Un sistema de bicapa lipídica soportado por nanobar para el estudio de proteínas de detección de curvatura de membrana in vitro

Resumen

Aquí, se desarrolla un sistema de bicapa lipídica soportado por nanobarras para proporcionar una membrana sintética con una curvatura definida que permite la caracterización de proteínas con capacidad de detección de curvatura in vitro.

Resumen

La curvatura de la membrana juega un papel importante en varios procesos esenciales de las células, como la migración celular, la división celular y el tráfico de vesículas. No solo es generado pasivamente por actividades celulares, sino que también regula activamente las interacciones de proteínas y está involucrado en muchas señales intracelulares. Por lo tanto, es de gran valor examinar el papel de la curvatura de la membrana en la regulación de la distribución y dinámica de proteínas y lípidos. Recientemente, se han desarrollado muchas técnicas para estudiar la relación entre la membrana curva y la proteína in vitro. En comparación con las técnicas tradicionales, la bicapa lipídica (SLB) soportada por nanobar, recientemente desarrollada, ofrece un alto rendimiento y una mejor precisión en la generación de curvatura de membrana al formar una bicapa lipídica continua en matrices de nanobarras con patrones con una curvatura de membrana predefinida y control plano local. Tanto la fluidez lipídica como la sensibilidad proteica a las membranas curvas se pueden caracterizar cuantitativamente utilizando imágenes de microscopía de fluorescencia. Aquí, se presenta un procedimiento detallado sobre cómo formar un SLB en superficies de vidrio fabricadas que contienen matrices de nanobarras y la caracterización de proteínas sensibles a la curvatura en dicho SLB. Además, se cubren los protocolos para la reutilización de nanochips y el procesamiento de imágenes. Más allá del nanobar-SLB, este protocolo es fácilmente aplicable a todos los tipos de chips de vidrio nanoestructurado para estudios de detección de curvatura.

Introducción

La curvatura de la membrana es un parámetro físico crítico de una célula que ocurre en una variedad de procesos celulares como la morfogénesis, la división celular y la migración celular¹. Ahora se reconoce ampliamente que la curvatura de la membrana va más allá de un simple resultado de eventos celulares; En cambio, se ha convertido en un regulador eficaz de las interacciones de proteínas y la señalización intracelular. Por ejemplo, se encontró que varias proteínas involucradas en la endocitosis mediada por clatrina se unen preferentemente a la membrana curva, lo que resulta en la formación de un punto caliente para la endocitosis². Hay muchas causas diferentes de deformación de la membrana, como el tirón de la membrana por las fuerzas citoesqueléticas, la presencia de asimetría lipídica con grupos de cabeza de diferentes tamaños, la existencia de proteínas transmembrana con forma cónica, la acumulación de proteínas formadoras de membrana como las proteínas de dominio BAR (llamadas así por las proteínas Bin, anfifisina y Rvs), y la inserción del dominio de las hélices anfipáticas en la membrana¹ . Curiosamente, estas proteínas y lípidos no solo deforman la membrana, sino que también pueden sentir la curvatura de la membrana y exhibir acumulación preferencial¹. Por lo tanto, es crucial estudiar si y cómo las membranas con diferentes curvaturas alteran la distribución y la dinámica de las proteínas y lípidos unidos a ellas y los posibles impactos en los procesos intracelulares relacionados.

