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  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Este protocolo describe metodologías para establecer organoides epiteliales endometriales de ratón para la expresión génica y análisis histológicos.

Resumen

El tejido endometrial recubre la cavidad interna del útero y está bajo el control cíclico del estrógeno y la progesterona. Es un tejido que se compone de epitelio luminal y glandular, un compartimento estromal, una red vascular y una población compleja de células inmunes. Los modelos de ratón han sido una herramienta poderosa para estudiar el endometrio, revelando mecanismos críticos que controlan la implantación, la placentación y el cáncer. El reciente desarrollo de cultivos de organoides endometriales 3D presenta un modelo de vanguardia para diseccionar las vías de señalización que subyacen a la biología endometrial. Establecer organoides endometriales a partir de modelos de ratón genéticamente modificados, analizar sus transcriptomas y visualizar su morfología a una resolución de una sola célula son herramientas cruciales para el estudio de las enfermedades endometriales. Este documento describe métodos para establecer cultivos 3D de epitelio endometrial de ratones y describe técnicas para cuantificar la expresión génica y analizar la histología de los organoides. El objetivo es proporcionar un recurso que pueda usarse para establecer, cultivar y estudiar la expresión génica y las características morfológicas de los organoides epiteliales endometriales.

Introducción

El endometrio, el tejido mucoso del revestimiento interno de la cavidad uterina, es un tejido único y altamente dinámico que desempeña un papel crítico en la salud reproductiva de una mujer. Durante la vida reproductiva, el endometrio tiene el potencial de someterse a cientos de ciclos de proliferación, diferenciación y descomposición, coordinados por la acción concertada de las hormonas ováricas: estrógeno y progesterona. Los estudios de ratones genéticamente modificados han descubierto mecanismos biológicos básicos que sustentan la respuesta endometrial a las hormonas y el control de la implantación embrionaria, la decidualización de las células estromales y el embarazo1. Sin embargo, los estudios in vitro han sido limitados debido a las dificultades para mantener tejidos endometriales primarios de ratón no transformados en cultivos celulares 2D tradicionales 2,3. Los avances recientes en el cultivo de tejidos endometriales como sistemas de órganos 3D, u organoides, presentan una nueva oportunidad para investigar las vías biológicas que controlan la regeneración y diferenciación de las células endometriales. Los sistemas organoides endometriales de ratón y humano se han desarrollado a partir de epitelio endometrial puro encapsulado en varias matrices4,5, mientras que el endometrio humano se ha cultivado como cocultivos epiteliales/estromales sin andamios 6,7, y más recientemente como ensamblajes epiteliales/estromales encapsulados en colágeno8 . El crecimiento y el potencial regenerativo de los cultivos de organoides epiteliales están respaldados por un cóctel definido de factores de crecimiento e inhibidores de moléculas pequeñas que han sido determinados empíricamente para maximizar el crecimiento y la regeneración de los organoides 4,5,9. Además, la capacidad de congelar y descongelar organoides endometriales permite el almacenamiento a largo plazo de organoides endometriales de ratones y humanos para futuros estudios.

Los ratones genéticamente modificados han revelado las complejas vías de señalización que controlan el embarazo temprano y la decidualización, y se han utilizado como modelos de pérdida de embarazo, cáncer de endometrio y endometriosis. Estos estudios genéticos se han logrado en gran medida con la deleción celular específica de alelos flanqueados por loxP ("floxed") utilizando recombinasas cre que son específicamente activas en los tejidos reproductivos femeninos. Estos modelos de ratón incluyen el ampliamente utilizado receptor de progesterona-cre 10, que tiene una fuerte actividad recombinasa en los tejidos epiteliales y estromales endometriales, lactoferrina i-cre, que induce la recombinación epitelial endometrial en ratones adultos11, o Wnt7a-cre, que desencadena la deleción epitelial específica en tejidos derivados de Müllerian12 . El cultivo de tejidos endometriales a partir de modelos de ratón genéticamente modificados como organoides 3D ha brindado una excelente oportunidad para investigar la biología endometrial y facilitar la identificación de factores de crecimiento y vías de señalización que controlan la renovación y diferenciación de las células endometriales13,14. Los métodos para el aislamiento y cultivo de tejido endometrial de ratón se describen en la literatura y reportan el uso de diversas estrategias enzimáticas para el aislamiento del epitelio uterino para el posterior cultivo de organoides epiteliales endometriales4. Si bien la literatura previa proporciona un marco crítico para los protocolos de cultivo de organoides epiteliales endometriales 4,5,6, este documento proporciona un método claro y completo para generar, mantener, procesar y analizar estos organoides. La estandarización de estas técnicas es importante para acelerar los avances en el campo de la biología reproductiva de la mujer. Aquí, presentamos una metodología detallada para la purificación enzimática y mecánica del tejido epitelial endometrial de ratón para el posterior cultivo de organoides endometriales en un andamio de matriz de gel. También describimos las metodologías para los análisis histológicos y moleculares posteriores de los organoides epiteliales endometriales de ratón encapsulados en matriz de gel.

