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Resumen

El presente protocolo describe la extracción de lumican de la membrana amniótica (AM) y sus condiciones de almacenamiento como extracto de AM (AME) a -20 °C, 4 °C y temperatura ambiente (RT) durante 6, 12, 20 y 32 días para cuantificar sus proteínas y la concentración de lumicano.

Resumen

Lumican es un pequeño proteoglicano rico en leucina en la membrana amniótica humana (AM) que promueve la epitelización corneal y la organización de las fibras de colágeno, manteniendo la transparencia corneal. En el presente trabajo, se propone un método de extracción de proteínas de AM para obtener lumican. Además, se evalúa la estabilidad de lumicano en el extracto AM (AME) almacenado a diferentes temperaturas y períodos de tiempo. 100 mg de AM fueron descongelados y desepitelizados mecánicamente. La AM desepitelizada se congeló y trituró hasta obtener un polvo fino, que se solubilizó con 2,5 mL de tampón salino con inhibidores de la proteasa y se centrifugó para la extracción de proteínas. El sobrenadante se recolectó y almacenó a -20 °C, 4 °C y temperatura ambiente (RT) durante 6, 12, 20 y 32 días. Posteriormente, lumican se cuantificó en cada AME. Esta técnica permite un protocolo accesible y adquirible para la extracción lumican de AM. La concentración de Lumican se vio afectada por el tiempo de almacenamiento y las condiciones de temperatura. Lumican en el AME de 12 días almacenado a -20 °C y 4 °C fue significativamente mayor que otros AME. Esta extracción lumica podría ser útil para desarrollar tratamientos y soluciones farmacéuticas. Se necesitan estudios adicionales para determinar los usos de AME lumican en el proceso de reepitelización y cicatrización de heridas.

Introducción

Uno de los tratamientos más utilizados para las afecciones corneales es el trasplante de membrana amniótica; Sin embargo, en los últimos años, han surgido nuevas propuestas para utilizar diversos componentes del tejido amniótico como tratamientos alternativos y adyuvantes. Entre los componentes más estudiados de AM se encuentran los obtenidos del extracto de AM (AME)1,2,3,4,5,6,7. AM contiene múltiples factores solubles como proteínas antiangiogénicas, interleucinas (IL), inhibidores tisulares de metaloproteinasas (TIMP), proteínas antiinflamatorias mediadas por TSG-6 que inhiben las trampas extracelulares de neutrófilos, factores de crecimiento: factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento transformante (TGF) (alfa y beta), factor de crecimiento de queratinocitos (KGF), factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) y lumican, que mantiene la transparencia corneal mediante la regulación de la fibrilogénesisde colágeno 1, 2,3,4,5,6,7,8,9.

Lumican es un pequeño proteoglicano rico en leucina (SLRP), uno de los principales componentes extracelulares de la colagenasa intersticial en la matriz del estroma corneal, responsable de organizar las fibras de colágeno y mantener la transparencia corneal 4,10,11. Los proteoglicanos son moléculas de la matriz extracelular (MEC), que son las principales en la realización de la señalización celular y el mantenimiento de la homeostasis intracelular12. Se ha informado que las proteínas ECM impulsan los procesos celulares de proliferación, diferenciación y migración durante la cicatrización de heridas11.

La evidencia indica la posible participación de lumican en el proceso de reepitelización corneal. Saika et al., en un estudio, demostraron que después de una lesión corneal, lumican podría detectarse en queratocitos corneales entre las primeras 8 h y hasta 3 días después de la lesión. Presentando la mayor concentración de lumicano en el segundo y tercer día, este proteoglicano es posteriormente indetectable en el séptimo día13. Estos datos sugieren la participación de lumican en la activación del proceso de reepitelización corneal. Por otro lado, en otro estudio, se informó que la ausencia de lumicano retrasa la reepitelización; Curiosamente, la adición de Lumican podría acelerar el proceso de reepitelización 4,11,13. Asimismo, un estudio reciente ha reportado que lumican puede modular las funciones inflamatorias de los fibroblastos del limbo corneal14, lo que sugiere un papel para lumican como modulador de la respuesta inflamatoria, antifibrótica y reepitelizante. Del mismo modo, lumican puede modular la respuesta corneal interactuando con moléculas de señalización como Fas-FasL. Además, la ausencia de lumican en un modelo de ratón Lum-/- knockout demostró que la falta de señalización lumican impide una reparación corneal adecuada15.