Se han desarrollado muchas técnicas para analizar la interacción entre la membrana curva y las proteínas tanto en células vivas como en sistemas in vitro. El sistema de células vivas proporciona un entorno celular real con rica diversidad lipídica y regulación dinámica de señalización proteica 2,3,4,5,6,7. Sin embargo, un sistema tan sofisticado es difícil de estudiar debido a las incertidumbres y fluctuaciones en el entorno intracelular. Por lo tanto, los ensayos in vitro utilizando una membrana artificial compuesta de especies lipídicas conocidas y proteínas purificadas se han convertido en poderosos sistemas de reconstitución para caracterizar la relación entre proteínas y membranas curvas. Tradicionalmente, los liposomas de diferentes diámetros se generan por extrusión para detectar proteínas sensibles a la curvatura mediante un ensayo de cosedimentación utilizando fuerza centrífuga o un ensayo de coflotación con un gradiente de densidad para evitar la agregación de proteínas ^8,9. Sin embargo, la curvatura de los liposomas extruidos está limitada por el tamaño de poro disponible del filtro de membrana utilizado en la extrusora¹⁰. Se ha demostrado que el ensayo de curvatura de liposoma único (SLiC) supera esta limitación, en el que los liposomas con diferentes diámetros son marcados con fluorescencia e inmovilizados sobre la superficie para que la curvatura pueda ser marcada por la intensidad fluorescente¹¹. Sin embargo, se ha observado una fuerte variabilidad en la composición lipídica en vesículas pequeñas, lo que afecta la precisión de la medición de la curvatura¹². Los experimentos de tracción de la correa proporcionan una medición más precisa de la curvatura en la correa transitoria extraída de vesículas unilamelares gigantes (GUV) utilizando una pinza óptica, donde la curvatura puede ser bien controlada por la tensión de membrana generada^13,14. Este método es adecuado para estudiar proteínas de detección de curvatura positiva o negativa, pero está limitado por el rendimiento de la generación de tubos¹⁰. El ensayo de tubos de membrana soportados (SMrT) permite la generación simultánea de múltiples tubos de membrana que se extruyen del mismo depósito de lípidos mediante flujos microfluídicos. Sin embargo, la curvatura de la membrana varía intrínsecamente a lo largo del nanotubo, lo que compromete la precisión de la medición de la curvatura basada en la intensidad de fluorescencia^15,16. En comparación, el uso de pequeñas vesículas unilamelares (SUVs, diámetro <100 nm¹⁷) para formar una bicapa lipídica soportada (SLB) en superficies que contienen topografías diseñadas generó una sola membrana bicapa con curvaturas predeterminadas por nanofabricación o nanomateriales en alta precisión^18,19,20.

Aquí, presentamos un protocolo para la formación del SLB en superficies de nanochips fabricadas con matrices de nanobarras y cómo se puede usar para probar la sensibilidad a la curvatura de proteínas in vitro. Como se muestra en la Figura 1, hay seis componentes esenciales del ensayo: A) Limpieza y montaje del chip con una cámara microfluídica; B) Preparación de SUV con composición lipídica definida; C) Formación del SLB en un nanochip y unión con proteínas sensibles a la curvatura; D) Obtención de imágenes y caracterización de las proteínas sensibles a SLB y curvatura bajo microscopía de fluorescencia; E) Limpieza del chip para su reutilización; F) Procesamiento de imágenes para el análisis cuantitativo de la capacidad de detección de curvatura de proteínas. El protocolo detallado se describe paso a paso a continuación.