Protocolo

El manejo de ratones y los estudios experimentales se realizaron bajo protocolos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de Baylor College of Medicine y las pautas establecidas por la Guía de los NIH para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio.

1. Aislamiento del epitelio uterino de ratones utilizando métodos enzimáticos y mecánicos

NOTA: Esta sección describe los pasos necesarios para establecer, pasar, congelar y descongelar organoides endometriales epiteliales de ratones utilizando un andamio de matriz de gel. Estudios previos han determinado que los cultivos óptimos de organoides endometriales de ratón se establecen a partir de ratones durante la fase4 del estro, que puede determinarse mediante el examen citológico de un hisopo vaginal15. Se utilizaron ratones WT hembra adultos (6-8 semanas de edad, híbridos C57BL / 6J y 129S5 / SvEvBrd) para todos los experimentos. Los ratones fueron sacrificados humanamente de acuerdo con las pautas aprobadas por IACUC utilizando sedación con isoflurano seguida de desarticulación cervical. Una vez que los ratones son sacrificados, se deben seguir los siguientes pasos. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles relacionados con los materiales y soluciones utilizados en este protocolo.

  1. Deje que la matriz de gel se descongele en hielo durante aproximadamente 1-2 h antes de usar.
  2. Para diseccionar el ratón, use tijeras para hacer una incisión en la línea media en el abdomen y retire suavemente la piel para exponer la capa peritoneal subyacente. Use fórceps para sostener la capa peritoneal y haga incisiones laterales con las tijeras para exponer el contenido abdominal.
    1. Localice los cuernos uterinos moviendo suavemente las almohadillas de grasa abdominal a un lado. Diseccionarlos sosteniéndolos primero en la unión cervical y usando tijeras para cortar a lo largo de la grasa mesentérica. Después de la disección del útero del ratón, retire completamente el tejido graso del cuerno uterino con tijeras pequeñas.
      NOTA: Mantenga la esterilidad durante el aislamiento celular esterilizando todas las herramientas quirúrgicas antes de usarlas, rocíe el abdomen del ratón con etanol al 70% y realice todos los pasos posteriores a la disección bajo una campana de cultivo de tejido estéril.
  3. Corte cada cuerno uterino en pequeños fragmentos, cada uno midiendo aproximadamente 4-5 mm.
  4. Coloque todos los fragmentos uterinos de un útero en un pocillo de una placa de 24 pocillos que contenga 0,5 ml de tripsina al 1%. Permita que la solución enzimática entre en la luz uterina, causando la separación enzimática del epitelio endometrial del estroma subyacente.
  5. Incubar la placa de 24 pocillos en una incubadora de cultivo de tejidos humidificado a 37 °C durante aproximadamente 1 h.
  6. Después de la incubación de 1 h, transfiera los fragmentos uterinos a una placa de cultivo tisular de 35 mm que contenga 1 ml de solución tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco.
  7. Bajo un microscopio de disección, use fórceps finos y una pipeta de 1 ml para separar mecánicamente el epitelio uterino de la trompa uterina. Mientras mantiene presionado un extremo de un fragmento uterino con los fórceps, pase suavemente la punta de la pipeta longitudinalmente a través del fragmento, apretando el epitelio por el otro extremo de la trompa uterina. Observe las hojas epiteliales separadas del fragmento uterino bajo el microscopio de disección.
  8. Utilice la pipeta de 1 ml para recoger y transferir suavemente las láminas epiteliales a un tubo de 1,5 ml.
  9. Repita el proceso para los fragmentos uterinos restantes, transfiriendo todas las láminas epiteliales al mismo tubo de recolección.
  10. Granular las láminas epiteliales disociadas por centrifugación durante 5 min a 375 × g.
  11. Retire con cuidado el sobrenadante para evitar alterar el pellet celular.
  12. Resuspender el pellet celular en 0,5 mL de 2,5 mg/mL de colagenasa + 2 mg/ml de solución de DNasa. Pipetear hacia arriba y hacia abajo aproximadamente 10 veces, o hasta que se logre una suspensión de una sola celda.
  13. Agregue 0.5 ml de DMEM / F12 + 10% de suero bovino fetal (FBS) + antibióticos, y centrifugar las células durante 5 minutos a 375 × g.
    NOTA: Para obtener información adicional sobre el antibiótico de amplio espectro utilizado para el cultivo celular, consulte la Tabla de materiales.
  14. Retire cuidadosamente el sobrenadante y resuspenda las células en 1 ml de DMEM / F12 + 10% FBS + antibióticos. Centrifugar las celdas durante 5 min a 375 × g.