Principalmente, este método tiene como objetivo demostrar una forma factible y accesible de extraer lumican de AM. Con este ventajoso método de extracción lumicana, es posible obtener concentraciones similares de proteínas, disminuyendo el tiempo de procesamiento y haciéndolo más conveniente para los investigadores en comparación con los estudios previos16. Además, este AME lumican podría usarse como adyuvante para procesos de reparación y reepitelización corneal.

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Protocolo

Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por la Junta de Revisión Institucional (Proyecto Nº CEI-2020/06/04). La AM se obtuvo del banco de amnios del Instituto de Oftalmología Conde de Valenciana (de sujetos humanos no identificados), preparado tal como lo describen Chávez-García et al.17.

1. Preparación del extracto de membrana amniótica

  1. Obtenga 100 mg de AM del banco de amnios.
    NOTA: Según un informe anterior, 50 mg de AM secretan un total de 10 ng / ml de lumican14. Para obtener una mayor concentración de lumican, use 100 mg de AM, equivalente a un área total de 32 cm2.
  2. Si la AM está congelada, descongélela a temperatura ambiente.
    NOTA: Realice los siguientes procedimientos bajo una campana de flujo laminar clase II B.
  3. Lave la AM en una placa de Petri con 10 ml de solución salina balanceada estéril (BSS, ver Tabla de materiales) durante 2 min.
    1. Vierta el BSS en un vaso de precipitados.
    2. Repita el paso 3 y confirme visualmente que el medio de glicerol no está presente en la placa de Petri BSS.
      NOTA: Repita el paso 3. según sea necesario hasta que el medio de glicerol no esté presente en la placa de Petri BSS.
  4. Incubar la AM con 10 mL de dispasa II (1.7 UI/mL, ver Tabla de Materiales) a 37 °C, 5% deCO2 durante 30 min.
    NOTA: La dispasa II es una proteasa neutra con actividad suave sobre las células epiteliales. Esta enzima separa eficazmente la epidermis intacta de la dermis y aísla las láminas epiteliales intactas18.
  5. Después de la incubación de la dispasa, realice una desepitelización mecánica14 con un policía de goma (ver Tabla de materiales). Confirmar la desepitelización mediante visualización microscópica.
    NOTA: El proceso de desepitelización se corrobora en un microscopio invertido utilizando objetivos 4x y 20x. Visualice el tejido para excluir la presencia de cualquier capa celular.
  6. Lave la AM en una placa de Petri con 10 ml de BSS durante 2 min. Vierta el BSS en un vaso de precipitados.
  7. Coloque la AM desepitelizada (dAM) en un tubo de microcentrífuga de 2 ml. Sumerja el dAM en nitrógeno líquido durante 40 min.
  8. Moler manualmente el dAM congelado durante 2-3 minutos en un mortero preenfriado a -85 °C hasta obtener un polvo fino.
  9. En el mortero, solubilizar el polvo de dAM con 2,5 ml de solución inhibidora de la proteasa (BSS con inhibidores de la proteasa).
    NOTA: Cada tableta de inhibidor de la proteasa consiste en la siguiente mezcla de enzimas: extracto de páncreas (0.02 mg/ml), termolisina (metaloprrotasisa) (0.0005 mg/ml), quimotripsina (0.002 mg/ml), tripsina (0.02 mg/ml) y papaína (0.33 mg/ml) (ver Tabla de materiales).
  10. Recoja la mezcla con una micropipeta y limpie las paredes de mortero con la ayuda de un cuchillo de bisturí. Coloque la mezcla en un tubo de 5 ml.
  11. Mezclar bien con el vórtice durante 30 s.
  12. Homogeneizar la mezcla de tejidos centrifugando a 34 x g durante 20 min a 4 °C e inmediatamente centrifugar a 3360 x g durante 20 min a 4 °C.
  13. El sobrenadante recogido es el AME (Figura 1). Almacene 0,7 ml de cada AME en diferentes tubos de microcentrífuga de 2 ml durante 6, 12, 20 y 33 días a las diferentes condiciones de temperatura de -20 °C, 4 °C y temperatura ambiente (RT).