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Protocolo

1. Limpieza del nanochip

1. Coloque el nanochip en un vaso de precipitados de 10 ml con el lado estampado hacia arriba.
   NOTA: Este nanochip de cuarzo se ha fabricado mediante litografía de haz de electrones como se describió anteriormente²¹. La geometría y la disposición de la nanoestructura en el chip se pueden diseñar a medida. Los tamaños de las nanobarras de gradiente utilizadas aquí son 2000 nm de longitud, 600 nm de altura y 100 a 1000 nm de ancho (conjunto de pasos de 100 nm).
2. Agregue cuidadosamente 1 ml de ácido sulfúrico al 98% al vaso de precipitados y asegúrese de que el ácido cubra completamente la parte frontal y posterior del chip.
   NOTA: El ácido sulfúrico al 98% es extremadamente corrosivo y puede causar una rápida destrucción de tejidos y quemaduras químicas graves al contacto con la piel o los ojos. Úselo en la campana extractora con la protección adecuada.
3. Gire lentamente el vaso de precipitados y agregue 200 μL de peróxido de hidrógeno al 30% gota a gota hasta que todo el vaso de precipitados se caliente. Asegúrese de que el ácido sulfúrico y el peróxido de hidrógeno estén bien mezclados para formar una solución de piraña para la eliminación de moléculas orgánicas del nanochip¹⁷. Existen técnicas alternativas para generar el SLB en superficies hidrófilas limpias, como la luz UV y la exposición al ozono como se describió anteriormente²³.
   NOTA: La reacción es extremadamente exotérmica y puede hacer que la solución hierva, así que agregue peróxido de hidrógeno al ácido sulfúrico gota a gota y siga girando.
4. Coloque el vaso de precipitados en un recipiente de vidrio secundario y mantenga el nanochip sumergido en la solución de piraña durante la noche para limpiar las impurezas a fondo.
   NOTA: Coloque el vaso de precipitados en la campana extractora sin ninguna cubierta en caso de que la reacción pueda generar gas.
5. Saque el vaso de precipitados y pipete cuidadosamente la solución de piraña en un recipiente de residuos ácidos.
6. Cargue 5 ml de agua desionizada en el vaso de precipitados para diluir el ácido residual y desecharlo en los desechos ácidos. Repita este paso cinco veces y use 5 M NaOH para neutralizar los desechos ácidos.
7. Agarre el chip con pinzas y lávelo con un chorro continuo de agua desionizada para eliminar completamente el ácido residual. Seque el chip con 99,9% de gas nitrógeno para la formación de SLB²².

2. Generación de pequeñas vesículas unilamelares (SUVs)

1. Añadir 100 μL de cloroformo en un vial de color ámbar.
   NOTA: El cloroformo es un líquido altamente volátil e incoloro, y puede ser tóxico si se inhala o ingiere. Úselo en la campana extractora con la máscara y los guantes puestos.
2. Disolver 500 μg de la mezcla lipídica en cloroformo. La composición de la mezcla de lípidos utilizada aquí es 89.5 mol% de fosfatidilcolinas de huevo (PC), 10 mol% de fosfatidilserina cerebral (PS) y 0.5 mol% de Texas Red 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, sal de trietilamonio (Texas Red DHPE).
3. Secar la mezcla lipídica en el vial con gas nitrógeno al 99,9% hasta que el cloroformo se volatilice y la mezcla lipídica esté seca.
   NOTA: Este paso debe realizarse en la campana extractora. Evite las salpicaduras de líquido al secarlo.
4. Coloque la mezcla lipídica presente en el vial ámbar sin tapa en el desecador al vacío cubierto de papel de aluminio. Luego seque al vacío la muestra con una bomba durante 3 h para volatilicar completamente el cloroformo.
5. Añadir 250 μL de tampón salino tamponado con fosfato (PBS) al vial. Vortex la solución hasta que sea homogénea.
   NOTA: El tampón PBS consiste en 150 mM de NaCl, sin calcio, magnesio y rojo fenol; el pH se ajusta a 7.2 para hacer la bicapa lipídica PC y PS.
6. Sonicar la mezcla lipídica durante 30 minutos a una frecuencia de 50 kHz en un sonicador de baño. Luego transfiera la mezcla lipídica a un tubo de centrífuga de 1,5 ml y selle con parafilm.
7. Congelar la mezcla de lípidos en nitrógeno líquido durante 20 s y luego descongelar a 42 °C durante 2 minutos en un baño maría. Repita los ciclos de congelación-descongelación 30 veces. Después de eso, la mezcla de lípidos parece un líquido claro.
   PRECAUCIÓN: El nitrógeno líquido tiene un punto de ebullición de aproximadamente -195.8 ° C. Puede causar congelación o quemaduras criogénicas. Úselo en el espacio no confinado con guantes de aislamiento térmico.
8. Enjuague dos jeringas herméticas al gas de vidrio y el conector de la miniextrusora con etanol, cloroformo y metanol, respectivamente. Repita la secuencia de enjuague cinco veces para limpiar previamente el aparato. Déjelos en la campana extractora hasta que el disolvente orgánico esté completamente volatilizado.
9. Ensamble el aparato miniextrusor y pase 500 μL de tampón PBS a través del conector para humedecer previamente el aparato, luego deseche el tampón de otra jeringa. Este paso elimina las impurezas y facilita la extrusión.
10. Ensamble el aparato de miniextrusora con una membrana filtrante de policarbonato del tamaño de un poro de 100 nm.
    NOTA: El tamaño de poro de la membrana del filtro determina el diámetro de los liposomas.
11. Tome 500 μL de tampón PBS con una de las jeringas y empújelo suavemente a través del filtro para llenar la segunda jeringa vacía en el otro extremo. Repita la extrusión hacia adelante y hacia atrás tres veces para comprobar la fuga del aparato y deseche el tampón de la segunda jeringa.
12. Pase la mezcla de lípidos a través de la mini extrusora para reemplazar el tampón PBS. Luego extruya hacia adelante y hacia atrás 20 veces para formar SUV. El carácter multilamelar de las vesículas puede ser retenido con un número insuficiente de tiempos de extrusión, lo que afectará la formación de SLB²³.
13. Recoja los SUV de la segunda jeringa para reducir la contaminación con partículas más grandes y transfiéralos a un tubo de centrífuga de 1,5 ml.
    NOTA: Extraiga la jeringa directamente del conector en caso de que la jeringa se rompa.
14. Envuelva el tubo con papel de aluminio para evitar el blanqueamiento de los lípidos marcados con fluorescencia y guárdelos a 4 °C. Por lo general, los SUV se pueden almacenar hasta por 7 días.