2. Procesamiento del compartimento estromal

NOTA: Esta sección describe los protocolos necesarios para aislar el compartimiento estromal del endometrio del ratón. Dado el creciente interés en los experimentos de cocultivo epitelial/estromal, es importante poder procesar las poblaciones de células estromales además de las células epiteliales que generarán organoides.

  1. Una vez que todo el epitelio se ha separado enzimática y mecánicamente de los fragmentos uterinos, las estructuras tubulares restantes son los compartimentos "estromal / miometrial". Recoja este tejido en una colagenasa de 2,5 mg/ml + 2 mg/ml de DNasa en solución HBSS.
  2. Incubar la muestra estromal/miometrial en una agitadora de 37 °C durante 15 min.
  3. Después de la incubación, agregue 500 μL de DMEM / F12 + 10% FBS + antibióticos por ratón, y filtre los fragmentos no disociados a través de un filtro celular de 40 μm.
  4. Granular las células por centrifugación durante 5 min a 375 × g.
  5. Retire con cuidado el sobrenadante y resuspenda el pellet celular en 1 ml de DMEM / F12 + 10% FBS + antibióticos. Agregue la mezcla gota a 10 ml de DMEM / F12 + 10% FBS + antibióticos en una placa de cultivo celular de 10 cm. Incubar la placa a 37 °C en una incubadora de cultivo celular humidificada.
  6. Para generar cocultivos de células epiteliales y estromales endometriales de ratón, seguir los métodos descritos para organoides endometriales humanos utilizando sistemas de matriz de colágeno o sin andamios 6,8.
    NOTA: Si bien estas técnicas aún no se han publicado para ratones, se pueden adaptar en función de los protocolos publicados con endometrio humano.

3. Encapsulación del epitelio uterino en matriz de gel para establecer organoides

NOTA: Mantenga la matriz de gel en hielo hasta que esté lista para ser utilizada.

  1. Retire el sobrenadante y resuspenda el pellet celular en un volumen de matriz de gel que sea 20 veces mayor que el del pellet celular (es decir, si el pellet celular es de 20 μL, resuspenda las células con 400 μL de matriz de gel). Vuelva a suspender el pellet con cuidado para evitar la introducción de burbujas.
  2. Deje que la suspensión de la matriz de gel / celda se asiente a temperatura ambiente durante ~ 10 min.
  3. Una vez que la suspensión de la matriz de gel / celda se convierta en un gel semisólido, use una micropipeta P200 con una punta de 200 μL de diámetro ancho para aspirar suavemente 25 μL de la suspensión de matriz / celda de gel. Dispense tres domos separados de 25 μL por pocillo de una placa de 12 pocillos y permita que la matriz de gel se cure durante 15 minutos en una incubadora de cultivo de tejido humidificado a 37 °C.
  4. Después de que la matriz de gel se haya curado, agregue 750 μL de medio organoide a cada pocillo que contenga cúpulas de matriz de gel. Incubar a 37 °C en una incubadora de cultivo de tejidos humidificado.
    NOTA: La formulación de los medios organoides se indica en la Tabla de materiales. Los organoides generalmente se forman dentro de los 4 días posteriores al cultivo inicial.

