Afinidad celular de la emulsión estabilizada por partículas para aumentar la internalización del antígeno

Resumen

Para diseñar racionalmente adyuvantes eficientes, desarrollamos la emulsión de Pickering estabilizada con nanopartículas de ácido poliláctico-co-glicólico (PNPE). El PNPE poseía una suavidad única y una interfaz hidrófoba para un potente contacto celular y ofrecía una carga de antígenos de alto contenido, mejorando la afinidad celular del sistema de administración a las células presentadoras de antígenos e induciendo una internalización eficiente de los antígenos.

Resumen

La afinidad celular de las micro / nanopartículas es la condición previa para el reconocimiento celular, la absorción celular y la activación, que son esenciales para la administración de fármacos y la respuesta inmune. El presente estudio surgió de la observación de que generalmente se consideran los efectos de la carga, el tamaño y la forma de las partículas sólidas sobre la afinidad celular, pero rara vez nos damos cuenta del papel esencial de la suavidad, el fenómeno de reestructuración dinámica y la interacción compleja de la interfaz en la afinidad celular. Aquí, desarrollamos la emulsión de Pickering estabilizada con nanopartículas (PNPE) de ácido poliláctico-co-glicólico (PLGA) que superó las deficiencias de las formas rígidas y simuló la flexibilidad y fluidez de los patógenos. Se estableció un método para probar la afinidad de PNPE con las superficies celulares y elaborar sobre la posterior internalización por parte de las células inmunes. La afinidad de PNPE con vesículas extracelulares biomiméticas (bEV), el reemplazo de las células dendríticas de la médula ósea (BMDC), se determinó utilizando una microbalanza de cristal de cuarzo con monitoreo de disipación (QCM-D), que permitió el monitoreo en tiempo real de la adhesión de la emulsión celular. Posteriormente, se utilizó el PNPE para administrar el antígeno (ovoalbúmina, OVA) y se observó la captación de los antígenos por BMDC utilizando el microscopio de barrido láser confocal (CLSM). Los resultados representativos mostraron que el PNPE disminuyó inmediatamente la frecuencia (ΔF) cuando encontró los bEV, lo que indica una rápida adhesión y una alta afinidad del PNPE con los BMDC. PNPE mostró una unión significativamente más fuerte a la membrana celular que las micropartículas PLGA (PMP) y el adyuvante AddaVax (denotado como nanoemulsión estabilizada con surfactante [SSE]). Además, debido a la mayor afinidad celular con los inmunocitos a través de cambios dinámicos de curvatura y difusiones laterales, la captación de antígenos se incrementó posteriormente en comparación con PMP y SSE. Este protocolo proporciona información para diseñar formulaciones novedosas con alta afinidad celular e internalización eficiente de antígenos, proporcionando una plataforma para el desarrollo de vacunas eficientes.

Introducción

Para combatir las enfermedades epidémicas, crónicas e infecciosas, es imperativo desarrollar adyuvantes efectivos para las vacunas profilácticas y terapéuticas ^1,2. Idealmente, los adyuvantes deben poseer una excelente seguridad y activación inmune ^3,4,5. Se cree que la captación y el proceso efectivos de antígenos por las células presentadoras de antígeno (APC) son una etapa esencial en las cascadas de señalización aguas abajo y el inicio de la respuesta inmune ^6,7,8. Por lo tanto, obtener una comprensión clara del mecanismo de interacción de las células inmunes con antígenos y diseñar adyuvantes para mejorar la internalización son estrategias eficientes para mejorar la eficiencia de las vacunas.

Las micro/nanopartículas con propiedades únicas han sido previamente investigadas como sistemas de liberación de antígenos para mediar la captación celular de antígenos y la interacción celular con patrones moleculares asociados a patógenos ^9,10. Al entrar en contacto con las células, los sistemas de entrega comienzan a interactuar con la matriz extracelular y la membrana celular, lo que condujo a la internalización y las respuestas celulares posteriores^11,12. Estudios previos han sacado a la luz que la internalización de las partículas tiene lugar a través de la adhesión membrana-partícula celular¹³, seguida de la deformación flexible de la membrana celular y la difusión del receptor a la membrana superficial^14,15. En estas circunstancias, las propiedades del sistema de entrega dependen de la afinidad con los APC, que posteriormente afectan la cantidad de absorción^16,17.