3. Formación del SLB en un nanochip

1. Saque el nanochip limpio del agua desionizada con cuidado con un par de pinzas y séquelo con gas nitrógeno al 99,9%.
2. Realizar la limpieza superficial del nanochip con tratamiento de plasma de aire durante 1 h.
3. Ensamble el nanochip en una cámara de polidimetilsiloxano (PDMS), que consta de dos piezas de PDMS: un PDMS medio y un PDMS superior (Figura 1A). El PDMS medio es delgado (~ 0.5 mm) con una gran abertura de forma ovalada en el centro para garantizar una exposición suficiente al patrón de nanobar. El PDMS superior es grueso (~ 4.0 mm) con dos pequeños orificios dentro de la gran abertura ovalada como entrada y salida para el manejo de líquidos.
   1. Coloque el chip sobre una superficie limpia con el patrón hacia arriba.
   2. Cubra suavemente el PDMS medio con el chip y asegúrese de que todo el patrón esté expuesto al área central de la gran abertura de forma ovalada en el PDMS medio.
   3. Cubra el PDMS superior con el PDMS medio y mantenga sus dos orificios pequeños dentro de la región del orificio ovalado grande del PDMS medio. Luego se ensambla la cámara PDMS.
      NOTA: PDMS es el polímero orgánico a base de silicio más utilizado. Es biocompatible, transparente y deformable para ser diseñado como una forma personalizada para el ensamblaje de chips y la obtención de imágenes bajo el microscopio. Más importante aún, se puede pegar covalentemente a otra capa de PDMS o vidrio firmemente después del tratamiento con plasma, lo que lo hace adecuado como cámara para preparar el SLB. Este paso garantiza que cada capa de PDMS esté bien ajustada para evitar huecos y fugas.
4. Cargue los SUV en la cámara PDMS desde uno de los dos orificios pequeños en el PDMS superior con una pipeta e incube durante 15 minutos a temperatura ambiente para formar el SLB.
5. Pipetea suavemente el tampón PBS en la cámara PDMS desde un lado del orificio pequeño y retira los desechos con un bastoncillo de algodón del otro orificio para lavar los SUV no unidos. Luego adquiera el SLB formado en el nanochip (la calidad del SLB se prueba mediante la recuperación de fluorescencia después del fotoblanqueo (FRAP) como se muestra en el paso 4.4 y se discute en la sección de resultados representativos).
   NOTA: Al pipetear el tampón PBS en la cámara, la punta de la pipeta debe estar llena del tampón y en contacto con la superficie del líquido para evitar inyectar burbujas.