figure-protocol-3710
Figura 1: Proceso de preparación de AME y medición de la concentración de lumican . Se incubaron 100 mg de AM con dispasa II a 37 °C durante 30 min y se desepitelizaron mecánicamente. La AM desepitelizada se lavó y se sumergió en nitrógeno líquido durante 40 min, y luego se trituró hasta obtener un polvo fino, que se solubilizó con 2,5 mL de tampón salino con inhibidores de proteasa y se centrifugó. El sobrenadante se recolectó y almacenó a -20 °C, 4 °C y RT durante 6, 12, 20 y 32 días hasta la cuantificación total de proteínas y lumicanos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. Cuantificación de proteínas AME

NOTA: La cuantificación de la proteína total en el AME debe llevarse a cabo inmediatamente después de la obtención. Cuantifique las proteínas usando el ensayo de proteína de Lowry y siga las instrucciones del fabricante (consulte la Tabla de materiales). Se recomienda que todos los patrones y muestras se ensayen por triplicado.

  1. Pipetear 40 μL de cada muestra de AME en una microplaca de 96 pocillos.
    1. Preparar una curva estándar en la misma microplaca utilizando el estándar de albúmina sérica bovina (BSA) para una concentración final de BSA de 0-1,500 μg / ml (0, 1, 5, 25, 125, 250, 500, 750, 1,000 y 1,500 μg / ml).
  2. Pipetear 200 μL del reactivo de Lowry modificado a cada pocillo. Mezclar inmediatamente en una batidora de platos durante 30 s.
  3. Cubra la microplaca con papel de aluminio e incube a RT durante 10 min.
  4. Pipetear 20 μL de 1x reactivo de Folin-Ciocalteu a cada pocillo. Mezclar inmediatamente en una batidora de platos durante 30 s.
    NOTA: Para preparar 1x reactivo de Folin-Ciocalteu, diluir 2x (2N) reactivo 1:1 con agua ultrapura. Preparar 1x reactivo de Folin-Ciocalteu el mismo día de uso, ya que el reactivo diluido es inestable.
  5. Cubra la microplaca de la luz con papel de aluminio e incube a RT durante 30 min.
  6. Mida la absorbancia de muestras a 660 nm en un espectrómetro de placas ELISA (consulte la Tabla de materiales).
    NOTA: El color se puede medir en longitudes de onda entre 650 nm y 750 nm.
  7. Promedie el valor de absorbancia de 660 nm de las muestras en blanco estándar y réstelo de otros valores de 660 nm de muestras estándar y desconocidas.
    1. Mida la absorbancia con un espectrómetro de placas ELISA en un modo de punto final con baja agitación durante 10 s.
  8. Utilice la curva estándar para determinar la concentración de proteína de cada muestra desconocida.
  9. Para el cálculo de proteínas, determine la concentración a partir de un gráfico de regresión lineal utilizando los valores de absorbancia en el eje Y contra las concentraciones en mg/ml en el eje X de cada curva BSA estándar.
    1. Obtenga la ecuación de regresión lineal y el valor r para calcular la concentración de proteína.
      NOTA: Los resultados se expresan como valores de concentración relativa normalizados de proteína total en relación con mg de AM (μg/ml de proteína/mg de tejido AM).

3. Cuantificación de Lumican en AME

NOTA: La concentración de lumican debe medirse en el AME almacenado en diferentes condiciones de almacenamiento y períodos de tiempo. Cuantifique lumican usando ELISA sándwich y siga las instrucciones del fabricante. Se recomienda que todos los estándares y muestras se ensayen por duplicado.