Para obtener información sobre el diseño del sistema de administración para mejorar la respuesta inmune, se han centrado amplios esfuerzos en la investigación de la relación entre las propiedades de las partículas y la absorción celular. El presente estudio surgió de la observación de que las micro/nanopartículas sólidas con diversas cargas, tamaños y formas a menudo se estudian bajo esta luz, mientras que el papel de la fluidez en la internalización de antígenos rara vez se investiga^18,19. De hecho, durante la adhesión, las partículas blandas demostraron cambios dinámicos de curvatura y difusiones laterales para aumentar el área de contacto para interacciones multivalentes, que difícilmente pueden ser replicadas por las partículas sólidas^20,21. Además, las membranas celulares son bicapas de fosfolípidos (esfingolípidos o colesterol) en el sitio de absorción, y las sustancias hidrofóbicas pueden alterar la entropía conformacional de los lípidos, reduciendo la cantidad de energía requerida para la absorción celular^22,23. Por lo tanto, amplificar la movilidad y promover la hidrofobicidad del sistema de administración puede ser una estrategia efectiva para fortalecer la internalización del antígeno para mejorar la respuesta inmune.

La emulsión Pickering, estabilizada por partículas sólidas ensambladas en la interfaz entre dos líquidos inmiscibles, ha sido ampliamente utilizada en el campo biológico^24,25. De hecho, las partículas agregantes en la interfaz aceite/agua determinan la formulación de estructuras multinivel, que promueven interacciones multinivel entre el sistema de administración y la celular, e inducen aún más propiedades fisicoquímicas multifuncionales en la administración de fármacos. Debido a su deformabilidad y movilidad lateral, se esperaba que las emulsiones de Pickering entraran en interacción celular multivalente con los inmunocitos y fueran reconocidas por las proteínas de membrana²⁶. Además, como los núcleos de micelas aceitosas en las emulsiones Pickering no están completamente cubiertos con partículas sólidas, las emulsiones Pickering poseen espacios de diferentes tamaños entre las partículas en la interfaz aceite/agua, lo que causa una mayor hidrofobicidad. Por lo tanto, es crucial explorar la afinidad de las emulsiones de Pickering con los APC y elaborar la posterior internalización para desarrollar adyuvantes eficientes.

Basándonos en estas consideraciones, diseñamos una emulsión de Pickering estabilizada con nanopartículas (PNPE) de PLGA como un sistema de administración de vacunas de fluidez que también ayudó a obtener información valiosa sobre la afinidad del PNPE con los BMDC y la internalización celular. La adhesión en tiempo real de vesículas extracelulares biomiméticas (bEV; un reemplazo de BMDC) a PNPE se monitoreó a través de un método sin etiquetado utilizando una microbalanza de cristal de cuarzo con monitoreo de disipación (QCM-D). Después de la caracterización de la afinidad de PNPE con BMDC, se utilizó microscopía de barrido láser confocal (CLSM) para determinar la captación de antígenos. El resultado indicó la mayor afinidad de PNPE con BMDC y la internalización eficiente del antígeno. Anticipamos que el PNPE exhibiría una mayor afinidad con las APC, lo que puede estimular mejor la internalización de antígenos para mejorar las respuestas inmunes.

Protocolo

Todos los métodos descritos en este protocolo han sido aprobados por el Instituto de Ingeniería de Procesos de la Academia China de Ciencias. Todos los experimentos con animales se realizaron en estricta conformidad con el Reglamento para el cuidado y uso de animales de laboratorio y la Guía para la revisión ética de animales (China, GB / T35892-2018).

