el patrón deseado.
   2. Verter el PDMS en un molde adecuado y dejar reposar toda la noche a 60 °C.
      NOTA: Sin tratar, la superficie del PDMS curado es hidrófoba, pero con el tratamiento superficial, se puede hacer hidrófilo.
   3. Para preparar una superficie PDMS hidrófila, cubra el PDMS con un cepillo de polímero de acrilamida²⁹. Este paso también evita que las proteínas se peguen a la superficie.
      1. Comience limpiando el PDMS durante 10 minutos con etanol e isopropanol, luego enjuague bien con agua desionizada 3x y séquelo. Use un limpiador de plasma durante 5 minutos para limpiar el PDMS seco y curado. Este paso hace que la superficie sea más hidrófila.
      2. A continuación, prepare una solución de silano (98,5% en peso de etanol, 1 % en peso de ácido acético y 0,5 % en peso de trimetoxisilil propilmetacrilato) y sumerja el sustrato en esa solución durante 15 minutos para prepararse para el recubrimiento de acrilamida. Enjuague bien el sustrato con agua desionizada y sumérjalo en una solución de acrilamida (solución de acrilamida/bis al 2% en peso, TEMED de 2,3 mM y persulfato de amonio de 3 mM).
         NOTA: Estos sustratos se pueden almacenar a temperatura ambiente cubiertos con solución de acrilamida en una placa de Petri de vidrio, y deben usarse dentro de las 2 semanas.
   4. Cuando esté listo para usar, enjuague la superficie con agua desionizada y séquela con nitrógeno para su uso inmediato. Añadir la mezcla activa (descrita en el paso 2.1.6) a los pocillos e inmediatamente añadir aceite de silicona encima hasta un espesor aproximado de 2 mm.
      NOTA: En esta etapa, la mezcla activa se intercalará entre el aceite y el recubrimiento hidrófilo en el PDMS, pero seguirá siendo algo tridimensional.
   5. Para empujar el material más lejos en una capa 2D, pegue el dispositivo PDMS en un portaobjetos de vidrio, colóquelo en una centrífuga de cubo oscilante y gire durante 12 minutos a 212 x g. El dispositivo deberá colocarse de tal manera que el aceite de silicona esté en la parte superior de la capa acuosa. Los resultados representativos se muestran en la Figura 3.

3. Preparación de la nemática activa en geometrías confinadas

NOTA: La nemática activa como este sistema cuasi-bidimensional puede ser difícil de confinar en pequeñas geometrías microfluídicas como pozos o canales. Aquí, se describe un método confiable para confinar el material en pozos PDMS de diferentes formas.

1. Primero, diseñe un molde maestro para el PDMS. Esto se puede lograr imprimiendo pilares 3D sobre un sustrato. Después de imprimir en 3D el molde maestro de resina, limpie con isopropanol y luego cure el molde bajo una lámpara UV durante 45 min y en el horno a 120 °C durante 2 h (Figura 4).
   NOTA: El curado bajo UV y postcurado térmico mejora la calidad de la replicación en PDMS al eliminar monómeros y residuos de fotoinhibidores de la resina³⁰.
2. Utilice el molde maestro para crear pozos a partir de PDMS. Prepare el PDMS como se describe en el paso 2.2.1. Sumerja el molde maestro en PDMS sin curar y cure durante la noche en un horno a 60 °C.
3. Una vez completado el curado del PDMS, retire con cuidado el molde maestro y corte el PDMS como desee para trabajar con los pocillos (Figura 4). Trate la superficie del PDMS como se describe en el paso 2.2.3. Antes del experimento, la superficie se puede unir a un portaobjetos de vidrio con pegamento epoxi para facilitar la obtención de imágenes.
4. Pipetear 1 μL de la mezcla activa descrita en el paso 2.1.6 sobre el sustrato PDMS e inmediatamente añadir aceite de silicona con 100-1000 cSt viscosidad²⁸ sobre la gota de red activa. La red activa se moverá hacia el pozo; este proceso tarda hasta 60 min (Figura 4). Como se describe en el paso 2.2.5, la red 2D se puede mejorar girando bien el PDMS en la centrífuga de cucharón oscilante durante 12 minutos a 212 x g.