4. Obtención de imágenes del SLB y de la unión a la proteína de detección de curvatura en el nanochip

NOTA: Esta sección dependerá del sistema de microscopio disponible para el experimento. Aquí, se describirá una guía general sobre cómo realizar las imágenes. Los ajustes detallados se pueden cambiar entre las diferentes configuraciones del microscopio.

1. Configure la microscopía confocal de escaneo láser utilizando un objetivo de aceite 100x (N.A.1.4). Abra el software ZEN para seleccionar la potencia del láser de excitación que puede excitar la fluorescencia del lípido y la proteína. Elija el modo de adquisición > Configuración inteligente > Texas Red DHPE / EGFP.
2. Ajuste el enfoque con la perilla de enfoque para ubicar las nanobarras en el chip hasta que los bordes de la nanobarra estén afilados debajo del canal lipídico.
3. Establezca los parámetros de escaneo como se muestra a continuación para obtener una imagen de control del canal lipídico antes de agregar proteínas: Tamaño de fotograma = 512 px x 512 px (512 píxeles x 512 píxeles, un tamaño de píxel de 124 nm), Bits por píxel = 16 (profundidad de 16 bits), Velocidad de escaneo = 5 y Promedio = 4 (modo promedio de cuatro veces por línea).
4. Realice el ensayo FRAP blanqueando la bicapa lipídica marcada con fluorescencia en un área aleatoria de nanobar.
   1. Seleccione las casillas de verificación Regiones de experimento y Blanqueo . Dibuje un área circular de 5 μm de diámetro que pueda incluir toda la nanobarra en el centro (el tamaño de la nanobarra es de 2 μm) y agregue a las regiones experimentales. Introduzca parámetros de imágenes de lapso de tiempo como el siguiente ejemplo: elija Velocidad de escaneo = 9 y Promedio = 1. Elija Serie temporal > Duración = 100 ciclos e Intervalo = 2 s. Introduzca parámetros de blanqueo como el siguiente ejemplo: seleccione la casilla de verificación Iniciar después de # imágenes y elija tres imágenes.
   2. Seleccione las casillas de verificación láser que realizan FRAP y cambie la potencia al 100,0%. Haga clic en Iniciar experimento para el experimento FRAP.
      NOTA: FRAP es un método común para caracterizar la movilidad de las moléculas celulares. Si el SLB tiene buena fluidez, la fluorescencia en el área blanqueada se recuperará gradualmente a medida que los fluoróforos blanqueados se difundan y los fluoróforos no blanqueados de otras áreas se difundan.
5. Cargue la solución proteica en la cámara PDMS e incube durante 5 minutos a temperatura ambiente para permitir la unión de la proteína en el SLB.
   NOTA: Las proteínas utilizadas en la Figura 2G,H para demostrar que la composición lipídica facilita la unión de proteínas en SLB curvadas con nanobarras son 74 μM GFP y 79 μM GFP-His. Estas dos proteínas son proteínas de fluorescencia verde sin o con His-tag. Las proteínas utilizadas para el estudio de detección de curvatura en la Figura 4 y la Figura 5 son 16 μM F-BAR, 16 μM IDR FBP17 y 16 μM FBAR+IDR^FBP17. Estas tres proteínas son los dominios de FBP17, que es una proteína BAR típica que se asume intuitivamente como generadores y sensores de curvatura. Cada volumen de proteína es de 20 μL.
6. Vuelva a enfocar las nanobarras y repita el paso 4.3 para tomar imágenes de los canales de lípidos y proteínas para la detección de la curvatura de proteínas.
7. Repita el paso 4.4 para realizar el ensayo FRAP en los canales de lípidos y proteínas y realice imágenes de lapso de tiempo para caracterizar la movilidad de la proteína de detección de curvatura.