4. Análisis de la expresión génica de organoides endometriales tras el tratamiento con estradiol

NOTA: Esta sección describe los métodos utilizados para perfilar la expresión génica de los organoides epiteliales endometriales utilizando qPCR en tiempo real después del tratamiento con estradiol (E2; ver Tabla 1). Debido a que el endometrio está bajo el control cíclico de la hormona ovárica E2, probar la capacidad de respuesta de los organoides a E2 es una medida importante de la función fisiológica. Hemos obtenido ARN de alta calidad y generado suficiente ARNm para perfilar la expresión génica mediante qPCR y/o secuenciación de ARN a partir de nuestros organoides epiteliales endometriales. Esta sección describe cómo recolectar organoides y procesarlos para el análisis posterior de la expresión génica. El medio de tratamiento seleccionado refleja el utilizado para tratar las células endometriales cultivadas. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que este medio de tratamiento puede optimizarse en consecuencia, como se hace para el tratamiento de cultivos 3D endometriales humanos con hormonas 8,16,17.

  1. Cultivar los organoides endometriales como se describió anteriormente.
  2. Retire el medio organoide y reemplácelo con 750 μL de medio de inanición cuatro días después de la siembra. Incubar durante la noche.
  3. A la mañana siguiente, retire el medio de inanición. Añadir 750 μL de medio de tratamiento que contenga cualquiera de los vehículos o 10 nM E2. Incubar durante 48 h.
  4. Proceda con el aislamiento de ARN siguiendo el protocolo del fabricante del kit.

5. Análisis histológico de organoides endometriales

NOTA: La obtención de imágenes de las características morfológicas de los organoides endometriales es fundamental para evaluar el efecto celular de los factores de crecimiento, las manipulaciones genéticas o los inhibidores de moléculas pequeñas. Esta sección describe las técnicas utilizadas para fijar, procesar y obtener imágenes de los organoides epiteliales endometriales mediante tinciones histológicas y tinción inmunofluorescente de anticuerpos.

  1. Preparar tubos de microcentrífuga de 1,5 ml que contengan 1 ml de paraformaldehído al 4% en 1x PBS. Colócalos en hielo.
  2. Aspirar el medio de los pocillos de la placa de 12 pocillos que contiene los organoides.
  3. Usando una punta de pipeta de 1 ml con una punta cortada, transfiera 500 μL de paraformaldehído al 4% a cada pocillo y separe suavemente las cúpulas de la matriz de gel del fondo de la placa.
  4. Aspire suavemente todas las cúpulas de la matriz de gel en la punta de la pipeta y transfiéralas al tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
  5. Fijar los organoides colocándolos sobre un rotador a 4 °C durante la noche.
  6. A la mañana siguiente, centrifugar el tubo a 600 × g durante 5 min para granular los organoides. Retire suavemente la solución de paraformaldehído al 4% con una pipeta y deséchela. Lave los organoides 2x con etanol al 70%.
  7. Después del último lavado, retire todo menos 50-100 μL de etanol del tubo. Deje el tubo a un lado.
  8. Coloque un tubo de gel de procesamiento de muestras en un baño de agua y microondas durante ~ 30 s para derretir el gel. Asegúrese de que el gel de procesamiento de muestras no hierva controlando la consistencia del gel.
    NOTA: Una vez que el gel de procesamiento de muestras esté derretido, pero no hirviendo, trabaje rápidamente para encapsular los organoides.
  9. Transfiera suficiente gel de procesamiento de muestras para cubrir toda la superficie del molde (aproximadamente 250 μL).
  10. Mientras el gel de procesamiento de la muestra aún está fundido, transfiera rápidamente los 50 μL de solución de etanol al 70% que contiene los organoides. Asegúrese de que los organoides estén hundidos o empujados a la parte inferior del molde.
  11. Coloque el molde histológico en un cubo de hielo y permita que el gel de procesamiento de la muestra se enfríe y solidifique.
  12. Una vez que el gel de procesamiento de muestras esté completamente seco, transfiera cuidadosamente el cuadrado del gel de procesamiento de muestras a una bolsa de muestras, haciendo un seguimiento del plano donde se encuentran los organoides.
  13. Colocar la bolsa en un casete histológico y procesar utilizando métodos estándar utilizados para la fijación de formalina y la incrustación de parafina de los tejidos18.
  14. Después de la fijación e incrustación en parafina, sección en secciones de 5 μm utilizando un micrótomo19. Proceda con los procedimientos estándar de tinción o inmunotinción de hematoxilina y eosina (H&E), como se describe a continuación.