Resultados

La Figura 1 muestra una imagen representativa de microtúbulos individuales preparados a partir de tubulina GMPCPP. La imagen muestra microtúbulos cortos de longitudes similares (con cierta dispersidad presente). Una dilución suficiente de la solución de microtúbulos debe producir una imagen de microtúbulos bien separados para la verificación de la longitud. Los microtúbulos individuales pueden ser difíciles de visualizar debido a su pequeño tamaño. El uso de una cámara de alta sensibilidad diseñada para microscopía de fluorescencia es lo mejor para esta aplicación. La Figura 2 y la Figura 3 muestran ejemplos de imágenes de microscopía de fluorescencia de experimentos exitosos realizados utilizando el método de celda de flujo (sección 2.1) y el método invertido (sección 2.2), respectivamente. Una capa nemática activa bien formada es homogénea en textura, sin áreas vacías significativas y defectos topológicos móviles presentes. Sin embargo, tenga en cuenta que puede haber algunos pequeños vacíos aceptables en los núcleos defectuosos. Además de los ejemplos que se muestran en la Figura 2 y la Figura 3, se han incluido tres películas suplementarias (Película 1, Película 2 y Película 3) para demostrar cómo debería aparecer la nemática activa en un experimento exitoso. Todas las películas demuestran el suave movimiento continuo de la fase nemática activa. No se observan variaciones en la concentración de microtúbulos después de que el material ha alcanzado su estado estacionario. Mientras haya suficiente ATP presente en el sistema, el material continuará moviéndose uniformemente.

Figura 1: Imagen de microscopio de fluorescencia de microtúbulos GMPCPP. Los microtúbulos GMPCPP se marcaron al 4% con tubulina rodamina y se polimerizaron durante 20 min a 37 °C. Las imágenes se realizaron a temperatura ambiente. Barra de escala = 10 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Nemática de microtúbulos en una celda de flujo. (A) Esquema de sección transversal de la celda de flujo, geometría de 1 mm x 18 mm. (B) Esquema de vista superior de la celda de flujo. (C) Imagen de microscopía de fluorescencia que demuestra la apariencia típica de la solución activa antes del ensamblaje en la interfaz aceite/agua. (D) Imagen de microscopía de fluorescencia de la fase nemática activa ensamblada en la interfaz aceite/agua dentro de la celda de flujo. Barra de escala = 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Imagen de microscopio de fluorescencia que muestra una nemática activa preparada utilizando el método invertido. Barra de escala = 200 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Diagrama de flujo que ilustra el método para el confinamiento nemático activo en un pozo PDMS, incluida la fabricación de moldes y el tratamiento de superficies. Barra de escala en la imagen de la derecha (material activo confinado) = 200 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Película 1: Resultado representativo para nemática activa preparada usando el método de celda de flujo. Haga clic aquí para descargar esta película.

Película 2: Resultado representativo para nematic activo preparado usando el método invertido. Haga clic aquí para descargar esta película.

Película 3: Resultado representativo para nemática activa preparada utilizando el método invertido confinado a un pozo elíptico. Haga clic aquí para descargar esta película.

Discusión

Hay algunos puntos a lo largo de los protocolos en los que el experimentador puede hacer algunas comprobaciones importantes. Antes de llenar cualquiera de los dispositivos con material activo, se debe utilizar microscopía de fluorescencia (ver Figura 1) para verificar que los microtúbulos estén polimerizados e idealmente ~2-3 μm de longitud. Si los microtúbulos no son visibles bajo el microscopio, pueden haberse despolimerizado y la nemática activa no se formará. Debido a que los microtúbulos individuales son muy pequeños, puede ser difícil observarlos directamente a través del microscopio. En este estudio, se utilizó una cámara de fluorescencia de alta calidad diseñada para aplicaciones desafiantes con poca luz con el software asociado para verificar el crecimiento del filamento. No deben estar presentes agregados fluorescentes significativos en esta etapa, ya que esto puede indicar despolimerización o la presencia de proteína desnaturalizada. También es una buena idea hacer un portaobjetos de prueba de microscopio simple combinando microtúbulos, MIX y ATP en las mismas proporciones que se describen en los protocolos. La actividad debe comenzar al combinar los componentes y el material debe parecer similar al que se muestra en la Figura 2C con haces presentes y movimientos de filamentos notables visibles en todas partes.

Cuando se utiliza el método de celda de flujo, el tiempo de centrifugación y la orientación de la celda de flujo son importantes para la formación de una capa activa uniforme. Este paso puede requerir algunos ajustes finos dependiendo del tipo de centrífuga utilizada. La centrifugación de la celda de flujo con el plano activo orientado perpendicularmente al plano de rotación da los mejores resultados, ya que el material se puede empujar uniformemente hacia la interfaz del fluido. Verifique que la celda de flujo esté cuidadosamente sellada antes de centrifugar.