5. Reutilización del nanochip

1. Agarre el nanochip con pinzas y sepáralo con cuidado de la cámara PDMS en un vaso de precipitados de 50 ml lleno de agua desionizada.
   NOTA: Este es un paso crítico. Evite que las pinzas toquen la nanoestructura y no fuerce el chip a separarse para evitar grietas.
2. Lave bien el nanochip con etanol anhidro para eliminar los residuos orgánicos adheridos a la superficie.
   NOTA: Use papel de seda limpio para eliminar el agua de la superficie antes de lavar con etanol anhidro.
   PRECAUCIÓN: El etanol anhidro es un producto químico altamente volátil y ligeramente peligroso. Evite el contacto con la piel y los ojos. Úselo en la campana extractora con la máscara y los guantes puestos.
3. Lave bien el chip con abundante agua desionizada para eliminar el etanol residual. Luego seque el chip con 99.9% de gas nitrógeno.
   NOTA: Es importante eliminar todos los restos de etanol en el chip antes de continuar con el siguiente paso porque el ácido piraña puede reaccionar violentamente con el disolvente orgánico y puede causar explosiones.
4. Coloque el chip en un vaso de precipitados limpio de 10 ml con el lado del patrón hacia arriba y limpie el chip con una solución de piraña para su reutilización, que sigue los mismos pasos que la "limpieza del nanochip".

6. Cuantificación de imágenes

1. Gire las imágenes adquiridas por un microscopio para que la matriz de nanobarras esté en posición vertical para su posterior análisis en el software Fiji.
2. Utilice un código de MATLAB escrito a medida 'c_pillarmask_averaging' para localizar la nanobarra individual mediante una máscara cuadrada (51 píxeles x 51 píxeles) tanto en el canal lipídico como en el canal de proteínas.
   NOTA: Este código de MATLAB está especialmente diseñado para el nanochip. Se puede obtener en GitHub a través del enlace: https://github.com/wtzhaolab/GNB_SLB_MX.
3. Resta las señales de fondo de cada imagen con los tres ROI (5 píxeles x 5 píxeles) en las esquinas de la imagen mediante la función meshgrid en el código de MATLAB 'BarGra_avg'. Esta operación tiene como objetivo corregir posibles ruidos de fondo desiguales causados por la configuración del microscopio o la nivelación de virutas en la etapa del microscopio.
4. Genere las imágenes promedio de las nanobarras del mismo tamaño utilizando el código 'BarGra_avg' de MATLAB, donde cada punto es la media de los valores en ese punto en todas las máscaras cuadradas de nanobarras individuales. Genere gráficos de superficie 3D de las imágenes promedio en el software Fiji para mostrar la distribución promedio de la señal alrededor de las nanobarras de forma intuitiva. Elija Analizar > trazado de superficie > Entrada 100 para el multiplicador de polígonos y seleccione las casillas Sombreado, Eje de dibujo y Suavizar.
5. Segmente cada nanobarra en tres áreas, que incluyen dos áreas de extremo de nanobarra y un área de centro de nanobarra para extraer sus intensidades de fluorescencia respectivamente mediante el código 'avg_nanobar_quantification' de MATLAB. Los tamaños de los ROI de las nanobarras se ajustan de acuerdo con la dimensión de las nanobarras utilizando el archivo de 'posición'.
6. Divida las intensidades de las proteínas por las intensidades lipídicas extraídas del código 'avg_nanobar_quantification' de MATLAB en el área del extremo de la barra para obtener la densidad del extremo de la nanobarra que excluye el efecto del área superficial.
7. Trazar la densidad del extremo de nanobarra con diferentes concentraciones en GraphPad Prism para obtener la curva de unión. Abra el menú Analizar . Elija Regresión no lineal (ajuste de curva) > Enlace - Saturación > Enlace específico con función de pendiente de pendiente para ajustar la curva con la ecuación de Hill y, a continuación, calcular el valor de KD y coeficiente de Hill.
8. Las intensidades de lípidos y proteínas se normalizan a sus correspondientes intensidades en el centro de nanobares de 600 nm adquiridas en la misma imagen utilizando el código de MATLAB 'avg_nanobar_quantification'.
9. Utilice los nueve píxeles más brillantes de intensidades de proteínas normalizadas en el área de extremo de nanobarra dividida por el área de centro de barra para cuantificar la detección de curvatura de proteínas con nanobarras del mismo tamaño, el valor se denomina "relación de extremo a centro". Utilice la proporción de intensidad de proteína normalizada para normalizar la intensidad de lípidos para cuantificar el rango de detección de curvatura de proteínas con nanobarras de diferentes tamaños, el valor se denomina "Densidad de extremo de nanobarra normalizada". Estos valores se calculan mediante el código de MATLAB 'avg_nanobar_quantification'.
10. Cargue la imagen de pila FRAP en el software Fiji. Elija el área FRAP y genere un ROI. Elija la función Más > medida múltiple para medir la intensidad del área FRAP para cada vez. Trazar la intensidad en GraphPad Prism para generar la curva de recuperación FRAP.