1. Preparación y caracterización de nanopartículas de PLGA

1. Preparación de nanopartículas PLGA (PNPs)
   1. Añadir 0,5 g de alcohol polivinílico (PVA) a 120 ml de agua desionizada a 90 °C y remover hasta que se disuelva por completo para preparar la solución de PVA. Conservar la solución en nevera (4 °C) después de enfriar a temperatura ambiente.
   2. Agregue 100 mg de PLGA a 10 ml de acetona y mezcla de etanol (proporción de 4: 1) para que sirva como fase oleosa.
   3. Coloque 20 ml de solución acuosa de PVA debajo de la campana extractora y agite magnéticamente a 400 rpm/min. Agregue 5 ml de la fase oleosa en la solución de PVA gota a gota con una bomba de jeringa. Luego, revuelva la mezcla en la campana extractora hasta que los solventes orgánicos se evaporen por completo.
      NOTA: Con el aumento de la concentración de las partículas en la fase oleosa, la solución en fase acuosa se convierte gradualmente en una clara y transparente luz de color blanco azulado o blanco lechoso.
   4. Después de la volatilización de disolventes orgánicos (2-3 h), centrifugar la mezcla a 15.000 x g. Lave tres o más veces hasta que el agua de lavado final sea clara y transparente.
      NOTA: El propósito de este paso es principalmente lavar el PVA residual en la superficie de la partícula para evitar que afecte la preparación de la emulsión Pickering.
   5. Vuelva a suspender los PNP lavados en 2 ml de agua desionizada y congele la mezcla a -80 °C durante 24 h. Posteriormente liofilizar las partículas en un liofilizador durante 48-72 h. Los PNP preparados son blancos en bandada.
2. Caracterización de PNPs
   1. Para caracterizar el tamaño y el potencial zeta de los PNP, agregue 10 μL de PNP en 1 ml de agua desionizada para obtener una solución diluyente y transfiera la solución diluyente a una celda DTS1070. Encienda el ordenador y el analizador dinámico de dispersión de luz (DLS) y, a continuación, coloque la celda DTS1070 en el sistema DLS.
   2. Haga clic en el software Zeta Size y cree un nuevo archivo de medición para configurar el procedimiento de determinación. A continuación, inicie el procedimiento de determinación para obtener el tamaño de partícula y la distribución del potencial zeta.
   3. Para observar la morfología de los PNP, extienda uniformemente la solución de PNP de 0,1 ml (diluida 40 veces) en una lámina de papel de aluminio de 5 cm x 5 cm y deje que el agua se evapore naturalmente en una campana extractora bien ventilada durante la noche.
   4. Corte una pequeña parte del papel de aluminio y asegúrelo en la mesa de muestras con cinta conductora. Rocíe con oro a una corriente de 10 mA durante 120 s. Posteriormente observar la morfología superficial de la muestra mediante microscopía electrónica de barrido (SEM).