  1. Diluir el anticuerpo de captura de lumicano humano (ver Tabla de materiales) a la concentración empleada en solución salina tamponada con fosfato (PBS).
    NOTA: El vial de anticuerpos de captura contiene 120 μg de anticuerpo. Después de la reconstitución con 0,5 ml de PBS, diluir el anticuerpo de captura en una solución de trabajo de 2 μg/ml.
    1. Pipetear instantáneamente 100 μL por pocillo del anticuerpo de captura diluido a una microplaca de 96 pocillos. Encierre el plato e incube durante la noche en RT.
  2. Aspirar cada pocillo y lavarlo pipeteando con 300 μL de tampón de lavado: monolaurato de polioxietileno sorbitán al 0,05% 20 en PBS, pH 7,2-7,4 (ver Tabla de materiales) utilizando un pipetor multicanal. Repita tres veces.
    NOTA: Después del último lavado, retire cualquier tampón de lavado restante everando el plato y golpeándolo suavemente contra toallas de papel.
  3. Bloquee las placas agregando 300 μL de diluyente de reactivo: BSA al 1% en PBS, pH 7.2-7.4, 0.2 μm filtrados (ver Tabla de materiales) a cada pocillo. Incubar en RT durante 1 h.
  4. Repita el paso 2.
  5. Prepare una curva estándar en una microplaca de 96 pocillos utilizando diluciones seriadas dobles de 0-8,000 pg / ml para concentraciones finales de 125, 250, 500, 1,000, 2,000, 4,000 y 8,000 pg / ml. El kit ELISA lumican contiene un estándar lumican recombinante de 75 ng (consulte la Tabla de materiales).
  6. Agregue 100 μL de muestras y la curva estándar en la microplaca de 96 pocillos recubierta con anticuerpos de captura.
  7. Cubrir la microplaca e incubar durante 2 h a RT con baja agitación en un balancín compacto manteniendo la velocidad entre 2-3 rpm.
  8. Repita el paso 2.
  9. Agregue 100 μL del anticuerpo de detección biotinilada (consulte la Tabla de materiales) a cada pocillo. Cubrir de luz e incubar 2 h a RT con baja agitación en un balancín compacto manteniendo la velocidad entre 2-3 rpm.
    NOTA: El vial de anticuerpos de detección biotinilada contiene 24 μg de anticuerpo. Después de la reconstitución con 1,0 ml de diluyente de reactivo, diluir el anticuerpo de detección biotinilado en una solución de trabajo de 400 ng/ml.
  10. Repita el paso 2.
  11. Agregue 100 μL de la dilución de trabajo de estreptavidina-peroxidasa de rábano picante (HRP, consulte la Tabla de materiales) a cada pocillo. Cubra la microplaca de la luz e incube durante 20 minutos en RT.
    NOTA: La estreptavidina-HRP reactiva se concentró 40 veces. La solución de trabajo 1x de estreptavidina-HRP se hizo con diluyente reactivo.
    NOTA: Evite colocar la placa en luz directa.
  12. Repita el paso 2.
  13. Finalmente, agregue 100 μL de solución de sustrato de tetrametilbencidina (TMB, consulte la Tabla de materiales) a cada pocillo.
    NOTA: Prepare la solución TMB con un volumen igual de solución estabilizada de peróxido de hidrógeno al 30% proporcionada en el kit.
    NOTA: Prepare la solución inmediatamente antes de usarla y manténgala a temperatura ambiente.
  14. Incubar durante 30 minutos en RT en un lugar oscuro.
    NOTA: Evite colocar la placa en luz directa. No aspire la solución TMB ya que no es necesario lavarla más.
  15. Añadir 50 μL de solución de parada 1NH2SO4 para detener la reacción colorimétrica. Golpee suavemente el plato para asegurar una mezcla completa.
  16. Determine inmediatamente la absorbancia de cada pocillo utilizando un lector de microplacas ajustado a 450 nm en un espectrómetro de placas ELISA.
  17. Mida la absorbancia con un espectrómetro de placas ELISA en un modo de punto final con baja agitación durante 10 s.
  18. Promedie el valor de absorbancia de 450 nm de las muestras en blanco estándar y réstelo de otros valores de 450 nm de muestras estándar y desconocidas.
  19. Utilice la curva estándar para determinar la concentración lumica de cada muestra desconocida.
  20. Para el cálculo de la concentración lumicana, hacer un gráfico de regresión lineal utilizando los valores de absorbancia en el eje Y contra las concentraciones en pg/mL en el eje X de cada curva lumican estándar.
    1. Obtenga la ecuación de regresión lineal y el valor r para calcular la concentración lumicana.
      NOTA: La concentración de lumican se normalizó con respecto al mg de tejido extraído. Los resultados se expresan como valores de concentración relativa normalizados de lumican a mg AM (ng/ml lumican/mg AM tejido).

