Cuantificación de ARN circulares mediante PCR digital de gotas

Resumen

Este protocolo describe el método detallado de PCR digital de gotas (dd-PCR) para la cuantificación precisa de los niveles de ARN circular (circRNA) en células utilizando cebadores divergentes.

Resumen

La reacción en cadena de la polimerasa digital (dd-PCR) es uno de los métodos de cuantificación más sensibles; fracciona la reacción en casi 20,000 gotas de agua en aceite, y la PCR ocurre en las gotas individuales. La dd-PCR tiene varias ventajas sobre la qPCR convencional en tiempo real, incluida una mayor precisión en la detección de objetivos de baja abundancia, la omisión de genes de referencia para la cuantificación, la eliminación de réplicas técnicas para muestras y la demostración de una alta resistencia a los inhibidores en las muestras. Recientemente, la dd-PCR se ha convertido en uno de los métodos más populares para cuantificar con precisión el ADN o ARN objetivo para el análisis y diagnóstico de la expresión génica. Los ARN circulares (circRNAs) son una gran familia de moléculas de ARN cerradas covalentemente recientemente descubiertas que carecen de extremos 5' y 3'. Se ha demostrado que regulan la expresión génica actuando como esponjas para proteínas de unión a ARN y microARN. Además, los circRNAs se secretan en los fluidos corporales, y su resistencia a las exonucleasas los hace servir como biomarcadores para el diagnóstico de enfermedades. Este artículo tiene como objetivo mostrar cómo realizar el diseño divergente de cebadores, la extracción de ARN, la síntesis de ADNc y el análisis de dd-PCR para cuantificar con precisión los niveles específicos de ARN circular (circRNA) en las células. En conclusión, demostramos la cuantificación precisa de circRNAs utilizando dd-PCR.

Introducción

Los avances recientes en las tecnologías de secuenciación de ARN y los nuevos algoritmos computacionales han descubierto un nuevo miembro de la creciente familia de ARN no codificantes, llamado ARN circular (circRNA)¹. Como su nombre indica, los circRNAs son una familia de moléculas de ARN monocatenario sin extremos libres. Están formados por empalme no canónico de cabeza a cola llamado empalme posterior, donde el sitio aceptor de empalme aguas arriba se une covalentemente con el sitio donante de empalme aguas abajo para formar un círculo de ARN estable ^1,2. Este proceso podría estar mediado por varios factores, incluyendo elementos repetitivos de Alu invertidos presentes en las aguas arriba y aguas abajo de los exones circularizados, o puede estar mediado por algunos factores de empalme o proteínas de unión a ARN (RBPs)^2,3. Los ARN circulares generados exclusivamente a partir de la secuencia exónica o intrónica se clasifican como circARN exónicos y ARN intrónicos circulares o ci-ARN, mientras que algunos circARN exónicos retienen el intrón y se denominan circARN exón-intrón (EIcircRNAs)^3,4. Las funciones de los circRNAs son multifacéticas, incluyendo la esponja de miRNA y/o RBP, la regulación de la transcripción y la regulación de la función celular traduciendo en péptidos 3,5,6,7. Varios relatos han destacado la importancia de los circRNAs en diversas enfermedades y procesos fisiológicos⁸. Además, los patrones de expresión específicos del tejido y la resistencia a la digestión de la exonucleasa lo convierten en un biomarcador funcional para el diagnóstico de enfermedades y también puede ser utilizado como una diana terapéutica adecuada⁸. Teniendo en cuenta su importancia en la regulación de la salud y las enfermedades, la cuantificación precisa de la expresión de circRNA es la necesidad del momento.