2. Preparación y caracterización del PNPE

1. Para preparar PNPE, agregue PNP liofilizados al agua desionizada a una concentración de 4 mg / ml (la fase acuosa) y luego agregue escualeno como fase oleosa. Prepare PNPE a través de sonicación de un solo paso durante 5 minutos a 100 W en un sonicador de baño de agua. La relación de fase aceite-agua es de 1:9.
2. Caracterización del PNPE preparado
   1. Abra el software Mastersizer 2000 y el láser en secuencia. Haga clic en Medir para abrir el programa preestablecido y establecer el nombre de la muestra. Haga clic en Inicio para comenzar a medir el fondo de la muestra, luego, usando un gotero, agregue 1 ml de PNPE al tanque de muestra del analizador de tamaño de partícula láser para medir el tamaño de partícula de la emulsión tres veces en paralelo.
   2. Diluir 20 μL de PNPE en 1 mL de agua desionizada. Coloque 20 μL de la emulsión en el portaobjetos. Observar la morfología y homogeneidad de la emulsión mediante microscopía óptica a un aumento de 40x y obtener fotografías.
3. Eficiencia de carga de antígenos
   1. Disolver 200 μg de ovoalbúmina (OVA) en 500 ml de agua desionizada. Luego mezclar con 500 mL de PNPE preparado y agitar durante 1 h a temperatura ambiente. Eliminar el antígeno fluídico por centrifugación a 5000 x g durante 20 min.
   2. Determinar las concentraciones de antígeno fluídico mediante ensayos de ácido bicinchonínico (ACB)²⁷. La fórmula para calcular la eficiencia de carga de antígenos es la siguiente:
      Eficiencia de carga de antígenos =
      Utilice el mismo método para determinar la eficiencia de carga de antígenos de la EES que se utiliza como grupo control.
4. Estabilidad del PNPE
   1. Divida 6 ml del PNPE preparado en seis porciones iguales y almacene tres partes a 4 °C y 25 °C, respectivamente. Diluir 20 μL de PNPE almacenado en 1 ml de agua desionizada (1:50) los días 0, 3 y 6. Luego, mida el tamaño y el potencial zeta de las soluciones madre PNPE mantenidas a diferentes temperaturas.
      NOTA: Las diferentes temperaturas de almacenamiento se establecen para comparar el efecto de diferentes temperaturas en la estabilidad de PNPE, lo que puede optimizar la condición de almacenamiento para una alta estabilidad y una larga vida útil.
5. Preparación de micropartículas PLGA (PMPs)
   1. Disolver 500 mg de PLGA en 5 ml de diclorometano como fase oleosa, y luego verter en 50 ml de fase acuosa externa que contenga 1,5% de PVA para obtener la mezcla de aceite / agua. Homogeneizar la mezcla a 3000 rpm durante 1 min utilizando un homogeneizador para obtener emulsiones gruesas.
   2. Mantener la uniformidad del tamaño de partícula PLGA de las microesferas (determinado por emulsiones gruesas) mediante emulsificación de membrana. Instale una membrana de 5,2 μm en el tubo de membrana. Ajuste la presión a 800 kPa y manténgala estable.
   3. Abra la válvula de escape y la válvula de alimentación, y después de agregar las emulsiones gruesas al tanque de muestra, cierre la válvula de escape y la válvula de alimentación, abra la válvula de descarga y la válvula de entrada, y tome la emulsión posterior a la película en un vaso de precipitados de 200 ml. Repita el proceso tres veces para obtener emulsiones pre-dobles.
   4. Revuelva las emulsiones pre-dobles para evaporar el diclorometano a temperatura ambiente para curar las microesferas. Lave las microesferas con agua desionizada a 7741 x g durante 3 minutos cinco veces. Precongelar en un congelador a -80 °C y finalmente liofilizar para obtener microesferas secas.
6. Caracterización de PMPs
   1. Abra el software Mastersizer 2000 y el láser en secuencia. Haga clic en Medir para abrir el programa preestablecido y establecer el nombre de la muestra. Haga clic en Inicio para comenzar a medir el fondo de la muestra. Luego, agregue 1 ml de PMP al tanque de adición de muestras del analizador de tamaño de partícula láser con un gotero y mida el tamaño de partícula de las micropartículas tres veces en paralelo.
7. Análisis de suavidad
   NOTA: PNPE se recubrió en el sensor SiO₂ para medir la suavidad.
   1. Limpie el chip sensor de cuarzo SiO 2 con tratamiento UV-ozono durante 10 minutos, enjuague dos veces con 5 ml de etanol (75% v / v) y seque con N₂. Instale el chip sensor de cuarzo SiO₂ vacío en la celda de flujo.
   2. Encienda la computadora y active el control de temperatura en la parte inferior derecha del software para asegurarse de que la temperatura establecida sea aproximadamente 1 ° C por debajo de la temperatura ambiente.
   3. Haga clic en el botón Adquisición en la barra de herramientas y seleccione Configurar medición para buscar las octavas 1, 3, 5, 7, 9 y 11 del chip en el canal utilizado. Haga clic en el botón Adquisición de la barra de herramientas y seleccione Iniciar medición.
   4. Corrija la línea base con aire y, cuando la línea base esté equilibrada, seleccione Detener y guarde el archivo como un espacio en blanco.
   5. Limpie el chip y gire la capa de 10 μg/ml de PNPE en el chip. Brevemente, encienda el recubridor de centrifugado y establezca el parámetro de funcionamiento. Conecte el tubo N₂ al recubridor de centrifugado, ajuste el fraccionamiento del cilindro de gas a 0,4 kPa y coloque el chip limpio en la ventosa del recubridor de centrifugado. Agregue 100 μL de PNPE gota a gota al centro del sensor de SiO₂ y cierre la cubierta superior del recubrimiento de centrifugado para completar el recubrimiento.
   6. Instale el chip recubierto PNPE en la celda de flujo. Repita los pasos 2.7.3-2.7.4 y guarde el archivo como PNPE. Abra los archivos en blanco y PNPE y haga clic en el botón Stitch para obtener los datos relacionados de disipación (ΔD).

3. Aislar y cultivar BMDC ²⁸

NOTA: Asegúrese de que todos los reactivos y muestras se coloquen en hielo, ya que esto tiene un efecto positivo en la actividad celular. Para mantener la esterilidad, realice todos los pasos en un banco ultralimpio utilizando utensilios estériles.