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Resultados

El diseño de nanobarras se recomienda para sondear proteínas de detección de curvatura positiva, que contiene un medio círculo en cada extremo con curvatura definida por el ancho de nanobarra y un control de curvatura plana / cero localmente en el centro (Figura 2A, B). La formación exitosa del SLB en nanobarras da como resultado señales de marcadores lipídicos distribuidos uniformemente en toda la superficie de la nanobarra, como se muestra en la

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Discusión

El sistema nanobar-SLB descrito aquí ofrece una combinación única de las ventajas en varios ensayos in vitro existentes. Revela eficientemente la unión preferencial de proteínas a membranas altamente curvadas como el ensayo de flotación o sedimentación de liposomas, pero requiere muchas menos muestras y ofrece una curvatura definida con mayor precisión en nanobarras individuales ^8,29. También ofrece una amplia gama de curvatura controlada con pr...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anhydrous Ethanol	Sigma-Aldrich	100983
Aluminum foil	Diamond	RN0879999FU
Amber Vial	Sigma-Aldrich	27115-U
Brain PS: L-α-phosphatidylserine (Brain, Porcine) (sodium salt)	Avanti Polar Lipids, Inc.	840032
10 mL Beaker	Schott-Duran	SCOT211060804
50 mL Beaker	Schott-Duran	SCOT211061706
1000 mL Beaker	Schott-Duran	SCOT211065408	The second container
Chloroform	Sigma-Aldrich	V800117
Cotton buds	Watsons
18:1 DGS-NTA(Ni): 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (nickel salt)	Avanti Polar Lipids, Inc.	790404
Egg PC: L-α-phosphatidylcholine (Egg, Chicken)	Avanti Polar Lipids, Inc.	840051
F-BAR	Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore		Proteins and peptide
F-BAR+IDR	Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore		Proteins and peptide
GFP	Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore		Proteins and peptide
GFP-His	Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore		Proteins and peptide
GraphPad Prism	GraphPad	V9.0.0
Hydrogen Peroxide, 30% (Certified ACS)	Thermo Scientific	H325-500
IDR from human FBP17	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.
ImageJ	National Institutes of Health	1.50d
Laser Scanning Confocal Microscopy	Zeiss	LSM 800 with Airyscan	100x (N.A.1.4) oil objective.
Methanol	Fisher scientific	10010240
Mini-extuder	Avanti Polar Lipids, Inc.	610000-1EA
1.5 mL Microtubes	Greiner	616201
MATLAB	Mathworks	R2018b
Nuclepore Hydrophilic Membrane,0.1 μm	Whatman	800309
Phosphate Bufferen Saline (PBS)	Life Technologies Holdings Pte Ltd.	70013
Polydimethylsiloxane (PDMS) Base	Dow Corning Corporation	SYLGARD 184
Polydimethylsiloxane (PDMS) Crosslinker	Dow Corning Corporation	SYLGARD 184
Plasma Cleaner	HARRICK PLASMA	PDC-002-HP
Quartz Nanochip	Donghai County Alfa Quartz Products CO., LTD
Sodium Hydroxide	Sigma-Aldrich	795429
Sulfuric acid	Sigma-Aldrich	258105
Texas Red DHPE: Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, Triethylammonium Salt	Life Technologies Holdings Pte Ltd.	T1395MP
Tweezer	Gooi	PDC-002-HP
Ultrasonic Cleaners	Elma	D-78224
Voterx	Scientific Industries	G560E
Vacuum Desiccator	NUCERITE	5312
Water Bath	Julabo	TW8