Se han desarrollado varios métodos bioquímicos para cuantificar circRNAs en muestras biológicas⁹. Uno de los métodos más convenientes y ampliamente aceptados para la cuantificación de circRNA es la transcripción inversa seguida de la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (RT-qPCR) utilizando pares de cebadores divergentes¹⁰. Sin embargo, la mayoría de los circRNAs están en baja abundancia en comparación con los mRNAs lineales, lo que hace que sea difícil cuantificarlos¹¹. Para superar este problema, buscamos usar PCR digital de gotas (dd-PCR) para cuantificar el número de circRNAs en una muestra dada con precisión. La dd-PCR es una tecnología avanzada de PCR que sigue el principio de microfluídica; genera múltiples gotitas acuosas en aceite, y la PCR ocurre en cada gota como una reacción individual¹². La reacción ocurre en gotitas individuales y se analiza utilizando un lector de gotas, que da el número de gotitas positivas o negativas para el gen de interés¹². Es la técnica más sensible para cuantificar con precisión un gen de interés, incluso si solo hay una copia única en una muestra determinada. La disminución de la sensibilidad hacia los inhibidores, una mejor precisión y la omisión del gen de referencia para la cuantificación lo hacen más ventajoso que la qPCR convencional^13,14,15. Ha sido ampliamente utilizado como herramienta de investigación y diagnóstico para la cuantificación absoluta de un gen de interés^16,17. Aquí, describimos el protocolo detallado de dd-PCR para la cuantificación de circRNA en la diferenciación de miotubos C2C12 de ratón y mioblastos C2C12 de ratón proliferantes utilizando cebadores divergentes.

Protocolo

El ARN es sensible a las RNasas; por lo tanto, todos los reactivos, instrumentos y espacios de trabajo deben estar libres de RNasa y manejarse con cuidado.

1. Diseño divergente del cebador para circRNA (ver Figura 1)

1. Recupere la secuencia madura de los datos de anotación de circRNA utilizando BEDTools o desde el navegador del genoma UCSC uniendo la secuencia de exón/intrón presente entre las coordenadas de unión del empalme posterior^18,19.
2. Preparar una secuencia de plantilla de PCR de 200 nucleótidos de longitud uniendo los últimos 100 nucleótidos de la longitud total de la secuencia de circRNA a los primeros 100 nucleótidos de la secuencia de circRNA¹⁰.
   NOTA: Si la longitud del circRNA es inferior a 200 nucleótidos, divídala en dos mitades iguales y una los nucleótidos desde la última mitad hasta el comienzo de la primera mitad.
3. Utilice la secuencia de plantilla anterior para el diseño de imprimación utilizando la herramienta web Primer3 y estableciendo una longitud de producto de PCR que oscile entre 120 y 180 nucleótidos en longitud²⁰.
4. Utilice la configuración predeterminada de Primer3 para otros parámetros como Tm y longitud de imprimación. Las secuencias de cebadores para circBnc2 se enumeran en la Tabla 1.
5. Ordene las secuencias de cebadores divergentes para la síntesis de cualquier compañía sintetizadora de oligo.

2. Aislamiento de ARN

NOTA: Aísle el ARN total de las células C2C12 de ratón utilizando cualquier kit disponible comercialmente o un método interno de aislamiento de ARN. El método interno de aislamiento de ARN utilizado aquí ha sido descrito previamente²¹. Las perlas de sílice magnética se preparan en el laboratorio utilizando el protocolo²² previamente publicado. Estas perlas magnéticas también se pueden adquirir de varios proveedores.