1. Eutanasia a los ratones C57BL / 6 (hembra, 6-8 semanas de edad) a través de la inhalación de CO₂ y remojarlos en etanol al 70% (v / v) para una breve esterilización.
2. Después de remojar durante 3-5 minutos, transfiera los ratones a un banco súper limpio. Retire los músculos de las piernas con tijeras de acero inoxidable para exponer el fémur y la tibia, y luego separe el fémur y la tibia.
3. Llene una placa de Petri con etanol al 70% (v / v) y remoje los huesos limpios en ella durante 5-10 s para completar la esterilización externa. Limpie todos los huesos y colóquelos en un tubo estéril con hielo alrededor de ellos.
4. Recorte el fémur y la tibia cerca de la articulación con tijeras. Inserte la aguja de la jeringa en el hueso para eliminar la médula ósea en un tubo de centrífuga utilizando medio RPMI preenfriado (1640).
5. Enjuague dos o tres veces hasta que el hueso esté completamente blanco. Pipetear la médula ósea varias veces para separar todos los grumos. Filtrar las células en un tubo centrífugo de 15 ml utilizando un tamiz de 40 μm de diámetro.
6. Centrifugar a 4 °C y 500 x g durante 5 min. Deseche el sobrenadante y agregue 2 ml de lisado eritrocitario al sedimento durante 4 min.
7. Después del lavado dos o tres veces, vuelva a suspender las células en 2 ml de medio completo (1 % de penicilina-estreptomicina, 10 % de suero bovino fetal, 20 ng / ml de IL-4 y 10 ng / ml de GM-CSF). Luego, diluya 10 μL de células en 1 ml de PBS e inserte el chip del contador de células automatizado de mano en la dilución celular para el recuento celular. Finalmente, sembrar células a una densidad de 1 x 10⁶ células/ml en una placa de cultivo de 10 mm con un medio completo.
8. Cultivar las células en una incubadora celular con 5% de_CO2 a 37 °C. Cambiar el medio cada 2 días. El día 7, transfiera las células al tubo de 50 ml y centrifugar a 450 x g durante 5 minutos para recoger las células.

4. Preparación de vesículas extracelulares biomiméticas (bEVs)

1. Ensamble la mini-extrusora en secuencia según las instrucciones del fabricante. Asegúrese de que la carcasa de la jeringa no esté agrietada antes de usarla. Asegúrese de que todas las juntas tóricas estén en buenas condiciones antes de cada experimento y reemplace las desgastadas o dañadas de inmediato. Las juntas tóricas desgastadas o dañadas pueden causar una liberación repentina de presión al operar la extrusora.
2. Aspirar los BMDC repetidamente y transferirlos a un tubo de centrífuga. Cosechar las células por centrifugación a 450 x g durante 5 min a 4 °C. Presurice las suspensiones celulares a través de membranas de policarbonato de 10 μm, 5 μm y 1 μm durante 30 pasadas utilizando el miniextrusor²⁹.
   NOTA: Para permitir la uniformidad del tamaño del bEV, las suspensiones BMDC se empujaron a través de membranas de policarbonato de 10 μm, 5 μm y 1 μm durante 30 pasadas. Además, durante la operación, asegúrese de aplicar la fuerza de manera uniforme y mantener la dirección de la fuerza a lo largo del eje de la jeringa.
3. Centrifugar los sobrenadantes agrupados durante 5 min a 1000 x g y 4 °C para eliminar las células. Recoger el sobrenadante y centrifugarlo a 3000 x g durante 5 min a 4 °C para eliminar las células restantes y los restos celulares.
4. Recoger el sobrenadante y centrifugarlo a 100.000 x g durante 90 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender los bEV en 2 ml de solución salina tamponada con HEPES (HBS). Purificar los bEV mediante filtración a través de una membrana de 0,45 μm y almacenar los bEV purificados a -80 °C.

5. Los vehículos eléctricos se adhieren al PNPE

NOTA: El sensor SiO₂ se modificó mediante el método de recubrimiento por centrifugado.