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Resultados

Los resultados se informan como el valor medio ± la desviación estándar (DE). Se realizaron pruebas t de Student y análisis de varianza (ANOVA). Los valores de p < 0,05 se consideraron estadísticamente significativos. El análisis estadístico se realizó utilizando software estadístico (ver Tabla de materiales).

La cantidad total de proteína en el AME se vio afectada por el tiempo y las condiciones de almacenamiento. La concentración de proteína bas...

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Discusión

En este estudio, se analizó la presencia de lumican en el AME y su correlación directa con su estabilidad bajo diferentes condiciones de almacenamiento. Curiosamente, cuando se cuantificó la concentración total de proteína en AME, la concentración de proteína aumentó después del almacenamiento. La evidencia sugiere tres mecanismos que podrían cambiar la concentración de proteínas en el almacenamiento congelado: la desnaturalización en frío, la concentración congelada de solutos y el despliegue parcial indu...

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Divulgaciones

El estudio fue financiado por el Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica de la Universidad Nacional Autónoma de México (Subvención No. PAPIIT IN203821), y Secretaría de Educación, Ciencia, Tecnología e Innovación (Subvención No. SECTEI 250/2019).

Agradecimientos

Los autores no tienen intereses financieros contrapuestos.

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
1 N H2SO4 stop solutionR&D SystemsDY994
100 μL micropipetteEppendorf
1000 μL micropipetteEppendorf
15 mm Petri dishSymlaboratorios
18 G Needle (1.2 mm x 40 mm)BD Becton Dickinson 305211
2 mL microcentrifuge tubeEppendorfZ606340
20 mL plastic syringe BD Becton Dickinson 302562
20 μL micropipetteEppendorf
20-200 μL micropipetteEppendorf
5 mL microcentrifuge tubeEppendorf30119401
96-well microplateSARSTEDT821581
Aluminum foilN/AN/A
Amniotic membraneInstituto de Oftalmologia Conde de Valenciana Amnion Bank100 mg
Balanced salt solutionBausch + LombBSS-403802
BeakerN/AN/A
BioRender BioRenderfigures design 
Compact RockerBioRad970822DDMod. 5202SD-BIO
complete, EDTA-free, Protease inhibitor
cocktail tablets		Roche11 873 580 001Protease Inhibitor
Daiggner vortex Genie 2A.Daigger & Co. , INC22220A
Dispase IIGibco17105-041
ELISA plate spectrometerThermo Labsystems 35401106Multiscan
Freezer
GraphPad Prism GraphPad Software, Incversion 9statistical analysis and graphic program 
Human lumican DuoSet ELISA kitR&D SystemsDY2846-05includes human Lumican capture antibody
Incubator Forma Scientific 3326 S/N 36481-7002
Inverted light MicroscopeOlympus 6A13921to confirm de-epithelialization  Mod.CK2
Laminar flow hoodForma Scientific 14753-567Mod.1184
Liquid nitrogenN/AN/A
MortarN/AN/A
Multi-channel pipettorEppendorf
Nitrogen TankThermo ScientificMod. Biocan 20
Paper towelsN/AN/A
Phosphate-buffered salineR&D SystemsDY006
Pierce Modified Lowry Protein Assay KitThermo Scientific23240
Plate sealersR&D SystemsDY992
Reagent diluentR&D SystemsDY9951% BSA in PBS, pH 7.2-7.4, 0.2 μm filtered
Refrigerated centrifugecenturion scientific Ltd 15877Mod. K2015R
Rubber policeman cell scraperNEST710001for mechanical de-epithelialization
Scalpel knifeBraunBB521No. 10 or 21
Streptavidin-HRP 40-fold concentrated R&D Systemspart 893975
Substrate tetramethylbenzidine (TMB) solutionR&D SystemsDY999
Toothed tweezersInvent Germany6binox 
Ultrapure waterPISA
Wash bufferR&D SystemsWA1260.05% Tween 20 in PBS, pH 7.2-7.4

Referencias

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