1. Tome un plato de 10 cm que contenga aproximadamente 5 x 10⁶ células de mioblastos C2C12 proliferantes y un miotubo C2C12 diferenciado de 4 días para el aislamiento de ARN.
2. Lave las células con 10 ml de 1x PBS tres veces y deseche el PBS con una pipeta.
3. Raspa las células en 1 ml de 1x PBS con un raspador celular, centrifugarlas a 4 °C durante 5 min a 750 x g y desechar el PBS con una pipeta.
4. Añadir 1 mL de reactivo de aislamiento de ARN (RIR) y lisar las células mediante un pipeteo vigoroso²¹.
5. Añadir 200 μL (1/5 del volumen de RIR) de cloroformo y vórtice durante 15 s. Centrifugar el tubo a 4 °C durante 10 min a 12.000 x g.
6. Tome 400 μL de la capa acuosa superior, cárguelo en una columna de sílice y centrifugar durante 1 minuto a 12,000 x g a temperatura ambiente. Lleve el flujo a un tubo nuevo y agregue 600 μL de etanol al 100%.
7. Añadir 20 μL de perlas magnéticas de sílice y colocar el tubo en un termomezclador ajustado a 25 °C y 1.200 rpm durante 5 min.
   NOTA: El volumen de la perla puede aumentar o disminuir dependiendo del número inicial de células tomadas para la lisis. Las perlas de sílice magnética se pueden adquirir de proveedores comerciales.
8. Coloque el tubo en un soporte magnético durante 30 s o hasta que la solución se aclare. Deseche el sobrenadante con cuidado con una pipeta.
9. Resuspender las perlas de sílice magnética en un tampón de lavado de 500 μL que contenga 90% de etanol. Coloque el tubo en el soporte magnético durante 30 s. Gire el tubo dos veces en el soporte magnético para lavar las perlas. Deje que las perlas se asienten hacia el imán y deseche el tampón con una pipeta.
10. Repita el paso 2.9 dos veces. Después del lavado, gire brevemente el tubo y vuelva a colocarlo en el soporte magnético durante 30 s. Deseche el tampón de lavado restante. Secar al aire el tubo a 50 °C durante 3 minutos en un termomezclador, manteniendo la tapa abierta.
11. Añadir 20 μL de agua libre de nucleasas y volver a suspender las perlas.
    NOTA: El volumen de elución de ARN se puede disminuir hasta 10 μL para aumentar la concentración de ARN.
12. Coloque los tubos durante 2-3 min a temperatura ambiente. Vuelva a colocar el tubo en el soporte magnético y déjelo reposar durante 30 s. Recoja el ARN disuelto en un nuevo tubo para la evaluación de la cantidad y la calidad utilizando un espectrofotómetro.
    NOTA: El ARN se puede almacenar a -20 °C o -80 °C para su almacenamiento a largo plazo. Para obtener un resultado óptimo, se recomienda proceder con el paso de síntesis de ADNc al día siguiente.

3. Síntesis de ADNc

1. Mida la concentración de ARN usando un espectrofotómetro y tome 1 μg de ARN para la síntesis de ADNc.
2. Mezcle 1 μg de ARN total con 1 μL de mezcla de dNTP (10 mM de dATP, dTTP, dGTP y dCTP), 4 μL de tampón 5x de transcriptasa inversa (RT), 2 μL de cebador aleatorio RT 10x, 0.25 μL de enzima transcriptasa inversa (200 U/μL) y 0.5 μL de inhibidor de RNasa (40 U/μL), y enrasar el volumen hasta 20 μL usando agua libre de nucleasas.
   NOTA: El volumen de la enzima transcriptasa inversa puede alterarse dependiendo de la concentración inicial de ARN tomada para la síntesis de ADNc.
3. Golpee el tubo para mezclar la reacción y gire brevemente. Colocar el tubo a 25 °C durante 10 min seguido de a 50 °C durante 1 h.
4. Para inactivar la enzima, coloque el tubo a 85 °C durante 5 min.
5. Enfríe el tubo con hielo durante 2 minutos y agregue 480 μL de agua libre de nucleasas al tubo para que la concentración de ADNc sea de 2 ng / μL.
   NOTA: El ADNc puede almacenarse a -20 °C o utilizarse inmediatamente para el análisis de dd-PCR.

4. Flujo de trabajo de PCR digital de gotas (dd-PCR)

NOTA: El flujo de trabajo de dd-PCR implica varios pasos, comenzando desde la preparación de la muestra, seguido de la generación de gotas, la amplificación por PCR, el conteo de gotas y el análisis de datos. Cada paso es crucial para la generación precisa de datos, ya que la dd-PCR implica la cuantificación absoluta de los productos y no necesita ninguna curva estándar. Por lo tanto, cada uno de los diferentes pasos de dd-PCR se ha descrito a continuación.