6. Tinción de hematoxilina y eosina

  1. Desparafinar las secciones de la siguiente manera: xileno, 2 x 10 min; 100% etanol, 2 x 3 min; 80% etanol, 3 min; 60% etanol, 3 min; dH 2 O,2x 3 min; 1 min en hematoxilina; agua del grifo (3 x 5 s); 1 min en eosina.
  2. Deshidratar las secciones de la siguiente manera: 60% etanol, 3 min; 80% etanol, 3 min; 95% etanol, 3 min; 100% etanol, 2 x 3 min; xileno, 2 x 15 min.
  3. Montar con medio de montaje.

7. Tinción por inmunofluorescencia

  1. Desparafinar las secciones como se describe en el paso 6.1.
  2. Realizar la recuperación de antígenos
    1. Sumerja los portaobjetos en una solución de recuperación de antígenos en un recipiente apto para microondas.
    2. Microondas a fuego alto durante 20 minutos, utilizando intervalos de 5 minutos para asegurarse de que la solución no hierva.
  3. Después de completar el paso de recuperación de antígenos de 20 minutos, permita que los portaobjetos se enfríen en hielo durante 40 minutos mientras aún están sumergidos en el tampón de recuperación de antígenos.
  4. Lave las diapositivas con 1x TBST durante 3 minutos
  5. Bloquear los portaobjetos incubando en BSA al 3% en TBST durante 1 h a temperatura ambiente.
  6. Incubación de anticuerpos primarios
    1. Diluir el anticuerpo en BSA al 3% en TBST (1:50-1:1.000, dependiendo de Ab).
    2. Incubar durante la noche a 4 °C en una cámara humidificada.
    3. Lavar 3 x 5 min con TBST.
  7. Incubación secundaria de anticuerpos
    1. Diluir el anticuerpo en BSA al 3% (en TBST) (1:250), o en suero de burro normal al 5%.
    2. Incubar durante 1 h a temperatura ambiente (RT) en la oscuridad, ya que el anticuerpo se conjuga con un fluoróforo.
  8. Tinción nuclear
    1. Diluir 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) 1:1.000 en TBST.
    2. Incubar durante 5 min en RT.
    3. Lavar 2 x 5 min con TBST.
  9. Montura
    1. Utilice una gota de medio de montaje para montar el cubreobjetos.
    2. Selle el cubreobjetos con esmalte de uñas al día siguiente.

Resultados

Imágenes de contraste de fase de organoides endometriales de ratón
Establecimos organoides a partir de epitelio endometrial de ratón WT, como se describe en el protocolo adjunto (ver diagrama en la Figura 1). Después de la disociación enzimática del epitelio endometrial del ratón, las láminas epiteliales se separaron mecánicamente de las células del estroma uterino y se disociaron aún más con colagenasa para generar una suspensión unicelular. Si se realiza co...

Discusión

Aquí, describimos los métodos para generar organoides epiteliales endometriales a partir del endometrio del ratón y los protocolos utilizados rutinariamente para su análisis posterior. Los organoides endometriales son una herramienta poderosa para estudiar los mecanismos que controlan las enfermedades relacionadas con el endometrio, como la endometriosis, el cáncer de endometrio y el fracaso de la implantación. Estudios históricos publicados en 2017 reportaron las condiciones para cultivar cultivos a largo plazo y...

Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Agradecimientos

Agradecemos a la Dra. Stephanie Pangas y al Dr. Martin M. Matzuk (M.M.M.) por la lectura crítica y edición de nuestro manuscrito. Los estudios fueron apoyados por las subvenciones del Instituto Nacional de Salud Infantil y Desarrollo Humano Eunice Kennedy Shriver R00-HD096057 (D.M.), R01-HD105800 (D.M.), R01-HD032067 (M.M.M.) y R01-HD110038 (M.M.M.), y por la Subvención de Apoyo al Centro Oncológico NCI-P30 (NCI-CA125123). Diana Monsivais, Ph.D. tiene un Premio al Embarazo de la Próxima Generación del Burroughs Wellcome Fund.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Organoid Media Formulation
NameCompanyCatalog NumberFinal concentration
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, *LDEV-freeCorning354230100%
Trypsin from Bovine PancreasSigma AldrichT1426-1G1%
Advanced DMEM/F12Life Technologies126340101X
N2 supplementLife Technologies175020481X
B-27™ Supplement (50X), minus vitamin ALife Technologies125870101X
PrimocinInvivogenant-pm-1100 µg/mL
N-Acetyl-L-cysteineSigma AldrichA9165-5G1.25 mM
L-glutamineLife Technologies250300242 mM
NicotinamideSigma AldrichN0636-100G10 nM
ALK-4, -5, -7 inhibitor, A83-01Tocris2939500 nM
Recombinant human EGFPeprotechAF-100-1550 ng/mL
Recombinant human NogginPeprotech120-10C100 ng/mL
Recombinant human Rspondin-1Peprotech120-38500 ng/mL
Recombinant human FGF-10Peprotech100-26100 ng/mL
Recombinant human HGFPeprotech100-3950 ng/mL
WNT3aR&D systems5036-WN200 ng/mL
Other supplies and reagents
NameCompanyCatalog NumberFinal concentration
Collagenase from Clostridium histolyticumSigma AldrichC0130-1G5 mg/mL
Deoxyribonuclease I from bovine pancreasSigma AldrichDN25-100MG2 mg/mL
DPBS, no calcium, no magnesiumThermoFisher14190-2501X
HBSS, no calcium, no magnesiumThermoFisher141701121X
Falcon Polystyrene Microplates (24-Well)Fisher Scientific#08-772-51
Falcon Polystyrene Microplates (12-Well)Fisher Scientific#0877229
Falcon Cell Strainers, 40 µmFisher Scientific#08-771-1
Direct-zol RNA MiniPrep (50 µg)Genesee Scientific11-331
Trizol reagentInvitrogen15596026
DMEM/F-12, HEPES, no phenol redThermoFisher11039021
Fetal Bovine Serum, Charcoal strippedSigma AldrichF6765-500ML2%
Estratiol (E2)Sigma AldrichE1024-1G10 nM
Formaldehyde 16% in aqueous solution, EM GradeVWR157104%
Epredia Cassette 1 Slotted Tissue CassettesFisher Scientific1000961
Epredia Stainless-Steel Embedding Base MoldsFisher Scientific64-010-15 
Ethanol, 200 proof (100%)Fisher Scientific22-032-601 
HistoclearFisher Scientific50-899-90147
Permount Mounting MediumFisher Scientific50-277-97
Epredia Nylon Biopsy BagsFisher Scientific6774010
HistoGel Specimen Processing GelVWR83009-992
Hematoxylin solution PremiumVWR95057-844
Eosin Y (yellowish) solution PremiumVWR95057-848
TBS Buffer, 20X, pH 7.4GenDEPORTT80541X
TBST (10X), pH 7.4GenDEPORTT80561X
Citric acid Sigma AldrichC0759-1KG
Sodium citrate tribasic dihydrateSigma AldrichS4641-500G
Tween20Fisher ScientificBP337-500 
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma AldrichA2153-100G3%
DAPI Solution (1 mg/mL)ThermoFisher622481:1000 dilution
VECTASHIELD Antifade Mounting MediumVector LabsH-1000-10
Clear Nail PolishFisher ScientificNC1849418
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope SlidesFisher Scientific22037246
VWR Micro Cover GlassesVWR48393-106
SuperScript VILO Master MixThermoFisher11755050
SYBR Green PCR Master MixThermoFisher4364346
Krt8 Antibody (TROMA-I) DSHBTROMA-I 1:50 dilution
Vimentin AntobodyCell Signaling5741S1:200 dilution
Donkey anti-Rat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary
Antibody, Alexa Fluor 594		ThermoFisherA-212091:250 dilution
Donkey anti-Rabbin IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary
Antibody, Alexa Fluor 488		ThermoFisherA-212061:250 dilution
ZEISS Stemi 508 Stereo MicroscopeZEISS
ZEISS Axio Vert.A1 Inverted Routine Microscope with digital cameraZEISS
Primer SequenceForward (5'-3')Reverse (5'-3')_
Lipocalin 2 (Lcn2)GCAGGTGGTACGTTGTGGGCTCTTGTAGCTCATAGATGGTGC
Lactoferrin (Ltf)TGAGGCCCTTGGACTCTGTACCCACTTTTCTCATCTCGTTC
Progesterone (Pgr)CCCACAGGAGTTTGTCAAGCTCTAACTTCAGACATCATTTCCGG
Glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase (Gapdh)CAATGTGTCCGTCGTGGATCTGCCTGCTTCACCACCTTCTT

Referencias

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