Cuando se utiliza el método invertido para producir nemática activa confinada, hay varios pasos para optimizar. En primer lugar, es importante utilizar un método de impresión 3D que produzca estructuras de alta resolución. Las paredes laterales desiguales pueden hacer que los microtúbulos se atrapen, lo que interrumpirá los flujos. Los pozos no deben ser demasiado profundos (en este estudio se utilizaron pozos de 150-200 μm de profundidad con una capa de petróleo suprayacente de 2 mm de espesor). Los experimentadores pueden necesitar ajustar estos parámetros ligeramente por ensayo y error para obtener el mejor resultado.

El método de celda de flujo y el método invertido han sido utilizados por diferentes autores para observar una variedad de efectos que afectan los flujos activos, incluidos diferentes aceites¹² y estructuras sumergidas¹³. La elección del método depende del objetivo experimental. Usando el método de celda de flujo, las imágenes ópticas desde arriba de la capa activa son más claras que para el método invertido debido a los diferentes fluidos suprayacentes. En el método de celda de flujo, las imágenes se llevan a cabo a través de un deslizamiento de cubierta de vidrio y una capa delgada de agua, mientras que el método invertido está diseñado para tener la capa de aceite en la parte superior. Esto significa que se necesita un objetivo de larga distancia de trabajo para el método invertido y se reduce la calidad de imagen. Las diferencias de calidad de imagen se pueden ver comparando la Figura 2D (método de celda de flujo) y la Figura 3 (método invertido), y la Película 1 y la Película 2, respectivamente. Se requirió una lente de aumento más baja con una distancia de trabajo más larga para la Figura 3 que la utilizada para la Figura 2. Estas desventajas de imagen para el método invertido pueden evitarse si se dispone de un microscopio invertido adecuado, combinado con objetivos con una distancia de trabajo adecuada para los sustratos de portaobjetos del microscopio. El vidrio más delgado se puede utilizar como sustrato para permitir el uso de objetivos de distancia de trabajo estándar.

Como ventaja, la geometría invertida permite el uso de una gama más amplia de viscosidades de aceite, no requiere necesariamente centrifugación de cucharón oscilante (si no está disponible), y la preparación del sistema es relativamente más fácil una vez que el molde está preparado. Sin embargo, para el confinamiento en pozos utilizando el método invertido, puede ser importante cierta centrifugación para obtener el material en una capa 2D bien definida.

El método de celda de flujo se ha utilizado recientemente con mucho éxito en experimentos donde se requiere una capa activa continua. Nuestro trabajo reciente ha analizado la dinámica de los defectos topológicos en la capa activa, donde la imagen de alta calidad y el análisis de textura son importantes¹⁹. Además, se ha utilizado el método de la celda de flujo para investigar los efectos de las microestructuras sumergidas en aceite sobre los flujos activos¹⁶ y los pilares para atrapar defectos en los flujos activos³¹. Este método funciona muy bien para la formación de una capa activa continua, y la calidad de imagen es excelente. Sin embargo, el paso de centrifugación utilizado para producir la capa activa 2D final puede ser difícil de llevar a cabo, y las células de flujo son propensas a fugas y burbujas de aire. El método invertido es una alternativa muy útil con una alta tasa de éxito, es fácil de construir y se puede utilizar para cualquier patrón de sustrato o geometría siempre que se pueda crear un molde maestro impreso en 3D de alta resolución. Este método también es útil para observar los efectos del confinamiento geométrico en la dinámica nemática activa porque hace que el llenado de pozos sea relativamente sencillo.

En este artículo, se describen dos formas de formar una nemática activa a partir de microtúbulos y motores de quinesina, además de una técnica para confinar los materiales en pozos. El sistema presentado representa el ejemplo más limpio de una fase nemática activa actualmente en la literatura y ha sido reproducido por varios grupos en todo el mundo. La importancia de este material no solo radica en los orígenes biológicos de sus componentes, sino también porque abre una dirección completamente nueva en fluidos ordenados activos. Al trabajar con este sistema y dilucidar sus propiedades fundamentales, los científicos pueden avanzar hacia el diseño de fases activas totalmente sintéticas.