1. Sensor de SiO₂ modificado con poli-L-lisina (PLL).
   1. Limpie el chip sensor de cuarzo SiO₂ con tratamiento UV-ozono durante 10 minutos, enjuague dos veces con etanol y seque con_N2.
   2. Encienda la recubrida de centrifugado presionando el botón de encendido, presione el botón Control y ajuste el tiempo y la velocidad de recubrimiento. La velocidad de rotación inicial es de 400 rpm, que se incrementa constantemente a 5000 rpm.
   3. Conecte el tubo N₂ a la centrifugadora y ajuste el fraccionamiento del cilindro de gas a 0,4 kPa. Coloque el chip limpio en la ventosa del recubridor de centrifugado. Agregue 100 μL de PLL gota a gota al centro del sensor de SiO₂ y cierre la cubierta superior del recubridor de centrifugado.
   4. Pulse el botón Inicio para comenzar a recubrir la muestra y detener la máquina cuando haya terminado. Apague la bomba de vacío, apague los botones de encendido y control y retire el sensor SiO₂ modificado por PLL.
      NOTA: Antes de pulsar Inicio, asegúrese de que se han ajustado el tiempo y la velocidad de recubrimiento. Además, asegúrese de que el sensor de SiO₂ esté colocado en el centro de la ventosa. Asegúrese de que la tapa esté cerrada antes de ejecutar el proceso para evitar accidentes.
2. Determinación de la adhesión de los bEV al PNPE
   1. Encienda la computadora, la unidad electrónica, la bomba peristáltica y active el control de temperatura en la parte inferior derecha del software para asegurarse de que la temperatura establecida sea aproximadamente 1 ° C por debajo de la temperatura ambiente.
   2. Coloque los sensores de SiO₂ modificados con PLL en la celda de flujo de acuerdo con las instrucciones de funcionamiento y conecte la línea de medición entre la celda de flujo y la bomba de flujo. Coloque la celda de flujo dentro del sistema de módulo de flujo y enjuáguelos con agua ultrapura antes de comenzar los experimentos.
   3. Haga clic en la barra de herramientas Adquisición y seleccione Medida de configuración para buscar 1, 3, 5, 7, 9 y 11 octavas del chip en el canal utilizado. Para corregir la línea de base, haga clic en Iniciar medición para permitir que el aire ingrese al módulo de flujo hasta que la línea de base del aire sea suave. Posteriormente, fluya agua desionizada durante 10-15 minutos para permitir nuevamente el equilibrio basal de la solución.
   4. Bombee la solución PNPE preparada en el módulo de flujo a un caudal de 50 μL/min para lograr la adsorción de equilibrio en el sensor de SiO₂ .
      NOTA: El ΔF ya no cambia cuando el PNPE se bombea nuevamente al módulo de flujo, lo que indica que la superficie de los sensores de SiO₂ se ha cubierto completamente con PNPE.
   5. Bombee la solución de bEVs preparada en el módulo de flujo a un caudal de 50 μL/min para rastrear el proceso de adhesión de bEV a la superficie PNPE.