1. Preparación de la reacción dd-PCR.
   1. Configure la reacción de PCR de 22 μL en tubos o tiras de PCR de 0,2 ml junto con un tubo de control negativo y tubos NTC (control sin plantilla).
      NOTA: Cada par de cebadores divergentes diferentes para la detección de diferentes circRNAs debe tener una reacción NTC junto con muestras de prueba.
   2. Agregue 11 μL de dd-PCR master-mix (por ejemplo, EvaGreen Supermix) y 11 μL de agua libre de nucleasas para configurar el tubo de reacción de control negativo.
      NOTA: Descongele la mezcla maestra dd-PCR a temperatura ambiente seguida de un breve vórtice para formar una mezcla homogénea. Use la misma agua libre de nucleasa para configurar el tubo de reacción de control negativo y los tubos NTC que se usaron para diluir el ADNc.
   3. Agregue 11 μL de mezcla maestra dd-PCR, 5.5 μL de mezcla de cebador directo e inverso específica de circRNA de concentración de 1 μM y 5.5 μL de agua libre de nucleasas para configurar los tubos de reacción NTC.
      NOTA: Diluir los cebadores divergentes circulares específicos de ARN hacia adelante y hacia atrás de 100 μM y mezclar para preparar una concentración de trabajo de 1 μM de mezcla de cebador circRNA directo e inverso; por lo tanto, la concentración final del cebador es de 250 nM en la reacción de 22 μL.
   4. Añadir 11 μL de mezcla maestra dd-PCR, 5,5 μL de mezcla de cebador directo e inverso específica de circRNA de concentración de 1 μM y 5,5 μL de ADNc (2 ng/μL) para configurar los tubos de reacción de prueba.
   5. Vórtice seguido minuciosamente por centrifugar brevemente todos los tubos de reacción para obtener una mezcla de reacción homogénea en la parte inferior de los tubos.
2. Generación de gotas.
   1. Transfiera los 20 μL de mezcla de PCR de tubos de PCR de 0,2 ml a los pocillos de muestra del cartucho generador de gotas.
   2. Agregue 70 μL de aceite de generación de gotas a los pocillos de petróleo del cartucho generador de gotas con cuidado utilizando una pipeta multicanal.
      NOTA: Incubar el aceite de generación de gotas a temperatura ambiente durante 15 minutos antes de usarlo.
   3. Cubra el cartucho del generador de gotas con la junta de goma y colóquelo en la máquina generadora de gotas para obtener la mezcla de gotas de muestra y aceite, generada en los pocillos de gotas del cartucho.
3. Amplificación por PCR.
   1. Transfiera 40 μL de la mezcla de gotas de aceite de muestra de los pocillos de gotas del cartucho generador de gotas a una placa de PCR de 96 pocillos utilizando una pipeta multicanal.
      NOTA: Transfiera cuidadosamente la mezcla de gotas de aceite de muestra mientras hace un ángulo a los pocillos a través de las puntas de la pipeta multicanal para evitar romper las gotas mientras las transfiere a la placa dd-PCR de 96 pocillos.
   2. Selle la placa de PCR de 96 pocillos con el sellador de papel de aluminio, colóquela en el bloque de la máquina selladora de placas precalentado a 80 ° C y haga clic en el sello para sellar la placa de PCR.
   3. Ahora, coloque la placa en el termociclador dd-PCR y configure el programa como se menciona en la Tabla 2 con la temperatura de la tapa establecida en 105 ° C y una velocidad de rampa de 2 ° C / s.
4. Conteo de gotas.
   1. Una vez finalizada la PCR, coloque la placa en la máquina contadora de gotas dd-PCR con el soporte de la placa en la posición correcta para contar las gotas.
   2. Abra el software de análisis de gotas y configure la ejecución proporcionando información de la muestra.
   3. Haga clic en la opción de configuración. Luego, haga clic en la opción de plantilla para abrir una nueva plantilla .
   4. Defina cada pocillo poniendo los detalles del experimento, como el nombre de la muestra (cDNA utilizado o control negativo o NTC), el nombre del objetivo (nombre del cebador circRNA) y el tipo (desconocido), y el tipo de experimento como ABS (cuantificación absoluta) y Supermix (dd-PCR EvaGreen Supermix) utilizado, etc.
   5. Finalmente, guarde la plantilla e inicie la ejecución haciendo clic en la opción ejecutar y seleccione contar por fila o columna. Permita que la máquina complete el conteo de gotas, que toma aproximadamente 1 minuto / pozo.
   6. Haga clic en el botón Analizar para analizar los datos después de completar la lectura de gotas.
   7. Haga clic en el botón Amplitud 1D para ver las gotas positivas y negativas
   8. Para separar las gotas positivas de las negativas, coloque una línea de umbral común para todas las muestras con el mismo objetivo.
      NOTA: Las gotitas totales en cada muestra deben ser superiores a 10.000 para ser consideradas para la cuantificación absoluta. El NTC no debe mostrar recuentos positivos de gotas. La presencia de gotitas positivas en el NTC indica contaminación de los reactivos o amplificación de los dímeros de cebador. Es difícil averiguar si las gotas positivas tienen dímeros de imprimación o productos no específicos en NTC. Se recomienda comprobar los cebadores y evitar cualquier contaminación de los reactivos como práctica general para cualquier PCR, incluida la dd-PCR.
   9. Haga clic en el botón Exportar para exportar los datos de los recuentos de circRNA como un archivo .csv. Los datos exportados muestran el número de circRNAs presentes en cada muestra.
   10. Calcule manualmente el número de circRNAs en cada muestra por nanogramo de ARN considerando la cantidad total de ADNc utilizada en cada reacción.