Los experimentos centrados en los efectos del confinamiento en la nemática activa tienen el potencial de responder preguntas fundamentales sobre el comportamiento de los flujos activos y la dinámica de defectos topológicos bajo confinamiento topológico. El método presentado aquí ayudará en la realización de una variedad de experimentos centrados en la geometría y su análisis, incluida la microfluídica y la mezcla activa.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
20 kD PEG (polyethylene glycol))	Sigma Aldrich	1419109	Depletion agent CAS Number: 125061-88-3
3-(trimethoxysilyl)propyl methacrylate	Sigma Aldrich	M6514-50ML	CAS Number: 2530-85-0
3D printer & Resin	Phrozen		Phrozen sonic mini 8K 3D printer - Aqua Gray 8K resin
40% Acrylamide Solution	BIO-RAD	1610140	CAS Number: 7732-18-5, 79-06-1
Acetic Acid	Fisher		CAS Number: 64-19-7
Acetone	Sigma Aldrich		CAS Number: 67-64-1
Adhesive sheets (NOTE: "Parafilm" is an alternative)	Grace Bio-Labs	620001	SecureSeal
Ammonium Persulfate	Sigma Aldrich	A3678	CAS Number: 7727-54-0
Aquapel (NOTE: "RainX" is an alternative)	Aquapel Glass Treatment		hydrophobic glass treatment
ATP (Adenosine triphosphate)	Sigma Aldrich	A1852	CAS Number: 34369-07-8
Beakers	VWR
Catalase	Sigma Aldrich	C9322	CAS Number: "9001-05-2"
Desiccator	Bel-art
Digital CMOS camera	Hamamatsu	ORCA - Flash4.0 LT+
DTT (Dithiothreitol)	Sigma Aldrich	D9779	CAS Number: "3483-12-3"
EGTA (3,12-bis(carboxymethyl)-6,9-dioxa-3,12-diazatetradecane-1,14-dioic acid)	Sigma Aldrich	MFCD00004291	CAS Number: 67-42-5
Ethanol	Sigma Aldrich		CAS Number: 64-17-5
Fluorescence microscope	Leica	DM 2500P
Glass Coverslips	VWR	48368-040
Glass Slides	VWR	16004-430
Glucose	Sigma Aldrich	G7021	CAS Number: 50-99-7
Glucose Oxidase	Sigma Aldrich	345386	CAS Number: 9001-37-0
GMPCPP (guanylyl 5'-α,β-methylenediphosphonate)	Jena Bioscience	NU-405S	CAS Number: 14997-54-7
HFE7500 Oil	3M
Hot Plate	Fisher Scientific	Thermix hot plate model 100M
Isopropyl Alcohol	VWR
KCl (potassium chloride)	Sigma Aldrich	P5405	CAS Number: 7447-40-7
Methanol	Sigma Aldrich		CAS Number: 67-56-1
MgCl2 (Magnesium Chloride)	Sigma Aldrich	208337	CAS Number: 7786-30-3
Microcentrifuge tubes	Eppendorf - Thermo Fisher	1.5 mL
Nanopure water purifier	Sartorius	arium mini
NaOH (Sodium hydroxide)	Sigma Aldrich	SX0603	CAS Number: 1310-73-2
Petri Dishes	VWR
PH Meter	Thermo Scientist	Orion 3 STAR
Phosphoenol-pyruvate (PEP)	Sigma Aldrich	MFCD00044476	CAS Number: 4265-07-0
PIPES (1,4-Piperazinediethanesulfonic acid)	Sigma Aldrich		CAS Number: 5625-37-6
Pipettes (0.2 - 1000 µl)	VWR
Pluronic F-127	Sigma Aldrich	2594628
RAN Surfactant (NOTE: "FluoSurf" from Emulso is an alternative)	Ran Biotechnologies	008-FluoroSurfactant-2wtH-50G
Silicon Oil (100mpa s-1000 mpa s)	Sigma Aldrich		CAS Number: 63148-52-7
Streptavidin	Thermofisher	S888
Swinging Bucket Centrifuge	Thermo Scientist	Sorvall legend RT+
Sylgard 184 Elastomer base	World Precision Instruments	SYLG184
Sylgard 184 Elastomer Curing agent	World Precision Instruments	SYLG184
Table top centrifuge	Eppendorf	MiniSpin Plus
TEMED (Tetramethylethylenediamine)	BIO-RAD	1610800	CAS Number: 110-18-9
Trolox (6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid)	Sigma Aldrich	MFCD00006846	CAS Number: 53188-07-1
Tubulin	Cytoskeleton	T240-B
Tubulin (Rhodamine labeled)	Cytoskeleton	TL590M-A
Ultracentrifuge	Beckman	Optima Max-TL
UV Light	RapidFix
UV-curable glue (NOTE: "Norland NO81" is an alternative)	RapidFix
Water Bath	Thelco
Whatman Filter paper	Sigma Aldrich	WHA1001325