6. Análisis CLSM de la captación de antígenos

1. Co-cultivo PNPE-OVA con BMDCs
   1. Incubar los BMDC con 1640 medios completos (1% de penicilina-estreptomicina, 10% de suero bovino fetal, 20 ng/ml de IL-4 y 10 ng/ml de GM-CSF) durante 7 días, y luego sembrarlos en pequeñas placas láser confocales a 1 x 10⁶ por pozo durante la noche a 37 °C en una incubadora de_CO2 al 5%.
   2. Mezclar 0,5 ml de OVA marcado con Cy5 (400 μg/ml) con 0,5 ml de PNPE durante 1 h y eliminar el antígeno fluídico por centrifugación a 5000 x g durante 20 min para desarrollar la formulación de la vacuna. Después de la resuspensión con 200 μL de agua desionizada, agregue 10 μL de la formulación (OVA de 10 μg / ml) en las pequeñas placas láser confocales bajo un banco súper limpio y cocultive con BMDC durante 6 h.
2. Tinción del citoesqueleto de actina
   1. Retire el líquido de cultivo de las células y lávelas dos veces con solución salina tamponada con fosfato precalentada (PBS; pH 7.4).
   2. Fijar las células con solución de formaldehído al 4% en PBS durante 10 min a temperatura ambiente. Durante la fijación, evite los fijadores que contienen metanol, que pueden destruir la actina.
   3. Lave las celdas con PBS dos o tres veces a temperatura ambiente durante 10 minutos cada una. Permeabilizar las células con 100 μL de solución Triton X-100 al 0,5% durante 5 min a temperatura ambiente. Lave las celdas con PBS dos o tres veces a temperatura ambiente durante 10 minutos cada una nuevamente.
   4. Cubra las células en el plato con fondo de vidrio de las pequeñas placas láser confocales con 200 μL de solución de trabajo de faloidina conjugada con isotiocianato de fluoresceína (FITC) e incube durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Para reducir la señal de fondo, agregue albúmina sérica bovina al 1% a la solución de trabajo de faloidina conjugada con FITC. Además, cubra la tapa de los pequeños platos láser confocales durante la incubación para evitar la evaporación de la solución.
   5. Lave las celdas con PBS tres veces durante 5 minutos cada una. Volver a teñir los núcleos con 200 μL de solución DAPI (concentración: 100 nM) durante unos 30 s.
3. Análisis de imágenes
   1. Encienda el hardware del microscopio confocal en secuencia, incluidos el láser, el confocal, el microscopio y la computadora. Haga clic en el software NIS-Elements AR 5.20.00 y seleccione Nikon Confocal para entrar en el sistema de prueba.
   2. En el sistema de microscopio confocal, encienda las distintas unidades en el orden indicado. Primero, configure los canales FITC, DAPI y Cy5 y ajuste el HV y el offset correspondientes. Luego, seleccione la lente de aceite 100x y coloque una gota de aceite de cedro en la parte superior. Coloque las pequeñas placas láser confocales que contienen BMDC teñidas en la plataforma del microscopio.
   3. Haga clic en el botón Escanear . Bajo un microscopio de fluorescencia, localice las células de interés moviendo el eje X, el eje Y y el eje Z. Sintoniza la intensidad del láser, el tamaño de la imagen y otros parámetros para permitir el escaneo de imágenes confocales de alta calidad. Finalmente, haga clic en el botón Capturar y guarde las imágenes.

Resultados

Se utilizó una sonificación simple de un solo paso para obtener PNPE. Primero, preparamos PNP uniformes para su uso como estabilizador sólido (Figura 1A). La morfología de las PNP se observó a través de SEM, mostrando que son en su mayoría uniformes y esféricas (Figura 1B). El tamaño hidrodinámico y el potencial zeta de las formulaciones se detectaron a través de DLS. El diámetro de las PNPs fue de 187,7 ± 3,5 nm y el potencial zeta fue de ...

Discusión

Desarrollamos una emulsión de aceite/agua estabilizada con nanopartículas de PLGA como un sistema de administración para mejorar la internalización de antígenos. El PNPE preparado poseía una superficie densamente empaquetada para soportar el lugar de aterrizaje y una suavidad y fluidez únicas para un potente contacto celular con la membrana celular inmune. Además, la interfaz aceite/agua ofrecía una carga de antígenos de alto contenido, y el PLGA anfifílico confería PNPE con alta estabilidad para el transport...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
AddVax	InvivoGen	Vac-adx-10
Cell Strainer	Biosharp	BS-70-CS	70 μm
Confocal Laser Scanning Microscope (CLSM)	Nikon		A1
Cy3 NHS Ester	YEASEN	40777ES03
DAPI Staining Solution	Beyotime	C1005
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	16000-044
FITC Phalloidin	Solarbio	CA1620
Mastersizer 2000 Particle Size Analyzer	Malvern
Micro BCA protein Assay Kit	Thermo Science	23235
Membrane emulsification equipment	Zhongke Senhui Microsphere Technology		FM0201/500M
Mini-Extruder	Avanti Polar Lipids, Inc
NANO ZS	Malvern		JSM-6700F
Polycarbonate membranes	Avanti Polar Lipids, Inc
Poly (lactic-co-glycolic acid) (PLGA)	Sigma-Aldrich	26780-50-7	Mw 7,000-17,000
Poly-L-lysine Solution	Solarbio	P2100
Poly (vinyl alcohol) (PVA)	Sigma-Aldrich	9002-89-5
QSense Silicon dioxide sensor	Biolin Scientific	QSX 303	Surface roughness < 1 nm RMS
Quartz Crystal Microbalance	Biosharp		Q-SENSE E4
RPMI Medium 1640 basic	Gibco	C22400500BT	L-Glutamine, 25 mM HEPES
Scanning Electron Microscopy (SEM)	JEOL		JSM-6700F
Squalene	Sigma-Aldrich	111-02-4