Resultados

El número absoluto de circRNAs en cada muestra se puede derivar de los datos de dd-PCR exportados. El análisis cuantitativo de PCR en tiempo real sugirió la expresión diferencial de circBnc2 en los miotubos C2C12 diferenciados (datos no mostrados). Aquí, queríamos verificar el número de copias absolutas de circBnc2 en mioblastos y miotubos C2C12 en proliferación. Dado que la expresión de circBnc2 se compara en dos condiciones, es realmente importante procesar todas las muestras para el...

Discusión

La investigación de CircRNA ha crecido en la última década con el descubrimiento de tecnologías de secuenciación de alto rendimiento. Como resultado, se ha considerado una molécula potencial para futuras terapias de ARN. Además, se sabe que actúa como biomarcador en varias enfermedades, incluyendo cáncer y enfermedades cardiovasculares ^4,8. Sin embargo, la identificación del circRNA es complicada debido a su baja abundancia y a que solo tiene una secuen...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 ml microcentifuge tube	Tarson	500010
0.2 ml tube strips with cap	Tarson	610020, 510073
Filter Tips	Tarson	528104
DNase/RNase-Free Distilled Water	Thermo Fisher Scientific	10977023
Phosphate-buffered saline (PBS)	Sigma	P4417
Cell scrapper	HiMedia	TCP223
Chloroform	SRL	96764
DNA diluent	HiMedia	MB228
Random primers	Thermo Fisher Scientific	48190011
dNTP set	Thermo Fisher Scientific	R0181
Murine RNase inhibitor	NEB	M0314S
Maxima reverse transcriptase	Thermo Fisher Scientific	EP0743
QX200 dd-PCR Evagreen Supermix	Bio-Rad	1864033
Droplet generation oil for Evagreen	Bio-Rad	1864006
PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable	Bio-Rad	1814040
DG8 Cartridges and Gaskets	Bio-Rad	1864007
DG8 Cartridge holder	Bio-Rad	1863051
QX200 Droplet Generator	Bio-Rad	1864002
ddPCR 96-Well Plates	Bio-Rad	12001925
PX1 PCR Plate Sealer	Bio-Rad	1814000
C1000 Touch Thermal Cycler with 96–Deep Well Reaction Module	Bio-Rad	1851197
QX200 Droplet Reader	Bio-Rad	1864003
Quantasoft Software	Bio-Rad	1864011
Silica column	Umbrella Life Science	38220090
UCSC Genome Browser		https://genome.ucsc.edu/
Primer 3		https://primer3.ut.ee/